RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO. Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho):

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA Período : 08/2014 a 07/2015 ( ) PARCIAL (x ) FINAL RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho): ESTRATÉGIA DE IMPLANTAÇÃO DE UM SERVIÇO PARA A INVESTIGAÇÃO CLÍNICA E LABORATORIAL DE DOENÇAS METABÓLICAS HEREDITÁRIAS E NEURODEGENERATIVAS NA REGIÃO NORTE DO BRASIL Nome do Orientador: LUIZ CARLOS SANTANA DA SILVA Titulação do Orientador: DOUTOR Faculdade: BIOMEDICINA Instituto/Núcleo: INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Laboratório: LABORATÓRIO DE ERROS INATOS DO METABOLISMO Título do Plano de Trabalho: ANÁLISE DE MARCADORES HAPLOTÍPICOS NO GENE DA FENILALANINA HIDROXILASE EM PACIENTES FENILCETONÚRICOS DO ESTADO DO PARÁ. 1. ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Nome do Bolsista: LARISSA MENDES PEREIRA Tipo de Bolsa: ( x ) PIBIC/ CNPq

2 1 - INTRODUÇÃO As hiperfenilalaninemias (HPA) representam distúrbios metabólicos causados por mutações no gene da enzima hepática fenilalanina hidroxilase (PAH) ou alterações moleculares nos genes que codificam as enzimas envolvidas no metabolismo do cofator enzimático tetrahidrobiopterina (BH4). A fenilcetonúria (PKU) consiste em uma doença autossômica recessiva resultante da deficiência de PAH. Esta deficiência enzimática provoca um bloqueio na rota de degradação do aminoácido Phe, resultando em um acúmulo deste aminoácido nos tecidos e no sangue. Esta aminoacidopatia pode ser diagnosticada logo após o nascimento da criança, através de programas de triagem neonatal e o tratamento (dieta pobre em Phe) precoce e adequado, evita o estabelecimento de disfunções cerebrais. A incidência da PKU apresenta variação em diversas populações e regiões do mundo. No Brasil, a estimativa da PKU varia entre 1: e A PKU é acompanhada por uma ampla variedade de características clínicas, bioquímicas e moleculares. O fenótipo HPA pode variar desde formas graves (PKU clássica), caracterizada pela presença de deficiência mental, na ausência de uma dieta adequada, até formas moderadas e leves, incluindo uma condição clínica conhecida como HPA não-pku, geralmente benigna e que permite um desenvolvimento cognitivo normal, na ausência da restrição dietética de Phe. Esta heterogeneidade fenotípica pode estar associada ao grande número de mutações patogênicas no gene que codifica a PAH. O gene da PAH está localizado na região q22-q24.1 do cromossomo 12, abrangendo 90 kb de DNA genômico e sendo constituído por 13 éxons. De acordo com o Banco de Dados do Consórcio de Análise de Mutações no gene da PAH (PAHdb), mais de 550 alterações moleculares já foram identificadas no gene PAH. A elevada heterogeneidade molecular pode estar associada com o amplo espectro clínico e bioquímico observado em pacientes com PKU JUSTIFICATIVA: A distribuição e a frequência relativa das mutações que afetam a PAH, assim como a associação destas a determinados haplótipos, já foram descritas para várias populações, mostrando diferenças interpopulacionais marcantes. A análise mutacional na PKU torna-se importante pela possibilidade de associação entre o genótipo e fenótipo bioquímico e clínico da PKU. Estudos de expressão in vitro têm demonstrado que cada mutação no gene da PAH pode apresentar efeitos diferentes no comportamento cinético e/ou na estabilidade estrutural das proteínas. Estes estudos permitem avaliar o efeito de determinadas mutações no fenótipo bioquímico in vitro, a partir dos valores da atividade residual prevista (ARP) para PAH mutante. Correlações significativas foram demonstradas entre os resultados de estudos de expressão in vitro e os parâmetros bioquímicos e clínicos utilizados para definir o fenótipo PKU. Entretanto, os sistemas de expressão não podem fornecer informações definitivas sobre os efeitos das mutações associadas à PKU e seu significado in vivo. No Brasil, as bases moleculares da HPA por deficiência de PAH ainda não estão totalmente esclarecidas, pois apenas pesquisas nas regiões Sudeste, Sul e Nordeste foram desenvolvidas e uma pequena proporção de pacientes foi analisada. Consequentemente, existe pouco conhecimento sobre a correlação genótipofenótipo nestes pacientes.

