Expressão imunohistoquímica das ciclooxigenases 1 e 2 nos tumores melanocíticos do cão

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1 Mestrado Integrado em Medicina Veterinária Ciências Veterinárias Expressão imunohistoquímica das ciclooxigenases 1 e 2 nos tumores melanocíticos do cão Anabela de Jesus Almeida Garcia Orientador: Professora Doutora Felisbina Luísa Pereira Guedes Queiroga Co-orientador: Professora Doutora Isabel Cristina Ribeiro Pires UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO VILA REAL, 2009

2 Mestrado Integrado em Medicina Veterinária Ciências Veterinárias Expressão imunohistoquímica das ciclooxigenases 1 e 2 nos tumores melanocíticos do cão Anabela de Jesus Almeida Garcia Orientador: Professora Doutora Felisbina Luísa Pereira Guedes Queiroga Co-orientador: Professora Doutora Isabel Cristina Ribeiro Pires UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO VILA REAL, 2009

3 Aos meus pais e avós maternos. Por tudo aquilo que nem uma infinidade de palavras poderia expressar.

4 Resumo Resumo O objectivo do presente estudo foi investigar a expressão imunohistoquímica das ciclooxigenases 1 e 2 nas neoplasias melanocíticas dos canídeos. Assim, 40 tumores melanocíticos (29 cutâneos, 9 orais e 2 oculares), incluindo 9 benignos (melanocitomas) e 31 malignos (melanomas), foram analisados. A expressão da Cox-1 foi observada na quase totalidade dos casos, enquanto a expressão da Cox-2 esteve ausente nos tumores benignos. Nos tumores cutâneos, a expressão da Cox-2 foi significativamente mais elevada nas lesões malignas do que nas benignas (p=0,047). Nos melanomas oculares, a expressão desta proteína ocorreu em 50% dos casos. Nos melanomas orais, todos os casos apresentaram positividade para a Cox-2. Pudémos também observar que a expressão da Cox-1 e Cox-2 revelava uma associação estatisticamente significativa com algumas características clinicopatológicas, tais como, a raça, idade, tamanho, IM, tipo celular, necrose e pigmentação intratumorais. Os nossos resultados sugerem que a proteína Cox-2 poderá ser um importante marcador imunohistoquímico no diagnóstico dos tumores melanocíticos do cão, na distinção entre melanocitomas e melanomas cutâneos de baixa agressividade. A utilização de AINEs, especialmente contra a Cox-2, poderá revelar-se útil na terapia adjuvante do melanoma canino. iv

5 Abstract Abstract The aim of this study was to investigate Cox-1 and Cox-2 immunohistochemical expression in canine melanocytic neoplasia. Therefore, 40 melanocytic tumors (29 cutaneous, 9 oral and 2 ocular), including 9 benign (melanocytoma) and 31 malignant (melanoma), were investigated. Cox-1 expression was observed in almost all cases, while Cox-2 expression was absent in the benign ones. In cutaneous tumors, the expression of Cox-2 was significantly higher in malignant than in benign lesions (p=0,047). In ocular melanoma, Cox-2 expression occurred in 50% of cases. In oral melanomas, all cases were positive for Cox-2 expression. We could also observe that Cox-1 and Cox-2 expression were significantly associated with some clinic-pathologic features, such as the breed, age, size, mitotic index, cellular type intratumoral necrosis and pigmentation. In conclusion, our results suggest that the Cox-2 protein might be an important immunohistochemical marker for distinguishing melanocytoma from low aggressive cutaneous melanoma. Besides, the use of non-steroidal anti-inflammatory drugs, especially Cox-2 inhibitors, may have a useful role to play in the adjuvant therapy of canine melanoma. v

6 Índice geral Índice geral Resumo.. Abstract.. Índice de quadros e figuras.. Siglas e abreviaturas. Agradecimentos iv v viii x xi 1. Introdução Tumores melanocíticos: Panorama Geral Tumores melanocíticos dos canídeos Tumores melanocíticos cutâneos Tumores melanocíticos orais Tumores melanocíticos oculares Diagnóstico, Tratamento e Prognóstico: Considerações Gerais As Ciclooxigenases Objectivos Material e Métodos Material Métodos Avaliação clínica Branqueamento da melanina Estudo histopatológico Estudo imunohistoquímico Avaliação da imunorreactividade Análise estatística Resultados Dados epidemiológicos sobre os animais do estudo Características histopatológicas das amostras tumorais Estudo da imunorreactividade das Ciclooxigenases 1 e 2 no total da amostra Imunorreactividade das ciclooxigenases 1 e 2 nas lesões melanocíticas cutâneas. 22 vi

7 Índice geral Imunorreactividade das ciclooxigenases 1 e 2 nas lesões melanocíticas orais Imunorreactividade das ciclooxigenases 1 e 2 nas lesões melanocíticas oculares Associação entre a imunoexpressão das ciclooxigenases 1 e 2 e os parâmetros clinicopatológicos Melanomas cutâneos Melanomas orais Discussão Conclusões Perspectivas Futuras Referências Bibliográficas.. 46 vii

8 Índice de quadros e figuras Índice de quadros Quadro 1: Diagnóstico histológico das amostras incluídas no estudo (n=40) Quadro 2: Avaliação da imunorreactividade das ciclooxigenases. 16 Quadro 3: Caracterização histopatológica das amostras em estudo. 18 Quadro 4: Avaliação imunohistoquímica das lesões melanocíticas cutâneas.. 22 Quadro 5: Avaliação imunohistoquímica das lesões melanocíticas orais Quadro 6: Associação entre parâmetros clinicopatológicos e a percentagem de células imunorreactivas da Cox-1 nos melanomas cutâneos. 25 Quadro 7: Associação entre os parâmetros clinicopatológicos e a intensidade de marcação da Cox-1 nos melanomas cutâneos. 26 Quadro 8: Associação entre os parâmetros clinicopatológicos e a percentagem de células imunorreactivas da Cox-2 nos melanomas cutâneos Quadro 9: Associação entre os parâmetros clinicopatológicos e a intensidade de marcação da Cox-2 nos melanomas cutâneos Quadro 10: Associação entre os parâmetros clinicopatológicos e a percentagem de células imunorreactivas da Cox-1 nos melanomas orais 29 Quadro 11: Associação entre os parâmetros clinicopatológicos e a intensidade de marcação da Cox-1 nos melanomas orais Quadro 12: Associação entre os parâmetros clinicopatológicos e a percentagem de células imunorreactivas da Cox-2 nos melanomas orais 31 Quadro 13: Associação entre os parâmetros clinicopatológicos e a intensidade de marcação da Cox-2 nos melanomas orais 32 viii

