Anticorpo monoclonal de ratinho pronto a usar, fornecido na forma líquida num tampão com proteína estabilizadora e 0,015 mol/l de NaN 3.
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- Lúcia Andrade Sales
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1 FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Progesterone Receptor Ready-to-Use (Link) Referência IR068 Finalidade Sinónimo do antigénio Resumo e explicação Reagente fornecido Para utilização em diagnóstico in vitro. O FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Progesterone Receptor,, Ready-to-Use, (Link), é indicado para utilização em imuno-histoquímica em conjunto com o kit de visualização EnVision FLEX+, High ph e com equipamentos Autostainer Link para a deteção semiquantitativa do recetor de progesterona humano em carcinomas da mama humanos, impregnados em parafina e fixados em formal. Este anticorpo marca as células positivas para o recetor de progesterona e é útil na avaliação do estado do recetor de progesterona em carcinomas da mama humanos. A interpretação clínica de qualquer coloração ou da sua ausência deve ser complementada com estudos morfológicos utilizando controlos adequados e deve ser avaliada no contexto do historial clínico do doente e através de outros testes de diagnóstico por um patologista qualificado. PR O papel dos recetores da hormona esteroide no cancro da mama é bem conhecido (1,2). A ausência do recetor de estrogénio ER e do recetor de progesterona PR antecipa uma recorrência precoce e uma baixa possibilidade de sobrevivência dos doentes com cancro da mama (3-6). Além disso, a presença de ER e PR nos tumores prevê a probabilidade de a doente beneficiar da terapia com tamoxifeno e outras terapias endócrinas relacionadas. A medição de ER e PR pode ser determinada semiquantitativamente utilizando o método IHC ou quantitativamente utilizando DCC ou EIA. A correlação entre as avaliações semiquantitativa e quantitativa de PR variou entre 73 e 91%, dependendo do laboratório e do anticorpo utilizado (7-9). Consulte as General Instructions for Immunohistochemical Staining (Instruções gerais para coloração imunohistoquímica) da Dako ou as instruções do sistema de deteção quanto aos procedimentos de IHC para obter informações sobre os seguintes aspetos: 1) Princípio do procedimento, 2) Materiais necessários, mas não fornecidos, 3) Conservação, 4) Preparação das amostras, 5) Procedimento de coloração, 6) Controlo de qualidade, 7) Resolução de problemas, 8) Interpretação da coloração, 9) Limitações gerais. Anticorpo monoclonal de ratinho pronto a usar, fornecido na forma líquida num tampão com proteína estabilizadora e 0,015 mol/l de NaN 3. Clone: PgR 636 (10) Isotipo: IgG1, kappa Imunogénio Forma A recombinante total, fixada em formol, do recetor de progesterona humano (10) Especificidade Demonstrou-se que o Anti-PR, PgR 636 reage com as formas PR-A e PR-B através da análise Western Blot de extratos de células inteiras e que reage com PR livre e ligado à hormona (10). O epítopo foi mapeado em relação ao domínio terminal amino partilhado pelo PR-A e PR-B. Precauções 1. Para utilização em diagnóstico in vitro. 2. Para utilizadores profissionais. 3. Este produto contém azida de sódio (NaN 3), uma substância química altamente tóxica na forma pura. Em situações de concentração do produto, embora não sendo classificada como perigosa, a azida de sódio pode reagir com as canalizações de chumbo e de cobre, formando acumulações de azidas metálicas altamente explosivas. Adicionar água abundantemente ao eliminar o produto para evitar a acumulação de azida metálica na canalização. 4. Tal como com qualquer produto de origem biológica, deverão seguir-se procedimentos de manuseamento adequados. 5. Usar equipamento de proteção pessoal adequado para evitar o contacto com a pele e os olhos. 6. A solução não utilizada deverá ser eliminada em conformidade com as regulamentações locais, nacionais e comunitárias. ( ) PT_004 p. 1/5
2 Conservação Preparação das amostras incluindo materiais necessários, mas não fornecidos Procedimento de coloração incluindo materiais necessários, mas não fornecidos Interpretação da coloração Limitação específica do produto Características de desempenho Conservar entre 2 e 8 C. Não utilizar após o fim d a data de validade impressa no frasco. Se os reagentes forem conservados em condições diferentes das especificadas, o utilizador deverá verificar essas mesmas condições. Não existem sinais óbvios que indiquem a instabilidade deste produto. Por isso, devem processar-se controlos positivos e negativos simultaneamente com as amostras do doente. Caso se observe uma coloração inesperada que não possa ser explicada pela variação nos procedimentos laboratoriais e se suspeite da existência de um problema com o anticorpo, contactar