3 2 - OBJETIVOS: Investigar correlações entre haplótipos e mutações detectadas em pacientes com Fenilcetonúria. Investigar correlações entre haplótipos e fenótipo clínico da Fenilcetonúria. 3 - MATERIAIS E MÉTODOS: a) Caracterização da amostra: A amostra estudada foi formada por 32 pacientes não relacionados entre si com HPA por deficiência de PAH (Fenilcetonúria), diagnosticados através do programa de triagem neonatal (teste do pezinho) do estado do Pará. Foi realizado um contato pessoal com as famílias de pacientes, no qual foram explicados os objetivos do estudo, com esclarecimento de todas as dúvidas levantadas pela família. Caso o convite para participação neste estudo por parte da família do paciente fosse aceito, foi fornecido um termo de consentimento livre e esclarecido aos pais (ou responsável) do paciente, antes da coleta de qualquer material biológico. O critério fundamental para a inclusão dos pacientes na amostra foi o diagnóstico bioquímico confirmado de PKU (nível de Phe > 4 mg/dl), através da dosagem plasmática de Phe. Casos com suspeita de anormalidades no metabolismo do cofator enzimático BH4 foram excluídos do estudo. O critério bioquímico usado para classificar os pacientes quanto à forma de PKU considerou as concentrações sanguíneas de Phe pré-tratamento: Níveis de Phe pré-tratamento acima de 20,0mg/dL representam a forma PKU clássica. Níveis de Phe pré-tratamento entre 10,0 20,0mg/dL representam formas leve/moderada de PKU. Pacientes classificados como HPA não-pku apresentam níveis de Phe plasmática entre 4,1 e 10,0mg/dL. b) Coleta e armazenamento das amostras: Foram coletados por meio de punção venosa cerca de 5 ml a 10 ml de sangue total em frascos de vidro com EDTA. Logo em seguida, as amostras foram adequadamente identificadas com nome do paciente e data da coleta, e armazenadas em temperatura -20º C até o momento da extração de DNA. c) Extração de DNA: Para a extração do DNA genômico, foi utilizado o Método do Fenol- Clorofórmio com adaptação do protocolo Old & Higgs em d) Amplificação de fragmentos do gene da PAH pela PCR: Para a identificação e caracterização molecular das mutações e polimorfismos, regiões do gene da PAH que englobam os éxons e suas regiões

4 adjacentes foram amplificadas pela técnica da PCR. Os primers utilizados neste estudo estão representados na tabela 3.1. O protocolo de preparo das reações de amplificação encontra-se resumido nas tabelas 3.2 e 3.3. Tabela 3.1: Seqüências dos iniciadores (primers) utilizados neste estudo Éxon Iniciador Seqüência (5 3 ) Tamanho (pb) 1 1F 1R 2F GTTAAAACCTTCAGCCCCAC GGATCTCTTTCTCTGGAGGC GTCCATGGAGGTTTAACAGG R GAACATGGAAGTTTGCTACG 3F TTAGTTCCTGTGACTGTCTC R CATGTGAGTTACTTATGTTGC 4 4F 4R GTACTCAGGACGTTGCCTTC CTCATCTACGGGCCATGGAC 145 5F GCACTGTCATGGCTTTAGAG R CATGCTGGTATTTTCCATCC 6 6F 6R CTGCCTTGAGCACCTATTTTG CCAACTTTCTCAGGGCATTG F 7R GAGTGGTGATGAGCTTTGAG ACCAGCCAGCAAATGAACC F 8R GAGTCTGGCTTGGCTTAAAC GAGAAATTCAGGTCACAGAC F 9R GCCAAGTACTAGGTTGGTTC GGCCATAGCCTATAGCACTC F 10R CCATCATAGAGTGTGCTCTC CAGGTTGCATATCAAAACGG F 11R TGAGAGAAGGGGCACAAATG GTAGACATTGAGTCCACTCT F 12R CCACTGAGAACTCTCTTAAG CTTCGATTACTGAGAAACCG F 13R GTCTTTCACTAGGACACTTG GGATCTCCATCAACAGATTC 170 *Iniciadores F: forward; *Iniciadores R: reverse

