Contaminação bacteriana de hemocomponentes Estado atual
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- João Gorjão Carvalho
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1 Contaminação bacteriana de hemocomponentes Estado atual Eugênia Maria Amorim Ubiali Médica hematologista e hemoterapeuta Mestre em Ciências Médicas pela Fac. Medicina de Ribeirão Preto-USP Coordenadora Médica do Hemocentro de Ribeirão Preto
2 Declaração de Conflito de Interesse Declaro ausência de conflito de interesses para esta apresentação
3 Contaminação bacteriana de hc Risco infeccioso atual mais importante da transfusão cuja prevalência real pode ser maior que a relatada: Pode não se traduzir em eventos clínicos, ser mascarada por prémedicação, antibióticos ou pelo estado imunossuprimido do receptor, ser confundida com a doença de base ou com RFNH. CP estão associados a maior risco de sepse e fatalidades relacionadas a sepse do que outros hemocomponentes. Dullius et al encontraram 36/837 (4,3%) CPHSP contaminados por Staphylococcus coagulase negativa. 3
4 Contaminação bacteriana de hc Apesar de várias intervenções já feitas, sepse e fatalidades por hemocomponentes contaminados continuam a ocorrer. Vigilância passiva: 1/100mil sepse e 1/210mil-1M fatalidade em transfusões de CPAf. 1/25mil sepse e 1/253mil fatalidade em transfusões pool CP pós-est. Relato ativo em um serviço mostrou taxa de reações sépticas 10 vezes maior que a vigilância passiva (1/6.400 X 1/66.000). Dados mostram que 95% das reações sépticas por CP e 100% das fatalidades associadas ocorrem nas transfusões de CP no 4 o (42%) e 5 o (53%) dia de estocagem (BPAC, September ). 4
5 Fontes de contaminação bacteriana Flora cutânea do doador é a fonte mais comum (>CP). Desinfecção incompleta da pele do doador, punção em cicatrizes de punções anteriores e rolha de pele liberada na punção. Bacteremia assintomática no doador. Y. enterocolitica, Salmonella (entérica), S. bovis (GE); S. pyogenes (IVAS); Serratia liquefascens (feridas cutâneas); Staphylococus, Salmonella choleraeuis (osteomielite); S. viridans, Serratia, Staphylococus. sp; S. pneumoniae (pulmão). Introdução durante o processamento. Bolsa, anticoagulante, BM, sol. de aférese e lavagem, luvas; na confecção do pool de CP; abertura de lacres/tubos, microfuros. 5
6 Bactérias contaminantes CP CH Pl cong. Crio G+ pele G- pele G- criofílicos Banho-maria S. epidermidis, S. aureus, Corynebacterium sp, Bacillus cereus, estreptococos, Propionibacterium sp Bacillus sp. Outros: P. aeruginosa, E. coli, K. pneumoniae, Salmonella sp, Enterobacter sp, etc Y. enterocolitica, Serratia sp, Pseudomonas sp Infrequente; geralmente, CH >21d. P. aeruginosa e Burkholderia cepacia Quase zero CPH-SP G+ pele S. epidermidis 6
7 Modelos de crescimento bacteriano Tempo de geração da maioria das bactérias a 22 o C é de 1-4h, em média 2 h para as mais prevalentes. Podem se tornar inviáveis e morrer. Entram em crescimento logarítmico após uma curta fase lag. Ficam em baixa concentração em fase lag estendida antes de entrar em crescimento logarítmico. Persistem em baixa concentração durante a estocagem do CP. Avaliação/validação de métodos de triagem de bactérias implica uso de cepas capazes de proliferar em componentes. Repositório na OMS de 4 cepas relevantes para transfusão (será ampliado). Establishment of the first International Repository for Transfusion-Relevant Bacteria Reference Strains. Vox Sang 2012;102:
8 Para reduzir a contaminação de hc Medidas gerais: indicação criteriosa das transfusões e redução de gatilhos transfusionais. Combinação de estratégias simultâneas para: Limitar a entrada de bactérias. Detectar sua presença. Reduzir seu número e inibir seu crescimento. 8
9 Portaria MS 158/2016: Art º A avaliação da contaminação microbiológica dos componentes sanguíneos celulares será realizada utilizando-se amostragem igual ou superior a 1% da produção ou 10 U/mês, o que for maior. 8º Pelo alto risco de contaminação microbiológica dos CP pela sua condição de armazenamento, recomenda-se realização de avaliação de contaminação microbiológica em 100% desta produção... AABB Standard The blood bank or transfusion service shall have methods to limit and to detect or inactivate bacteria in all platelet components. Effective date of March 1, Interim AABB Standard Detection methods shall either be approved by the FDA or validated to provide sensitivity equivalent to FDA-approved methods. Effective date of January 31,