9 Índice de quadros e figuras Índice de Figuras Figura 1: Distribuição racial pelos três grupos de lesões melanocíticas.. 17 Figura 2: Expressão imunohistoquímicas das ciclooxigenases 1 e 2 nos três grupos de lesões melanocítica. 20 Figura 3: Imunoexpressão citoplasmática da Cox-1 (Estalão=30µm).. 21 Figura 4: Melanoma cutâneo. Imunoexpressão da Cox-2 (Estalão=60µm). 21 Figura 5: Melanoma oral. Imunoexpressão da Cox-2 (Estalão=30µm) 21 Figura 6: Melanoma ocular. Imunoexpressão da Cox-2 (Estalão=30µm) ix

10 Siglas e Abreviaturas % Por cento µl Microlitro µm Micrometro χ 2 Teste Qui-quadrado AINEs Anti-inflamatórios não esteróides ANOVA Análise de variância ºC Graus Celsius cm - Centímetros COXS Ciclooxigenases COX Ciclooxigenase-1 COX-2 Ciclooxigenase-2 COX-3 Ciclooxigenase-3 CTI Células Tumorais Intravasculares DAB Tetra-hidrocloreto de 3,3 - diaminobenzidina dm 3 Decímetro cúbico g Gramas HE Hematoxilina-eosina HRP Sistema de detecção Ultravison de volume Anti-Polivalente H 2 C 2 O 4 Ácido oxálico IM Índice Mitótico KMnO 4 Permanganato de potássio M Molar MART-1 Melanoma-Associated Antigen reconhecido pelas células T Melan-A Melanoma-Associated Antigen ml Mililitro n Número de amostras NSE Neuron Specific Enolase OMS Organização Mundial de Saúde p Nível de significância estatística PBS Tampão fosfato salino PCox Cox parcial PGH 2 Prostaglandina H 2 PGHS Prostaglandina H-sintetases Marca registada RT-PCR Real Time-Polymerase Chain Reaction (reacção em cadeia da polimerase em tempo real) RE Retículo Endoplasmático SPSS Statistical Pachage for the Social Sciences SRD Sem Raça Determinada TVT Tumor Venéreo Transmissível UTAD Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro W Watts x

11 Agradecimentos AGRADECIMENTOS Ao longo da realização deste trabalho muitas foram as pessoas que contribuíram com a sua amizade, compreensão e sabedoria. Assim sendo, e como não podia deixar de ser, aqui fica o meu muito obrigado a todas elas: À Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD), na pessoa do seu Magnífico Reitor, Professor Armando Mascarenhas Ferreira, manifesto o meu maior reconhecimento por todo o apoio concedido, que possibilitou a realização desta tese de Mestrado. À Professora Doutora Felisbina Luísa Queiroga, o meu muito obrigado por ter aceitado a árdua tarefa de me orientar e guiar nesta importante etapa da minha vida. Agradeço todo o tempo, paciência e sabedoria investidos. À Professora Doutora Isabel Pires, minha co-orientadora, pela mestria e amizade com que sempre me auxiliou. Pelos momentos de boa disposição e pelas preciosas palavras de incentivo. À Professora Doutora Justina Prada pelo auxílio prestado na classificação histológica das amostras e pela amabilidade com que sempre me tratou. À professora Doutora Maria dos Anjos Pires agradeço como directora do Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica da UTAD por toda a boa vontade e pela ajuda prestada sempre que solicitada. Às Professoras Doutoras Adelina Gama, Rita Payen, Fernanda Travassos, Anabela Alves, Maria de Lurdes Pinto e Paula Rodrigues pela disponibilidade e simpatia. Às Senhoras Donas Lígia Lourenço, Ana e Glória por toda a ajuda dada no trabalho de laboratório e pela gentileza demonstrada. xi

12 Agradecimentos conjunto. Às companheiras Ana Lúcia, Daniela, Raquel, Diana e Paula por todo o trabalho Aos meus pais, Rogério e Maria José Garcia, porque sem eles não estaria aqui, pela capacidade de serem ao mesmo tempo excelentes pais e óptimos amigos, por todos os sacrifícios que fizeram para meu benefício, por todo o apoio e amor, sempre. Aos meus avós José e Aurora Almeida que desde sempre estão ao meu lado e que são o meu porto de abrigo. O meu muito obrigado por toda a dedicação, amor e confiança que sempre depositaram em mim. transmitido. À restante família, e em especial à minha avó Aldina Garcia, pelo estímulo À Maria Isabel Carvalho, amiga incondicional desta longa jornada desde o primeiro dia. Por tudo que passamos juntas, pela compreensão, pelos conselhos, pelo companheirismo e acima de tudo por dar sentido à palavra amizade. Ao Carlos Miguel Rebelo, amigo de todas as horas, pela ajuda prestada, pelo afecto e pelo ânimo que me transmitiu sem cessar. Ao Pedro Ribeiro por todo o apoio, carinho e sobretudo pela sua paciência e compreensão nos momentos menos bons. Ao Bruno Reis, Ana Daniela Ferreira, Maria Teresa Cristóvão e Joana Rocha, os amigos de sempre e para sempre pelas gargalhadas, pelas histórias, pelas horas bem passadas durante estes anos todos. xii

13 Introdução 1. INTRODUÇÃO 1.1. Tumores melanocíticos: Panorama Geral Os tumores melanocíticos são frequentes, quer em medicina veterinária, quer em medicina humana (Smith et al., 2002). O reconhecimento desta doença remonta a tempos passados, tendo sido encontradas lesões em múmias humanas de há mais de 2000 anos atrás e, de acordo, com Sastry (1953), o primeiro relato desta patologia em medicina veterinária foi feito por Bunker em 1882 (Garma-Avina et al., 1981). Estas neoplasias estão documentadas em quase todas as espécies de animais domésticos e em muitas espécies de animais selvagens, sendo mais comuns no cão, cavalo e algumas raças de suínos (Ginn, et al., 2007). No Homem, o melanoma é o tumor de pele mais agressivo, sem tratamento efectivo e cuja incidência tem vindo a aumentar drasticamente (Ibrahim & Haluska, 2009). Os tumores melanocíticos têm a sua origem nos melanócitos ou melanoblastos, que são células produtoras do pigmento da pele (melanina), e que derivam da neuroectoderme do embrião (Modiano et al., 1999). A melanina é um pigmento endógeno conhecido sobretudo por ser responsável pela coloração dos pêlos, pele e olhos. No entanto, o pigmento melânico apresenta várias propriedades como a absorção de luz, propriedades redox e de quelação (Riley, 1997). Desempenha, ainda, um papel importante em diversas funções biológicas (Korytowski & Sarna, 1990), entre as quais se encontram a protecção estrutural, funções antibióticas, de quimioprotecção e sobretudo de fotoprotecção (Riley, 1997). A sua síntese ocorre a nível de estruturas especializadas dos melanócitos que se designam de melanossomas. Por sua vez, os melanócitos têm origem nos melanoblastos, que são os seus precursores da crista neural (Ginn, et al., 2007). Durante o desenvolvimento embrionário, os melanoblastos, migram para várias localizações, sobretudo para a pele, onde maturam. Porém, estas células podem migrar para outros tecidos como a coróide, retina, corpos ciliares e meninges, daí o aparecimento de tumores melanocíticos também nestes locais (Jones et al., 1997). Os melanócitos da pele, em regra, não possuem pigmento melânico em quantidade para ser observado em microscopia de luz, uma vez que este é transferido para os queratinócitos adjacentes (Riley, 1997). Com o intuito de tentar compreender a origem e a progressão das lesões melanocíticas do Homem têm sido realizados diversos estudos (Ha et al., 2008; Haass et al., 2005; Modiano 1