5 Tabela 3.2: Protocolo básico para as reações de amplificação por PCR Reagentes 1X DNTPs (2mM) 2,5 µl Tampão de PCR 10X (sem MgCl2) 2,5 µl Primer PKU forward (10 pmol/µl) 1,5 ou 2,0 µl Primer PKU reverse (10 pmol/µl) 1,5 ou 2,0 µl MgCl2 (50 mm) 2,0 ou 1,5 µl Taq DNA polimerase 1,0 0,25 µl DNA (100 ng/µl) 2,0 µl Água Mili-Q estéril Variável Tabela 3.3: Condições de termociclagem utilizada nas reações de PCR Estágios Número de ciclos Temperatura Tempo (minuto) Desnaturação inicial 1 94ºC 5 Desnaturação 94ºC 1 Anelamento 30 55ºC a 66ºC 1 Extensão 72ºC 1# Extensão final 1 72ºC 5 # O tempo de extensão utilizado para a amplificação do éxon 7 foi de 30 segundos Após as reações de amplificação, os produtos de PCR (5,O μl) foram submetidos à análise por eletroforese horizontal em gel de agarose 1,5%, 2,0% ou 3,0% (contendo brometo de etídio), de acordo com o tamanho do fragmento analisado. Após a eletroforese, o gel de agarose foi transferido para um transiluminador com luz ultravioleta, no qual ocorreu a visualização dos fragmentos de DNA. O tamanho do fragmento amplificado foi comparado ao marcador de peso molecular (50 pb ou 100 pb), com o objetivo de confirmar a amplificação desejada.

6 e) Sequenciamento de DNA Após a amplificação, os produtos de PCR foram então submetidos à análise através de seqüenciamento direto do DNA utilizando o kit ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems, USA) e o Seqüenciador Automático e multiusuário ABI-PRISM 377 (Applied Biosytems), localizado no Laboratório de Genética Humana e Médica (LGHM) da Universidade Federal do Pará. As tabelas 3.4 e 3.5 mostram o protocolo utilizado nas reações de seqüenciamento de DNA e as condições de termociclagem das mesmas, respectivamente. Tabela 3.4: Protocolo básico utilizado nas reações de seqüenciamento de DNA Reagentes Quantidade para 1 reação BigDye 0,5 µl Primer (forward ou reverse) 1 µl DNA 1 µl Água mili - Q estéril 7,5 µl Tabela 3.5: Condições de termociclagem utilizada nas reações de sequenciamento de DNA Estágios Desnaturação inicial Número de ciclos Temperatura Tempo 1 96ºC 1min. Desnaturação 96ºC 15seg. Anelamento/Extensão 30 55ºC a 66ºC 4min. Etapa final - 4ºC 30min. f) Avaliação de dados clínicos e bioquímicos Os dados bioquímicos (nível de Phe no momento do diagnóstico e as quantificações de Phe durante o tratamento) foram obtidos através de uma revisão retrospectiva realizada nos prontuários dos pacientes em tratamento ou acompanhamento pela equipe multidisciplinar do Serviço de Referência em Triagem Neonatal do estado do Pará.

7 g) Atividade residual prevista para PAH (ARP) As concentrações da atividade de PAH obtidas por estudos de expressão in vitro do cdna da PAH normal e mutante foram utilizados para prever o nível de atividade da PAH em pacientes com genótipos conhecidos. Os valores da atividade residual prevista de PAH (ARP) foram obtidos a partir de uma consulta no PAHdb ( (Okano et al, 1991), no qual estão registradas as atividades residuais enzimáticas referentes a algumas mutações. O valor da ARP foi calculado considerando a média dos níveis da atividade de PAH associados a cada enzima mutante e foi expresso como a percentagem do nível normal da atividade de PAH. h) Análise estatística O programa BioEstat. versão 5.0 (Ayres et al, 2007) foi usado para a análise estatística. Um p-valor 0,05 foi considerado estatisticamente significante em todas as análises. O teste binominal foi utilizado na avaliação dos dados clínicos e comparação das frequências de mutações do nosso estudo com outros estudos realizados; teste de Mann-Whitney utilizado na avaliação dos níveis de Phe e avaliação da ARP. As frequências dos polimorfismos foram determinadas pela divisão do número de alelos portadores das mesmas pelo número total de alelos pesquisados. Para calcular os valores percentuais das frequências, este coeficiente foi multiplicado por 100.