10 Limitar a entrada de bactérias Seleção cuidadosa de doadores e temperatura: insuficientes para detectar bacteremia assintomática. Coleta asséptica de hemocomponentes: Material estéril e de uso único. Escolha do local da punção, antissepsia efetiva e técnica cuidadosa de flebotomia. Desvio dos primeiros 15-40mL da coleta para a amostra reduz a contaminação bacteriana vinda da pele em cerca de 50%. (De Korte et al, 2006). O uso de CPAf parece reduzir proporcionalmente a contaminação bacteriana em relação ao CPST. 10
11 Limitar a entrada de bactérias Cuidados no processamento, modificação, estocagem, transporte e infusão de hemocomponentes: Temperatura adequada e cuidados no processamento, armazenamento, modificação e transporte de hemcomponentes. Cuidado com seladores, conexões estéreis, soluções e dispositivos da transfusão, limitação da validade do CP. Filtros leucorredutores reduzem o inóculo, mas as bactérias restantes proliferam e podem provocar sepse no receptor. Em estudo o armazenamento de CP em geladeira e sua criopreservação. 11
12 Detectar a presença de bactérias Dificuldades: curta validade do CP; momento/tamanho da amostra; amplo espectro e modelo de crescimento das bactérias e inóculo inicial de 0,1-0,25 UFC/mL ( bactérias/bolsa). Inspeção visual: CH (alteração da cor, hemólise, coágulos, partículas brancas) e CP (bolhas, perda do swirling). Testes para detectar bactérias: Cultura Métodos rápidos de detecção 12
13 Métodos de cultura Método Incubação Sensibil. UFC/mL Resultado BacT/ALERT Automatizado; inoculação em sistema aberto de 4-10mL; frascos de cultura aer/anaer; detecção colorimétrica de CO h p/ liberar CP; recomenda-se manter 7d 1-10 Negativo até a data Bactec Automatizado; inoculação em sistema aberto de 4-10mL; frascos de cultura aer/anaer; detecção fluorimétrica de CO 2 24h para liberar CP; recomenda-se manter 7d 1-10 Negativo até a data VersaTrek Automatizado; amostra 4mL; detecção de alteração de pressão no frasco aer/anaer pelo consumo/produção de gás 24h; sugere-se manter por 5d <20 Negativo até a data Pall ebds Automatizado, inoculação em sistema fechado de 2-3mL em bolsa; detecção eletroquímica de consumo O h em agitador horizontal Transfus Med Hemother 2014;41:19-27; Journal of Clinical Microbiology, 2008, 48(10), Único: positivo ou negativo 13
14 Uso dos testes de cultura Em amostra precoce: 24h após coleta e 18-24h de incubação. Negativo até a data: liberar o componente e manter incubação. Positivo: recolher produtos; segregar/cultivar co-componentes; Gram e identificação da bactéria; retrovigilância dos produtos transfundidos. Problemas: falsos negativos (inóculo inicial é pequeno/cinética de crescimento das bactérias); detecção de bactérias sem relevância transfusional e de bactérias que morrem na estocagem. Volume da amostra: ver orientações do fabricante. Volumes maiores aumentam a sensibilidade, falsos positivos e consumo do CP; 8mL em frasco aer tem sensibilidade razoável p/ maioria das bactérias relevantes. Cultura modificada em amostra tardia (>3d) para extensão da validade do CP (Vox Sang 2011;101: ). 14
15 BactiFlow 16S rdna real-time PCR PGD BacTx Métodos rápidos de detecção direta de bactérias Método Marcação fluorescente de células viáveis pela atividade da esterase e identificação de bactérias vivas por citometria em 5-10mL RT-PCR de sequências conservadas nas regiões 16S/23S rdna de bactérias em 1-2mL. Há falta de reagentes livres de DNA de bactérias,detecção de bactérias mortas, perda de sensibilidade nos processos de descontaminação e perda de espécies pelo desenho dos primers Imunoensaio de fluxo lateral simples, para aer e anaer, Gram +/- em 600µL de amostra processsada e posta em dispositivo impregnado por Ac contra Ag bacterianos que não migra/migra para G+ ou G-. Interpretação subjetiva e falsos + Detecção colorimétrica de peptidoglican da parede celular de bactérias aer/anaer, Gram +/-, selvagens/cultivadas, em 1 ml Sensibilidade UFC/mL Trabalho/Re sultado min/1h min/4h G G , alguns até min/1,5h h Transfus Med Hemother 2014;41:19-27; Journal of Clinical Microbiology, 2008, 48(10),