14 Introdução et al., 1999; Riley, 1997). Acredita-se que o desenvolvimento do melanoma se inicie num suposto estádio precursor, comummente em nevus ou nevus displásicos, e avance para uma primeira fase de crescimento radial, uma primeira fase de crescimento vertical e, finalmente, metastize à distância (Goulet et al., 2003). Tal ocorrência foi já igualmente reportada em medicina veterinária (Withrow & Vail, 2007). O estado de senescência celular verificado nesses nevus benignos é então considerado uma barreira crucial à tumorigenesis. Todavia, os mecanismos pelos quais o melanoma se evade desse estado, dando origem ao desenvolvimento da malignidade quando ultrapassado o limite de Hayflick, não estão completamente esclarecidos (Ha et al., 2008). Os fenómenos moleculares presentes nas diferentes fases que levam à progressão do melanoma para a fase de crescimento vertical, onde surgem as metástases, são também ainda, alvo de estudos, numa tentativa de reduzir a mortalidade associada a esta alteração patológica (Bar-Eli, 1997; Sulaimon & Kitchell, 2003). Os melanócitos encontram-se na camada basal da epiderme, onde estabelecem uma relação de 1:5 com os queratinócitos, os quais, sob condições normais de homeostasia, regulam a divisão e a proliferação destas células. Contudo, quando este equilíbrio é afectado, ocorre uma alteração nas unidade melânicas da epiderme que proliferam continuamente, podendo originar o melanoma (Haass et al., 2005). Nos seres humanos, a radiação UV é apontada como um factor desencadeante deste desequilíbrio. O mesmo não está provado nos cães, visto que nesta espécie o aparecimento frequente desta doença em pele coberta por pêlo e na cavidade oral refuta esta hipótese (Gross et al., 2005) Tumores melanocíticos nos canídeos As neoplasias melanocíticas dos canídeos compreendem 4-7% de todos os tumores (Bergman et al., 2006; Modiano et al., 1999), representando cerca de 7% dos tumores malignos (Kim et al., 2009). Recentemente, especial atenção tem recaído sobre estas lesões, devido ao aumento considerável da sua incidência em humanos e ao facto de estes e os seus animais de companhia, nomeadamente o cão, estarem expostos a condições ambientais semelhantes (Roels et al., 1999). As lesões melanocíticas dos canídeos classificam-se em: lentigo (hiperplasia melanocítica), melanocitoma, melanocitoma-acantoma (melanoacantoma) e melanoma (Goldschmidt et al., 1998). Estes grupos podem dividir-se em sub-grupos conforme a 2

15 Introdução morfologia celular predominante das células tumorais (células fusiformes, células redondas ou poligonais, células dendríticas, células epitelióides e células balonizantes) (Gross et al., 2005). De forma a uniformizar a classificação dos tumores melanocíticos, os malignos são denominados de melanomas malignos ou simplesmente melanomas, por seu lado, o termo melanocitomas é empregue nas lesões benignas (Espinosa de los Monteros et al., 2000; Smith et al., 2002). Apesar dos tumores melanocíticos ocorrerem em animais de diferentes raças, está descrita uma maior incidência nos animais das raças Schnauzer, Dobermann Pinscher, Scottish Terrier, Setter Irlandês, Setter Gordon, Golden Retriever (Chwirot & Kuzbicki, 2007; Smith et al., 2002), Chow Chow, Cocker Spaniel, Cão de Pastor Alemão, Retriever do Labrador e Rottweiler (Schultheiss, 2006). A predisposição racial observada apoia a teoria de que os melanomas do cão possam ter uma origem genética (Modiano et al., 1999). Ambos os tipos de lesões, benignas e malignas, ocorrem em animais mais velhos, com idade igual ou superior a 10 anos, e em animais de raças pequenas, com pele intensamente pigmentada (Hrabeta et al., 2007; Smith et al., 2002). Alguns estudos descrevem uma predisposição sexual desta alteração patológica, com maior incidência em machos (Hrabeta et al., 2007). Os tumores melanocíticos do cão são mais frequentes na pele, incluindo os dígitos, na cavidade oral e lábios. As lesões do olho representam somente 2% dos casos (Smith et al., 2002) Tumores melanocíticos cutâneos Os tumores melanocíticos cutâneos representam cerca de 9-20% dos tumores cutâneos e, com a excepção dos tumores do leito ungueal (dígitos) e junções mucocutâneas, seguem um percurso benigno na maioria das vezes (Millanta et al., 2002; Moran et al., 1983). As neoplasias cutâneas benignas aparecem sobretudo a nível da cabeça, tronco, escroto, axilas e membros posteriores (Garma-Avina et al., 1981). Geralmente manifestam-se como nódulos solitários, negros, castanhos ou acinzentados (Ginn, et al., 2007). São, por norma, bem definidas, intensamente pigmentadas, têm geralmente menos de 2 cm de diâmetro, consistência firme e sem adesão aos tecidos subjacentes (Withrow & Vail, 2007). A ulceração está ausente na maioria das lesões (Gross et al., 2005). 3