8 4 - RESULTADOS: 4.1. Identificação de polimorfismos no gene da PAH Através do seqüenciamento direto do DNA foi possível identificar os polimorfismos IVS2nt19t>c (exon 2), Q232Q (exon6) e V245V (exon 7). O polimorfismo IVS2nt19t>c é causado por uma transição de timina por citosina na posição t/c do íntron 2. Foram encontrados 4 pacientes com este polimorfismo: 2 homozigotos e 2 heterozigotos, perfazendo uma frequência alélica de 9,3% (6/64) O polimorfismo Q232Q é causado por uma transição de uma guanina por uma adenina na posição 696 do exon 6 do gene da PAH. Esta alteração não modifica o amimoácido (Glutamaina) na sequencia proteica. Foram encontrados 2 heterozigotos para este polimorfismo, perfazendo uma frequência alélica de 3,1% (2/64). O polimorfismo V245V é provocado por uma transição de uma guanina por uma adenina na posição 735 do éxon 7 do gene da PAH. Esta alteração não modifica o aminoácido na proteína. Foram encontrados 4 pacientes com esta alteração, sendo 3 heterozigotos e 1 homozigoto para este polimorfismo, perfazendo uma frequência alélica de 7,8% (5/64). A) Polimorfismo IVS2nt19t>c: Sequência normal Sequência mutante: homozigoto (T>C)

9 B) Polimorfismo V245V: Sequência normal Sequência mutante: heterozigoto (G>A) Identificação de polimorfismos através do sequenciamento direto do gene da PAH: A) Identificação do polimorfismo IVS2nt19t>c (região 2); B) Identificação dos polimorfismos V245V (região 7).

10 O quadro abaixo mostra a distribuição dos genótipos que causam a PKU e a presença de polimorfismos. Não houve correlação entre a ARP e a presença das alterações genéticas (mutações patogênicas e os polimorfismos). Não houve correlação entre a ARP e os níveis de Phe no momento do diagnóstico e as concentrações de Phe durante o tratamento. Os pacientes que apresentaram os polimorfismos (6/32) foram classificados de acordo com os níveis de Phe no momento do diagnóstico: 4 com a forma clássica e 2 com PKU leve/moderada. Genótipos IVS10nt-11g>a/ Y414C (IVS2nt19t>c / V245V) L242F/ R158Q (V245V/V245V) IVS10nt-11g>a/ IVS10nt-11g>a (IVS2nt19t>c IVS2nt19t>c) R408W/ - (Q232Q / V245V) R261Q/ - (IVS2nt19t>c / Q232Q / V245V) ARP (%) Phe Diagnóstico (mg/dl) Phe* Tratamento (mg/dl) Classificação Bioquímica 25 24,4 10,7 ± 6,3 PKU clássica?/10 24,0 11,3 ± 8,1 PKU clássica 0 15,0 - PKU moderada/leve - 0/? 14,0 PKU moderada/leve 30/? 28,1 16,8 ± 7,4 PKU clássica E280K/ - 1/? 26,5 10,8 ± 8,5 PKU clássica (IVS2nt19t>c / IVS2nt19t>c) ARP: atividade residual prevista para PAH, de acordo com estudos de expressão in vitro. * Média e desvio padrão dos níveis de Phe durante o período de tratamento ou acompanhamento. Mutações patogênicas são demonstradas em cor preta. Os polimorfismos estão em destaque vermelho. CONCLUSÃO: A presença de polimorfismos não patogênicos (IVS2nt19t>c, Q232Q e V245V) foi observada em 18,75% dos pacientes da amostra. Estes polimorfismos também estiveram presentes nos estudos realizados da região Sul do Brasil e em Minas Gerais. Na região Sul, 46,6% dos pacientes com deficiência de PAH apresentaram polimorfismos, sendo que a alteração IVS2nt19t>c apresentou a maior frequência (20,0%). Este polimorfismo também foi o mais frequente (9,3%) no presente estudo. A frequência do polimorfismo V245V foi de 7,8%, similar à observada nos pacientes do sul do Brasil (10,9%).