16 Uso dos testes rápidos de detecção direta A maioria utiliza tecnologia e pessoal especializados. Passíveis de automação. Seus limites inferiores de detecção não os tornam testes de esterilidade. Apropriados para uso na liberação do CP para transfusão ou à beira do leito, minimizando a limitação da quantidade inicial baixa bactérias e do crescimento lento de algumas bactérias. 16
17 Agregação de plaquetas Medida não invasiva de ph Medida de oxigênio Métodos rápidos de detecção indireta de bactérias em amostra contínua Método Agregação plaquetária está reduzida em CP contaminado representando o momento antes da medição devido ao tempo entre atingir número elevado de bactérias e induzir efeito detectável na agregação. Sua medida imediatamente antes da transfusão melhoraria a segurança microbiológica e a eficiência da transfusão. Bolsa de CP com sensor integrado de monitoramento in-line, contínuo e em sistema fechado possibilita, pela medida de fluorescência por leitor BCSI ph SAFE, o cálculo do ph. Medida isolada de ph tem baixa sensibilidade e devido ao efeito da recuperação do ph durante a estocagem, monitorar o ph pode mostrar contaminação bacteriana pela queda e recuperação do ph. Medida contínua da concentração de O 2 do CP, em sistema fechado, por sondas com registro a cada 20 seg. Produtos positivos para bactérias mostraram O 2 <10% e negativos >30%. Transfus Med Hemother 2014;41:19-27; Journal of Clinical Microbiology, 2008, 48(10),
18 Uso dos testes rápidos de detecção indireta Estes testes trazem conceitos metodológicos adaptáveis. Há necessidade de estudos para avaliar sua aplicabilidade na triagem de contaminação bacteriana e seu desempenho em relação a diferentes cepas. A abordagem de monitoramento contínuo não invasivo evita erros decorrentes da análise de amostra inicial. 18
19 FDA setembro 2012 Estudo mostrou que teste rápido realizado no dia da transfusão foi capaz de detectar unidades contaminadas não detectadas pela cultura precoce (Transfusion 51; ). 95% das reações sépticas e 100% das fatalidades associadas a transfusão de CP ocorrem com CP no 4 o ou 5 o dia de estocagem. O FDA (Blood Products Advisory Comittee) recomenda, a partir de setembro de 2012, testar os CP com 4 e 5 dias de estocagem por um teste rápido até 24h antes da transfusão, mesmo se a cultura precoce realizada com 24h (teste 1º) foi negativa. BPAC 104 th Meeting, September 20, 2012 Topic III 19
20 FDA - Draft Guidance for Industry Uso dos testes no CP Teste primário: é o teste inicial/primeiro, feito precocemente no armazenamento utilizando um dispositivo de cultura ou outro método apropriado. Teste secundário: teste adicional para detectar contaminação bacteriana em unidade que se mostrou negativa no teste primário. Usualmente feito tardiamente no armazenamento do CP a fim de detectar contaminação bacteriana não revelada pelo teste primário. Pode ser feito com teste de cultura ou com um teste rápido de detecção de bactéria. Bacterial risk control strategies for blood collection establishments and transfusion services to enhance the safety and availability of platelets for transfusion - Draft Guidance for industry March
21 FDA - Draft Guidance for Industry Recomendações gerais Cultura: Maior volume de amostra permitido pelo método Amostra colhida 24h após a coleta do CP (o mais novo, nos pools) Inoculação, pelo menos, em frasco aeróbico Incubação consistente com fabricante Avisar culturas positivas depois da liberação do componente IP: métodos aprovados elo FDA Testes rápidos de detecção de bactérias: aprovados pelo FDA (ND) Bacterial risk control strategies for blood collection establishments and transfusion services to enhance the safety and availability of platelets for transfusion - Draft Guidance for industry March
22 FDA - Draft Guidance for Industry Recomendações para o Serviço Produtor CPAf Pool de CP pré-estocagem CPST Inativação de patógenos OU Cultura Cultura OU Inativação de patógenos Cultura OU Teste rápido de detecção de bactéria OU Inativação de patógenos (ND) Bacterial risk control strategies for blood collection establishments and transfusion services to enhance the safety and 22 availability of platelets for transfusion - Draft Guidance for industry March 2016