16 Introdução As lesões cutâneas malignas surgem mais rotineiramente a nível do leito ungueal dos dígitos, sobretudo dos membros posteriores, e nas junções mucocutâneas, em especial nos lábios e pálpebras (Gross et al., 2005; Withrow & Vail, 2007). Por sua vez, exibem um aspecto macroscópico que vai desde negras máculas até grandes massas irregulares de rápido crescimento e de coloração castanha a cinzenta ou mesmo negra (Cangul, 2001). Apesar de, na maioria dos casos, se verificar a presença de grânulos de pigmento melânico, existem tumores que não os possuem, sendo consequentemente denominados de tumores amelânicos. A ausência de pigmentação pode ocorrer nos melanomas cutâneos (Cangul, 2001) e oculares (Yi et al., 2006), todavia, a sua frequência é maior nos melanomas orais. Os sinais clínicos incluem a presença de ulceração e necrose (Withrow & Vail, 2007). Como foi anteriormente referido, para a generalidade de tumores melanocíticos, os cães com pele intensamente pigmentada revelam um risco mais elevado de aparecimento da neoplasia. No caso particular dos tumores cutâneos, raças como Schnauzer e Scottish Terrier evidenciam maior predisposição ao seu desenvolvimento. Além das raças referidas também o Setter Irlandês e o Golden Retriever estão predispostos ao melanoma subungueal. Por outro lado, o Setter Irlandês, Chihuahua, Golden Retriever e Cocker Spaniel denotam uma maior tendência a desenvolver melanoma do lábio que outras raças (Smith et al., 2002) Tumores melanocíticos orais Os tumores melanocíticos orais são a neoplasia maligna mais frequentemente diagnosticada na cavidade oral (Bergman et al., 2003; Esplin, 2008; Sánchez et al., 2007) e podem surgir nos epitélios lingual, oral e palatino (Smith et al., 2002). No entanto, e apesar de poder apresentar várias localizações dentro da cavidade oral, a gengiva (Ramos-Vara et al., 2000) e o palato duro (Alexander et al., 2006) são os locais mais afectados. Contrariamente ao que acontece nos melanomas cutâneos, os melanomas orais são virtualmente considerados sempre de carácter maligno e com um mau prognóstico (Bergman, 2007). O uso do termo benigno referente a qualquer neoplasia melanocítica do lábio ou da cavidade oral é tido como insensato. Porém, um estudo realizado por Esplin (2008) mostra que, embora estas lesões devam ser encaradas como potencialmente agressivas, as neoplasias melanocíticas bem diferenciadas histologicamente apresentam um bom prognóstico, com tempo de sobrevida prolongado após remoção cirúrgica. Os melanomas orais agressivos são caracterizados pelo rápido crescimento tumoral, elevada infiltração focal, grande capacidade 4

17 Introdução de metastização local e à distância e frequentes recorrências após remoção cirúrgica (Sánchez et al., 2007). Os sinais clínicos podem incluir disfagia, halitose, ptialismo, sangramento e ocasionalmente fractura da mandíbula (Smith et al., 2002). Animais com idade superior a 10 anos são mais propensos ao aparecimento deste tipo de lesão. Raças pequenas, e cães com a mucosa oral muito pigmentada (MacEwen et al., 1999), sobretudo o Cocker Spaniel, evidenciam um maior risco de desenvolver melanoma oral (Ramos-Vara et al., 2000). O diagnóstico deste tipo de lesão é dificultado, não só devido à grande variabilidade morfológica, mas também pelos diferentes graus de pigmentação que podem possuir. Por esta razão, alguns autores defendem a aplicação da análise imunohistoquímica com anticorpos como a proteína S-100, a fim de esclarecer o diagnóstico (Nakajima et al., 1982; Sanja et al., 2005) Tumores melanocíticos oculares Os tumores melanocíticos oculares são menos comuns que os cutâneos e os orais (Smith et al., 2002). Contudo, são os tumores mais frequentemente diagnosticados a nível ocular e emergem sobretudo a partir da úvea anterior (Yi et al., 2006). A maior parte destes tumores apresentam um comportamento benigno (Shimoyama et al., 2007) e só excepcionalmente metastizam (Wilcock & Peiffer Jr, 1986). Os sinais clínicos podem incluir uveite, glaucoma e hifema, caracterizado por buftalmos do globo ocular, edema e neovascularização da córnea, entre outros (Wilkerson et al., 2003) Diagnóstico, Tratamento e Prognóstico: Considerações Gerais O diagnóstico das neoplasias melanocíticas é dificultado pelo facto de, a nível clínico, citológico e histológico, existirem várias lesões que podem assemelhar-se a esta alteração patológica (Modiano et al., 1999). Actualmente, o meio mais utilizado para o diagnóstico definitivo é o exame histopatológico do tumor (Smith et al., 2002). Este baseia-se na morfologia e na arquitectura celulares. Porém, os critérios histológicos suscitam dúvidas mesmo para os patologistas mais 5

18 Introdução experientes (Chwirot & Kuzbicki, 2007). Do ponto de vista histológico, os melanomas podem assemelhar-se a outros tumores de células redondas como carcinomas, sarcomas, linfomas, tumores osteogénicos (Ramos-Vara et al., 2000) plasmocitomas, histiocitomas, leiomiomas, rabdomiossarcomas, adenoma mamário complexo e tumor venéreo transmissível (TVT) (Cangul et al., 2001). Nestes casos, a determinação de proteínas constituintes que se expressam exclusivamente em células produtoras de melanina ou em células com origem nos tecidos neuroectodérmicos, pode revelar-se muito útil no diagnóstico (Koenig et al., 2001). Com o objectivo de identificar as referidas proteínas, recorre-se à técnica de imunohistoquímica. Em medicina humana, nesta técnica laboratorial e para o objectivo definido, é utilizado um painel de anticorpos específicos para os antigénios: poteína S100, melanoma-associated antigen (Melan-A), melanoma-associated antigen reconhecido pelas células T (MART-1), caderina E, tirosinase, HMB45/gp100 e a isoforma do factor de transcrição associado à microftalmia do melanoma (MITF-M) (Gross et al., 2005). Nos cães, o diagnóstico de melanoma é dado quando existe imunomarcação pelos anticorpos contra a proteína S100, a vimentina, e a Neuron Specific Enolase (NSE) e quando, em simultâneo, é negativa para a citoqueratina (Sulaimon et al., 2002). A imunohistoquímica advém, assim, como a técnica auxiliar mais eficiente e mais frequentemente usada no diagnóstico definitivo do melanoma (Chwirot & Kuzbicki, 2007). Mais recentemente, técnicas de biologia molecular como o RT-PCR e a hibridação in situ têm vindo a ser exploradas e futuramente poderão tornar-se alternativas importantes para o diagnóstico das lesões melanocíticas (Cangul, 2001). O tratamento dos melanomas é controverso e geralmente pouco eficaz. Tanto os melanomas caninos como os melanomas humanos, são doenças que inicialmente são tratadas com terapia local agressiva, incluindo a cirurgia e/ou radioterapia fraccionada. Mesmo assim, a metastização sistémica como sequela é uma realidade (Bergman et al., 2003). E, cães com um estado avançado da doença, apresentam, em média, um tempo de sobrevivência de 1-5 meses (Bergman et al., 2006). A carboplatina é o quimioterápico sistémico de eleição nos melanomas caninos, sem, todavia, fornecer um controlo satisfatório quer local, quer a nível da prevenção de metástases (Proulx et al., 2003). Outros agentes quimioterápicos foram testados, como dacarbazina, a doxorrubicina e a cisplatina, no entanto, os resultados apresentados também não se mostraram abonatórios (Alexander et al., 2006). Assim, novos métodos de combate têm sido testados, 6