11 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Andrade, R. Avaliação do Tratamento de Pacientes com Fenilcetonúria na Unidade de Referência Especializada Materno-Infantil e do Adolescente (UREMIA). Trabalho de Conclusão de Curso. Universidade Federal do Pará, Blau N; Belanger-Quintana A; Demirkol M; Feillet F, Giovannini M, MacDonald A, et al. Optimizing the use of sapropterin (BH4) in the management of phenylketonuria. Mol. Genet. Metab. Apr.96: Blau, N.; Duran, M.; Blaskoviks, M.E. Physician s Guide to the Laboratory Diagnosis of Metabolic Disease., 1st ed., London, Chapman and Hall, Giugliani, L. Hiperfenilalaninemia por deficiência de fenilalanina hidroxilase: identificação de indivíduos responsivos à administração de Tetrahidrobiopterina por via oral. Dissertação de mestrado. Universidade Federal do Rio Grande do Sul Groot M.J; Hoeksma, M; Blau, N; Reijngoud D.J; van Spronsen. Pathogenesis of cognitive dysfunction in phenylketonuria: Review of hypotheses. Molecular Genetics and Metabolism. 99: S86-S Guthrie, R. The introducion of newborn screening for phenylketonuria: a personal history. Europ. J. Pediat. 155 (suppl. 1): 4-5, Manual de Normas Técnicas e Rotinas Operacionais do Programa Nacional de Triagem Neonatal / Ministério da Saúde, Secretaria de Assistência à Saúde, Coordenação- Geral de Atenção Especializada. Brasília: Ministério da Saúde Marini CT; Pimentel SH; dos Santos ICGP; Vargas PR; Pedrosa J. Newborn screening: a national public health programme in Brazil. J. Inherit. Metab.Dis PAHdb: Plana J, Ferri N, Buscá, MAV, Pérez-Duenãs B, Rich E, Lópes L. Hiperfenilalaninemia. In: Sanjurjo P, Baldellon A. Diagnóstico y tratamiento de las enfermedades metabólicas hereditárias. 2nd ed. Madri Santos, L.L; Magalhães-Castro, M; Fonseca, C.G, Starling, A.L.P; Januário, J.N; Aguiar, M.J.B; Carvalho, M.R.S. PKU in Minas Gerais State, Brazil: Mutation Analysis.Annals of Human Genetics. 72: Sarkissian CN; Gámez A; Scriver CR. What we know that could influence future treatment of phenylketonuria. J. Inherit Metab. 32:

12 Scriver CR. The PAH gene, Phenylketonuria, and a Paradigm Shift. Human Mutation. 28 (9) Scriver, C.R, Kaufman, S. Hyperphenylalaninemia: phenylalanine hydroxylase deficiency. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly, WS; Valle, D, eds. The metabolic and molecular bases of inherited disease, 8 ed. New York. McGraw-Hill: Scriver, C.R; Kaufman, S; Eisensmith, R.C; Woo, S.L.C. The hyperphenylalaninaemias. In: Scriver, C.R; Beaudet, A.L; Sly, W.S; Valle, D, eds. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. Pp New York: McGraw Hill Silva, L.C.S; Carvalho, T.S; Silva, F.B; Morari, L; Fachel, A.A; Pires, R.F; Refosco, L.F; Desnick, R; Giugliani, R; Pereira, M.L.S. Molecular Characterization of Phenylketonuria in South Brazil. Mol. Gen. Metab. 79: Vaccaro, T.S. Identificação de mutações freqüentes no gene da fenilalanina hidroxilase por PCR em tempo real. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal do Rio Grande do Sul Zschocke, J. Molecular Basis of Phenylketonuria: from genotype to clinical management. Ann Nestlé [Engl]. 68:

13 DIFICULDADES Não foi possível definir os haplótipos de acordo com os objetivos iniciais. As principais limitações foram: 1. Problemas metodológicos associados à reprodutibilidade das técnicas de Biologia Molecular; 2. Demora na aquisição de reagentes; 3. Tamanho amostral reduzido poderia prejudicar na análise estatística. PARECER DO ORIENTADOR: A acadêmica LARISSA MENDES PEREIRA tem desenvolvido seu projeto com responsabilidade e interesse científico. Portanto, sou de parecer favorável ao presente relatório final, assim como, a renovação de sua bolsa de iniciação científica junto ao CNPq.. DATA : 10 / 08 / 2015 Luiz Carlos Santana da Silva ASSINATURA DO ORIENTADOR Larissa Mendes Pereira ASSINATURA DO ALUNO