23 FDA - Draft Guidance for Industry Recomendações para Serviço de Transfusão CPAf patógeno-reduzida CPAf e pool de CP préestocagem já testado por cultura Pool de CP pós-estocagem não testado CPST não testado Sem necessidade de medidas posteriores Fazer teste secundário Teste rápido no dia da transfusão nos CP de 4 ou 5d OU Cultura nos CP de 4d: incubação definida pelo fabricante ou 12h se tiver medidas de avisar resultados positivos tardios; se precisar liberar antes, associar teste rápido Fazer teste rápido dentro de 4h antes da transfusão Cultura OU Teste rápido de detecção de bactéria (ND) Bacterial risk control strategies for blood collection establishments and transfusion services to enhance the safety and 23 availability of platelets for transfusion - Draft Guidance for industry March 2016
24 Reduzir /inibir crescimento de bactérias Limitação da validade do CP. Inativação de patógenos mantendo a funcionalidade do produto. Sistemas de IP para CP são usados em alguns países da Europa, dispensando a cultura microbiológica de CP após a produção e o teste para detecção de bactérias na liberação para transfusão. Local Período Transfusão Sepse/Mortes França (CP 5d) Suíca (CP 7d) CP Intercept 0/ CP convencionais 47/ CP Intercept 0/ CP convencionais 16/3 Total CP Intercept 0/0 Total CP convencionais 63/
25 Inativação de bactérias nos CP Método Psoralen + UVA (INTERCEPT) Riboflavina + UVA (MIRASOL) UVC (THERAFLEX) Características Deve ser realizado nas primeiras 24 horas Amplo espectro de bactéria G+/G- e espiroquetas Não inativa esporos, Bacilus cereus foi o menos sensível no teste em painel Eficaz contra bactérias Parece não inativar esporos Uso em muitos países (± transf. CP), seguro, sem efeitos adversos sérios e/ou sangramento anormal ou aumento de uso de CP Parece seguro e efetivo contra muitas bactérias 25
26 Extensão da validade do CP Europa: países, como Dinamarca, Irlanda, Holanda e RU estenderam para 6,5-7d a partir do uso de métodos de cultura e IP. FDA - Draft Guidance for Industry: até 7d - CPAf submetido a teste bacteriológico primário OU a IP após a coleta, coletado em bolsa de conservação para 7d aprovada e rotulada com exigência de teste adicional de detecção de bactéria em cada produto (ND) que pode ser: Teste rápido adicional liberado pelo FDA ( safety measure ) permite a extensão da validade por 24h da hora do teste, não excedendo 7d da coleta do CPAf LR. Cultura adicional ( safety measure ND) permite validade de 6 ou 7d, se a cultura for feita no 4º ou 5º dia, respectivamente. Bacterial risk control strategies for blood collection establishments and transfusion services to enhance the safety and 26 availability of platelets for transfusion - Draft Guidance for industry March 2016
27 Conclusões A contaminação bacteriana de hemocomponentes é ainda um desafio na medicina transfusional, sendo os CP e as preparações de MO os componentes de maior risco. Os sinais e sintomas clínicos da transfusão de hemocomponente contaminado costumam ser graves, mas podem ser leves, inexistentes, mascarados por pré-medicação ou doença de base. As complicações da transfusão de hemocomponentes contaminados podem ser graves e até fatais. Os clínicos precisam estar orientados que, apesar das medidas adotadas e dos testes realizados para detecção de bactérias nos CP, permanece risco potencial de reações transfusionais sépticas. 27
28 Conclusões A possibilidade de contaminação bacteriana deve ser pensada, particularmente na investigação de RFNH por transfusão de CP. Têm sido adotadas múltiplas estratégias para minimizar os riscos da contaminação bacteriana dos hemocomponentes. Estas intervenções foram efetivas na redução do risco da contaminação bacteriana de CP, mas não eliminaram o risco; sepse e mortes por sepse pós-transfusão continuam a ocorrer. São muito importantes as medidas adotadas pelo SH quando da detecção de contaminação bacteriana em hemocomponente ainda não transfundido e, em especial, se já transfundido. 28
29 Conclusões Os testes usados para detecção de bactérias nos componentes têm limitações (resultados falsos negativos). A proposta atual combina amostra tardia e um bom método rápido de detecção antes da liberação para transfusão ou testes de detecção de bactérias em dois momentos na estocagem do CP. A IP tem sido usada em alguns países da Europa com excelentes resultados (0/0 sepse/fatalidades) dispensando os testes para detecção de bactérias em CP. A IP e os testes de detecção de bactérias, realizados tardiamente ou em dois momentos na estocagem do CP, são as estratégias propostas para permitir a extensão de sua validade até 7d. 29
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