19 Introdução nomeadamente no campo da imunoterapia (Modiano et al., 1999). Recentemente, um estudo realizado por Bergman e colegas (2003) descreve que a solução para esta patologia poderá passar pela vacinação dos animais com vacinas de ADN xenogénico com tirosinase humana. O melanoma canino é uma doença agressiva, com mais de 80% de taxa de metastização (Sulaimon et al., 2002). Por isso, o seu prognóstico é reservado, na grande maioria dos casos. Tal, deve-se ao facto de o diagnóstico ser normalmente feito numa fase já tardia quando a excisão cirúrgica curativa é já ineficaz e existe metastização para os linfonodos regionais (Smith et al., 2002). No estabelecimento do prognóstico, é importante a avaliação do estádio clínico da doença. Nos melanomas, as metástases são muito comuns e surgem especialmente a nível dos linfonodos regionais e do pulmão, se bem que podem também aparecer noutros órgãos como cérebro, coração e baço (Kim et al., 2009). Actualmente, existem vários meios complementares de diagnóstico, entre eles o estudo imagiológico (tomografia computorizada, ressonância magnética e ultrassonografia) que se revela bastante útil na detecção de possíveis metástases (Wojas-Pelc et al., 2006). A citologia por aspiração com agulha fina surge também como método importante na detecção de metástases neoplásicas em melanomas (Smith et al., 2002). Apesar dos avanços na cirurgia, radioterapia e quimioterapia, aproximadamente 75-80% dos animais tratados irão morrer dentro de 1 ano após o diagnóstico, e a sobrevivência após a detecção de metástases está limitada a uma média de 165 dias (Alexander et al., 2006). Estudos prévios descrevem que a maioria dos melanomas originados na cavidade oral e leito ungueal são malignos e têm um pobre prognóstico, enquanto os melanomas cutâneos e intraoculares tendem a ser benignos e com um prognóstico favorável (Cangul, 2001; Millanta et al., 2002; Schultheiss, 2006). Desta forma, o prognóstico dos tumores aparenta ter uma relação, com a sua localização anatómica (Cangul, 2001; Hrabeta et al., 2007). Com o propósito de tentar estabelecer um prognóstico fiável, têm sido realizados diversos estudos que investigam novos factores de prognóstico e que incluem as características histológicas do tumor (Roels et al., 1999). No entanto, e devido à grande variabilidade histológica destes tumores, a relação destas características com o comportamento biológico das lesões melanocíticas é ainda pouco consensual (Hrabeta et al., 2007; Spangler & Kass, 2006). O índice mitótico é tido, para alguns autores (Ginn, et al., 2007; Withrow & Vail, 2007), como sendo o critério histológico com maior valor prognóstico, como comprovam os estudos realizados por Wilcock & Peiffer Jr (1986) no 7

20 Introdução melanoma ocular canino. Em medicina humana, por outro lado, a profundidade do tumor é tida como o factor prognóstico mais significativo, surgindo recentemente estudos que evidenciam igualmente a importância da ulceração cutânea (Sarpa et al., 2006). Para além dos critérios morfológicos clássicos, outros factores de prognóstico têm sido estudados como a ploidia do ADN (Hrabeta et al., 2007), os marcadores da proliferação (Roels et al., 1999), a expressão e localização subcelular da p53, a expressão e localização subcelular da p21, a expressão e localização subcelular da p16 (Modiano et al., 1999), o marcador Melan A/MART-1 (Koenig et al., 2001) e as ciclooxigenases 1 e 2 (Becker et al., 2009) As Ciclooxigenases As ciclooxigenases (Coxs), também denominadas por prostaglandina H-sintetases (PGHS) ou por prostaglandina endoperoxido-sintetases, são oxigenases dos ácidos gordos e pertencem à super-família das mieloperoxidades (Chandrasekharan & Simmons, 2004). Desde o início da década de 90 que duas isoformas da Cox, Cox-1 e Cox-2, são reconhecidas como parte interveniente na produção da prostaglandina H 2 (PGH 2 ) (o primeiro passo na síntese dos prostanóides) (Warner & Mitchelll, 2004). Entretanto, surgiram já novas isoformas destas enzimas, como a Cox-3, presente no córtex cerebral humano e canino, e a PCox (Cox parcial), ambas consideradas formas variantes da Cox-1 (Simmons, 2003). As Coxs 1 e 2 são interessantes tanto sob o ponto de vista da sua estrutura biológica como no da enzimologia, dado que ambas são homodiméricas, possuem grupo heme e são proteínas glicosadas com dois sítios activos (Smith et al., 1996). Ambas as Coxs são enzimas com uma dupla função e cada uma delas possui duas actividades catalíticas distintas: a de ciclooxigenase e a de peroxidase (Chandrasekharan & Simmons, 2004). Porém, apesar da semelhança estrutural partilhada pelas duas isoformas, as Coxs diferem substancialmente na regulação da sua expressão e nas actividades que executam na biologia e patologia dos tecidos (Cao & Prescott, 2002). Estas duas enzimas são codificadas por diferentes genes localizados em diferentes cromossomas (Smith et al., 1996). A Cox-1 foi purificada pela primeira vez em 1976 e expressa-se constitutivamente em diversos tecidos, como os rins, pulmões, estômago, duodeno, jejuno, íleo, cólon e cego de macacos, cães, ratos e humanos (Williams et al., 1999). Esta enzima está encarregue de várias funções fisiológicas que mantêm a homeostasia e tem um papel primordial na protecção da 8

21 Introdução mucosa gástrica, agregação plaquetária, controlo do fluxo sanguíneo renal e equilíbrio vascular (Lee et al., 2003). A Cox-2, por sua vez, só se expressa constitutivamente na placenta, mácula densa do rim e cérebro (Williams et al., 1999). Encontra-se em quantidades residuais nas células e tecidos normais, excepto quando a sua expressão é induzida em resposta a um ou vários tipos de estímulos (Chandrasekharan & Simmons, 2004). Após o estímulo, a sua expressão aumenta rapidamente, nomeadamente nas células envolvidas na inflamação, como fibroblastos, monócitos e endotélio vascular (Parente & Perretti, 2003). Entre estes estímulos estão incluídos factores de crescimento, citoquinas, lipossacarídeos bacterianos, hormonas, promotores tumorais (Chwirot & Kuzbicki, 2007) e também radicais livres de oxigénio e radiação ultravioleta (Goulet et al., 2003). O aumento local da sua expressão tem sido associado a processos inflamatórios, artrite reumatóide, convulsões e isquémia (Warner & Mitchelll, 2004). A sobreexpressão da Cox-2 foi também verificada em tumores humanos, nomeadamente nos tumores do cólon (Sano et al., 1995), nasofaríngeo (Tan & Putti, 2005), endométrio (Toyoki et al., 2004), mama (Ristimaki et al., 2002), pulmão (Hasturk et al., 2002) e melanoma (Denkert et al., 2001), entre outros. A Cox-2 está implicada no desenvolvimento do cancro do cólon e pode, eventualmente, desempenhar um papel na promoção da invasão, metastização e angiogénese em tumores já estabelecidos (Stolina et al., 2000). Nos canídeos, a expressão da Cox-2 foi investigada em tumores como: linfoma, carcinoma prostático, osteossarcoma, fibrossarcoma oral (Mohammed et al., 2004), tumores mamários (Brunelle et al., 2006; Doré et al., 2003; Queiroga et al., 2005; Queiroga et al., 2007), carcinoma ovárico (Borzacchiello et al., 2007), carcinoma renal (Khan et al., 2001) e carcinoma das células escamosas (Pestilli de Almeida et al., 2001). A nível de localização intracelular, a Cox-1 e a Cox-2 situam-se maioritariamente na parte luminal do retículo endoplasmático rugoso, membrana e envelope nucleares. Existem estudos que comprovam a sua presença, em determinadas situações, também a nível das inclusões lipídicas, mitocôndrias, estruturas filamentares, vesículas e núcleo (Chandrasekharan & Simmons, 2004). Recentemente, trabalhos de investigação realizados mostram que a Cox-1 se localiza no retículo endoplasmático e nas membranas perinucleares, enquanto a localização da Cox-2 reside predominantemente no envelope perinuclear (Ueno et al., 2005). 9

22 Introdução As ciclooxigenases 1 e 2 são os principais alvos terapêuticos dos anti-inflamatórios não esteróides (AINEs). Está provado que os AINEs afectam directamente a acção das ciclooxigenases, seja por modificarem as ligações covalentes da enzima, seja por competirem com o substrato pelo seu sítio activo (Williams et al., 1999). A inibição da actividade das ciclooxigenases é o mecanismo pelo qual os AINEs exercem as suas funções analgésicas, antipiréticas, antiinflamatórias e antitrombóticas (Lee et al., 2003). Contudo, até alguns anos atrás, a acção inibitória destes fármacos estava direccionada para ambas as enzimas, principalmente para a Cox-1, o que se traduzia numa toxicidade gastrointestinal directamente proporcional ao poder selectivo dos AINEs para a Cox-1 (Warner & Mitchelll, 2004). Este tipo de AINEs apresentam efeitos secundários que podem por em perigo a vida do animal, ao inibirem a função protectora da Cox-1, e que incluem ulceração, hemorragia e perfuração gastrointestinal (Williams et al., 1999). A descoberta da ciclooxigenase-2 veio então revolucionar a indústria farmacêutica dos AINEs (Simmons, 2003). Com base nos efeitos secundários acima mencionados, esta indústria tem feito esforços consideráveis para desenvolver AINEs altamente selectivos para a inibição da Cox-2, com pouca ou nenhuma acção sobre a Cox-1 (Parente & Perretti, 2003). Assim, actualmente, os inibidores selectivos da Cox-2 têm sido alvo de especial interesse. Estes fármacos aparentam actuar, diminuindo a síntese de prostaglandinas através da inibição da Cox-2 (comummente sobreexpressa em tumores) e, consequentemente, suprimindo a proliferação celular, possivelmente pelo meio da indução da apoptose (Wakabayashi, 2000). O conhecimento acerca da imunoexpressão das ciclooxigenases 1 e 2 em tumores melanocíticos caninos limita-se ao estudo realizado por Mohammed e colaboradores (2004) em 15 melanomas orais. Portanto, revela-se de todo o interesse investigar a expressão destas proteínas também em tumores com outras localizações, como sejam nos tumores cutâneos e oculares. Neste trabalho além da caracterização histopatológica tumoral e do estudo da imunoexpressão da Cox-1 e Cox-2 pretendeu-se, igualmente, averiguar qual a associação da expressão destas enzimas com as características clinicopatológicas das amostras tumorais. 10

23 Objectivos 2. OBJECTIVOS Os objectivos deste trabalho consistiram em: 1. Avaliar características histopatológicas e dados epidemiológicos dos tumores melanocíticos do cão. 2. Estudar a imunoexpressão das ciclooxigenases 1 e 2 nos tumores melanocíticos de canídeos. 3. Averiguar a associação da imunoexpressão da Cox-1 e Cox-2 nos tumores melanocíticos do cão com as suas características clinicopatológicas. 11

24 Material e Métodos 3. MATERIAL e MÉTODOS 3.1. MATERIAL Na elaboração deste trabalho, foram incluídos todos os tumores melanocíticos, recebidos no Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica da Universidade de Trás-os- Montes e Alto Douro (UTAD), no período decorrido entre Janeiro de 2003 e Janeiro de 2009, num total de 40 tumores (9 melanocitomas e 31 melanomas). O material era proveniente do Hospital Veterinário da UTAD, bem como de várias clínicas privadas situadas em várias localidades de Portugal. Quadro 1: Diagnóstico histológico das amostras incluídas no estudo (n=40). Localização Diagnóstico histológico Número de amostras Cutânea Melanocitoma 9 Melanoma 20 Oral Melanocitoma 0 Melanoma 9 Ocular Melanocitoma 0 Melanoma MÉTODOS Avaliação clínica Em todos os casos possíveis, foram recolhidas informações referentes à identificação do animal (idade, sexo, raça), à localização e ao tamanho da lesão Branqueamento da melanina A abundante melanina presente em alguns dos tumores revelou-se prejudicial para a sua correcta avaliação, quer histopatológica, quer imunohistoquímica. Por esse motivo, foram testadas diferentes técnicas de branqueamento da melanina, com diferentes reagentes, diferentes concentrações e diferentes tempos de actuação. 12

25 Material e Métodos A técnica escolhida foi a que permitiu uma maior preservação dos detalhes citonucleares das células, assim como subsequente técnica imunohistoquímica e a sua interpretação. Assim sendo, o método de branqueamento da melanina utilizado foi baseado no método descrito por Sulaimon et al. (2002) e é em seguida descrito. Após desparafinação e hidratação dos cortes, as lâminas foram imersas 60 minutos numa solução de permanganato de potássio (KMnO4) a 0,25%, posterior passagem por água destilada e nova imersão dos cortes em solução de ácido oxálico (H 2 C 2 O 4 ) a 0,1% durante 8 minutos. Para a remoção total do pigmento, todos os tumores foram sujeitos a um pré-tratamento em microondas (lâminas imersas em solução de tampão citrato, 0,01 M, com ph=6,2) durante 5 minutos a 750 W Estudo histopatológico Todo o material neoplásico recolhido foi fixado em formol a 10%, incluído em parafina sintética Histoplast - Shandon, seguindo a metodologia habitual. Após inclusão, foram realizados cortes de cada um dos tumores com 3 µm de espessura num micrótomo automático Leica RM Em seguida, os cortes foram colocados em lâminas e foram levados à estufa a 37º para secarem. Após secagem, foram desparafinados em xilol, hidratados numa série de álcoois decrescentes, procedendo-se à coloração convencional com hematoxilina-eosina (H-E) para posterior diagnóstico histopatológico. O diagnóstico histopatológico foi realizado em conformidade com os critérios da Organização Mundial de Saúde (OMS) (Goldschmidt et al., 1998), por dois observadores independentes e segundo os mesmos critérios, num microscópio Olympus BH-2. Os critérios que foram avaliados constam de: Tipo celular: fusiforme, epitelióide (redondo) e misto, de acordo com as células predominantes no tumor, segundo Smith et al. (2002); Tamanho do tumor: expresso em centímetros; Localização: Epiderme e Derme, Epiderme ou Derme; Actividade juncional: presente (P) ou ausente (A), segundo Spangler & Kass (2006); Grau de atipia nuclear: escasso (1), moderado (2), acentuado (3), segundo Millanta et al. (2002); Inflamação linfoplasmocitária: presente (P) ou ausente (A). 13

26 Material e Métodos Necrose intratumoral: presente (P) ou ausente (A), segundo Spangler & Kass (2006); Células gigantes: presente (P) ou ausente (A), segundo Spangler & Kass (2006); Proliferação intraepitelial: presente (P) ou ausente (A), segundo Spangler & Kass (2006); Ulceração: presente (P) ou ausente (A); Grau de pigmentação intralesional: ausente (0), escasso (1), moderado (2), acentuado (3); Quantidade de estroma: escassa (1), moderada (2), acentuada (3), segundo Ramos- Vara et al. (2000); Células tumorais intravasculares (CTI): presente (P) ou ausente (A), segundo Ramos-Vara et al. (2000); Índice mitótico (IM): número de mitoses por campo de grande ampliação 40x, realizando-se a contagem em 10 campos, nas diferentes áreas do tumor, segundo Spangler & Kass (2006). Todas as imagens das preparações apresentadas foram captadas numa câmara digital DXM 1200, Nikon, acoplada a um microscópio Eclipse E600 do mesmo fabricante. As imagens foram obtidas por um programa de computador específico, Nikon ACT Estudo imunohistoquímico Para a análise imunohistoquímica foram efectuados cortes seriados de cada um dos tumores com 3 µm de espessura, sendo posteriormente colados em lâminas revestidas com solução de Silane (3-Aminopropyltriethoxysilane, Sigma ), de acordo com a metodologia convencional. De forma a obter uma boa relação sinal/ruído, foram efectuados estudos prévios, onde foram testadas diferentes concentrações dos anticorpos primários, diferentes tempos de incubação e tratamentos de recuperação antigénica até os resultados atingidos serem satisfatórios. Neste estudo, a mácula densa de rim de cão jovem foi utilizada para servir de controlo positivo. No corte usado como controlo negativo, o anticorpo primário foi substituído por tampão fosfato salino (PBS, com ph=7,4). 14

27 Material e Métodos A expressão das ciclooxigenases foi obtida pelo método da estreptavidina biotina peroxidase, utilizando o Sistema de detecção Ultravision de volume Anti-Polivalente (HRP), da Labvision (constituintes a negrito). Os cortes foram desparafinados em xilol durante 15 minutos e hidratados com uma série de álcoois de concentração decrescente (100%, 90%, 80% e 70%). Em seguida, procedeu-se ao branqueamento dos cortes pelo método anteriormente referido. No caso da Cox-1, não foi realizado nenhum pré-tratamento, além do já mencionado aquando do branqueamento dos tumores. No caso da Cox-2, todos os cortes foram submetidos a um pré-tratamento térmico em microondas (lâminas imersas em solução de tampão citrato com ph=6,2) durante 20 minutos a 750 W, para recuperação antigénica. Após tratamento térmico foram deixados a arrefecer à temperatura ambiente por sensivelmente 30 minutos. A inibição das peroxidases endógenas foi conseguida com peróxido de hidrogénio a 3%, durante 30 minutos, sendo o seu excesso removido com PBS, em duas lavagens sucessivas. Os cortes foram então incubados à temperatura ambiente durante 5 minutos com Bloqueador Ultra V. Em seguida, procedeu-se à incubação com os anticorpos primários: Anticorpo policlonal anti-cox-1 (cat. No. PG27, Oxford Biomedical Researche Inc, Oxford, diluído a 1:150 em PBS com ph=7,4) por um período de 60 minutos à temperatura ambiente para a Cox-1 e com o anticorpo monoclonal anti-cox-2 (Clone 33, Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA, na diluição de 1:40 em PBS com ph=7,4) por um período de 48 horas a 4ºC para o caso da Cox-2. Todas as incubações foram feitas em câmara húmida horizontal, Bio Optica. Após o referido período de incubação, o anticorpo primário foi removido com quatro lavagens com tampão PBS e os cortes foram incubados 10 minutos com Soro Anti- Polivalente de Cabra Biotinilado (anticorpo secundário) à temperatura ambiente. Efectuaram-se duas novas lavagens com PBS e nova incubação de 10 minutos com soro Streptavidina Peroxidase à temperatura ambiente, à qual se seguiu uma lavagem. A revelação das lâminas foi efectuada com uma incubação de 10 minutos em solução aquosa de tetra-hidrocloreto de 3,3 -diaminobenzidina (DAB) Novo Castra, na concentração de 1g/dm 3, à qual se adicionou 2 µl de H 2 O 2 (a 30%) por cada mililitro (ml) de solução. Posteriormente, para a realização do contraste nuclear ou contra-coloração, as lâminas foram imersas numa solução de Hematoxilina de Gill, durante 1 minuto, seguindo-se uma 15

28 Material e Métodos lavagem em água corrente morna até as lâminas contrastarem de azul (aproximadamente 10 minutos). Finalmente, as lâminas foram desidratadas, diafinizadas e montadas, utilizando a cola Entellan (Merck ) Avaliação da imunorreactividade A imunorreactividade foi avaliada por dois observadores sem conhecimento prévio do respectivo diagnóstico. A positividade foi indicada pela presença de distinta marcação castanha citoplasmática. Foram avaliados dois parâmetros distintos sendo eles a percentagem de células imunorreactivas (Grau) e a Intensidade da Marcação (Intensidade). Uma gradação semiquantitativa foi realizada na percentagem de células imunorreactivas, enquanto na intensidade de marcação foi efectuada uma avaliação subjectiva. Quadro 2: Avaliação da imunorreactividade das ciclooxigenases. Grau Grau 0 Ausência de imunorreactividade Grau % de células imunorreactivas Grau % de células imunorreactivas Grau 3 50% de células imunorreactivas Intensidade Zero (0) Intensidade negativa Um (+) Intensidade fraca Dois (++) Intensidade moderada Três (+++) Intensidade forte Análise estatística De modo a determinar se o grau da marcação da Cox e a intensidade de imunorreactividade divergiam, dependendo do tipo histológico do tumor (melanocitoma vs melanoma) e possíveis associações entre a imunomarcação e as característics clínicopatológicas avaliadas, foram usados os testes Qui-quadrado (χ 2 ) e análise de variância (ANOVA). Todas as análises estatísticas foram realizadas recorrendo ao sistema SPSS (Statistical Pachage for the Social Sciences, IL, EUA), versão Os valores obtidos foram considerados significativos para um valor de p<0,05. 16

29 Resultados 4. RESULTADOS 4.1. Dados epidemiológicos sobre os animais do estudo Neste estudo foram avaliados um total 40 tumores melanocíticos de canídeos, localizados na pele (n=29, 72,5%), cavidade oral (n=9, 22,5%) e olho (n=2, 5%) Cutâneos Orais Oculares Figura 1: Distribuição racial pelos 3 grupos de lesões melanocíticas. Os animais eram de diferentes raças: Boxer (n=11, 27,5%), Sem Raça Determinada (SRD) (n=10, 25%), Cocker Spaniel (n=7, 17,5%), Caniche (n=4, 10%) e Rottweiler (n=3, 7,5%). Os restantes animais pertenciam às raças: Dobermann (n=1, 2,5%), Epagneul Pequinês ou Pequinois (n=1, 2,5%), Retriever do Labrador (n=1, 2,5%), Rafeiro do Alentejo (n=1, 2,5%) e Cão de Terra Nova (n=1, 2,5%). Os animais eram de ambos os sexos, machos (n=25, 62,5%) e fêmeas (n=15, 37,5%) e as suas idades estavam compreendidas entre os 3 e os 16 anos (média 9,83 anos). Em 5 casos não foi possível determinar a idade do animal Características histopatológicas das amostras tumorais Todos os parâmetros histopatológicos de natureza categórica que foram alvo de avaliação estão descritos no Quadro 3. 17

30 Resultados Quadro 3: Caracterização histopatológica das amostras em estudo. Características histopatológicas Tipo de células Localização Actividade juncional Atipia nuclear Inflamação linfoplasmocitária Necrose intratumoral Células gigantes Proliferação intraepitelial Ulceração Grau de pigmentação intralesional Quantidade de estroma Células tumorais intravasculares Melanomas cutâneos (n=20) Melanocitomas cutâneos (n=9) Melanomas orais (n=9) Melanomas oculares (n=2) n % n % n % n % Fusiforme 8 40% 0 0% 1 11,1% 0 0% Misto 4 20% 0 0% 0 0% 1 50% Epitelióide 8 40% 9 100% 8 88,9% 1 50% Epiderme 0 0% 4 44,4% Derme 5 15% 0 0% Ambas 15 75% 5 55,6% Presente 11 55% 8 88,9% Ausente 9 45% 1 11,1% % 9 100% 0 0% 0 0% % 0 0% 6 66,7% 1 50% % 0 0% 3 33,3% 1 50% Presente 8 40% 5 55,6% 4 44,4% 2 100% Ausente 12 60% 4 44,4% 5 55,6% 0 0% Presente 6 30% 0 0% 6 66,7% 1 50% Ausente 14 70% 9 100% 3 33,3% 1 50% Presente 4 20% 0 0% 4 44,4% 1 50% Ausente 16 80% 9 100% 5 55,6% 1 50% Presente 8 40% 6 66,7% Ausente 12 60% 3 33,3% Presente 11 55% 0 0% 9 100% 2 100% Ausente 9 45% 9 100% 0 0% 0 0% % 0 0% 6 66,7% 0 0% 1 0 0% 0 0% 2 22,2% 0 0% % 1 11,1% 1 11,1% 1 50% % 8 88,9% 0 0% 1 50% % 0 0% 6 66,7% 1 50% % 8 88,9% 3 33,3% 1 50% 3 1 5% 1 11,1% 0 0% 0 0% Presente 4 20% 0 0% 5 55,6% 0 0% Ausente 16 80% 9 100% 4 44,4% 2 100% Nos melanomas cutâneos, os tipos celulares fusiforme e epitelióide foram os mais observados, ambos representados em 40% dos casos. Nenhum tumor se limitou à epiderme, sendo predominante a sua localização a nível da epiderme e derme, simultaneamente. A presença de actividade juncional e ulceração verificou-se em pouco mais de metade dos casos (55%). O grau 2 ou moderado de atipia nuclear foi o predominante, tal como aconteceu quanto ao grau de pigmentação intralesional e à quantidade de estroma. A ausência de inflamação, necrose, células gigantes, proliferação intraepitelial e células tumorais intravasculares (CTI) foi notória na maioria das amostras. Nos 9 melanocitomas cutâneos analisados, todos apresentaram morfologia celular do tipo epitelióide e atipia nuclear de grau 1. Por outro lado, a ausência de localização do tumor 18

31 Resultados exclusivamente na derme, necrose, células gigantes, ulceração e CTI observou-se na totalidade dos casos. 88,9% das amostras revelaram presença de actividade juncional, grau de pigmentação acentuado e quantidade de estroma moderada. Inflamação e proliferação intraepitelial estiveram também presentes na maioria dos tumores. Quanto aos melanomas orais, notou-se um predomínio acentuado (88,9%) do tipo celular epitelióide. A atipia nuclear foi maioritariamente de grau 2 ou moderado, enquanto a quantidade de estroma foi escassa na grande parte das amostras, não se observando nenhum caso com quantidade de estroma acentuada. De notar também a quantidade de tumores amelânicos, representados em 66,7% do total da amostra de melanomas orais e a presença de ulceração em 100% das amostras tumorais. A presença de necrose e CTI evidenciou-se na maioria dos casos. Contrariamente, a ausência de inflamação e células gigantes foi superior numa sensível maioria das amostras. A avaliação dos melanomas oculares restringiu-se a uma amostra de 2 tumores. Os tipos celulares misto e epitelióide foram os observados. O grau de atipia 1 ou escasso esteve ausente nos dois casos. Enquanto a presença de inflamação e de ulceração se verificou nas duas amostras, a presença de CTI não se verificou em nenhuma. O grau de pigmentação intralesional variou de moderado a acentuado e a quantidade de estroma foi escassa num caso e moderada no outro. Necrose intratumoral e células gigantes estiveram presentes em metade da amostra e ausentes na outra metade. As características que constituem variáveis contínuas são relatadas em seguida, nomeadamente a idade dos animais, o tamanho e o IM tumorais. Nos 9 melanocitomas cutâneos a informação relativa à idade foi obtida em 6 casos. Os animais tinham entre os 7 e os 11 anos de idade com um valor médio de 9,50 anos (±1,63 anos). Relativamente ao tamanho, o seu valor médio foi de 2 cm (±7,45 cm), com mínimo de 1 e máximo de 23 cm. O IM variou entre 1 e 12 mitoses por 10 campos de grande ampliação com média de 2 mitoses (±3,52 mitoses). Nos 20 melanomas cutâneos a média de idade dos animais foi de 9,39 anos (± 3,11 anos), variando entre os 3 anos até aos 14. A informação sobre o tamanho da neoplasia esteve disponível para 19 das amostras. O tamanho médio dos melanomas cutâneos foi de 2,86 cm (± 1,89 cm), sendo o mínimo de 1 cm e o máximo de 9 cm. O valor médio do IM foi de 12,15 mitoses por 10 campos aleatórios de grande ampliação, com um desvio padrão de mais ou menos 11,25 mitoses (mínimo de 2 e máximo de 44). 19