a Assistência técnica Dako. Cortes de parafina: o anticorpo pode ser utilizado para marcar cortes de tecido impregnados em parafina e fixados em formol. As amostras de tecido devem ser cortadas em secções de aproximadamente 4 µm. Pré-tratamento: é necessário proceder ao pré-tratamento de cortes de tecido impregnados em parafina e fixados em formol. Obtêm-se resultados ótimos ao pré-tratar os tecidos com HIER utilizando a solução EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (referências K8000/K8004) diluída. A desparafinação, a reidratação e a recuperação antigénica podem ser efetuadas no Dako PT Link (referências PT100/PT101/PT200). Para informações detalhadas, consulte o manual do utilizador do PT Link. Para o PT Link, devem ser utilizados os seguintes parâmetros: temperatura de pré-aquecimento: 65 C; temperatura e tempo da recuperação antigé nica: 97 C durante 20 (±1) minutos; arrefecer até aos 65 C. Retirar o suporte de lâminas do tanque PT e me rgulhar, imediatamente, as lâminas num frasco/tanque (por exemplo, PT Link Rinse Station [referência PT109]) contendo EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (referência K8007) diluído e à temperatura ambiente. Deixar as lâminas no Wash Buffer durante 1 a 5 minutos. Os cortes de tecido não devem secar durante o pré-tratamento nem durante o procedimento de coloração imunohistoquímica seguinte. Para uma maior aderência das secções de tecido às lâminas de vidro, recomenda-se a utilização de FLEX IHC Microscope Slides (referência K8020). Após a coloração, os cortes têm de ser desidratados, limpos e montados com um meio de montagem permanente. Visualização: o sistema de visualização recomendado é o EnVision FLEX+, High ph (Link) (referência K8002). Programa: as etapas de coloração e os tempos de incubação são programados previamente no software Autostainer Link. O volume recomendado de aplicação de reagente é de 1 x 200 µl ou 2 x 150 µl por lâmina. Consultar o guia do utilizador do Autostainer Link para obter instruções detalhadas sobre a colocação das lâminas e dos reagentes. Se os protocolos não estiverem disponíveis na plataforma Autostainer Link 48 utilizada, contacte a Assistência técnica Dako. Todas as etapas de incubação devem ser realizadas à temperatura ambiente. Contrastação: o contraste recomendado é o EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (referência K8008). É recomendado um meio de montagem não aquoso e permanente. Controlos: os controlos positivos e negativos devem ser processados em simultâneo com o mesmo protocolo das amostras do doente. Idealmente, os controlos positivos devem incluir tecido do carcinoma da mama de baixa expressão de PR. Em alternativa, pode utilizar-se colo do útero benigno. As células/estruturas devem apresentar padrões de reação conforme os descritos para este tecido na secção "Caraterísticas de desempenho" em todas as amostras positivas. O reagente de controlo negativo recomendado é o FLEX Negative Control, Mouse (Link) (referência IR750). O padrão de coloração celular é. Caso seja observada, a marcação citoplasmática deve ser considerada não específica. Um resultado positivo define-se com base na coloração de 1% das células tumorais, com qualquer intensidade de coloração. Isto é consistente com o ponto de corte recomendado pela ASCO/CAP de 1% de células tumorais positivas para avaliação positiva (11). 1. Os resultados falsos negativos poderão ser causados pela degradação do antigénio presente nos tecidos ao longo do tempo. As amostras devem ser coradas num período de 2 meses após a montagem dos tecidos nas lâminas, quando conservadas à temperatura ambiente (12). 2. Os linfócitos e as células estromais podem exibir uma coloração positiva com o anticorpo FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human PR clone PgR 636 e não devem ser interpretadas nem contadas como células tumorais de coloração PR. 3. Para resultados ótimos e reprodutíveis, a proteína PR requer a recuperação do alvo quando os tecidos forem rotineiramente fixados (formol neutro tamponado) e impregnados em parafina. 4. Não foi validada a utilização do Dako Anti-PR, em tecidos com outros agentes de fixação além do formol. Precisão: foram colhidos para análise cortes em série de cada um de 12 blocos diferentes impregnados em parafina e fixados em formol de carcinoma da mama, representando um intervalo dinâmico de expressão de PR. Foram efetuadas análises da seguinte forma: Precisão intraensaio: seguindo o protocolo padrão do EnVision FLEX+, High ph, foram corados três cortes de cada bloco de tecido com Anti-PR,. Ao mesmo tempo, corou-se um corte de cada bloco com um reagente de controlo negativo. Precisão interensaio: corando um corte de cada bloco de tecido, o procedimento apresentado acima foi repetido em cinco dias não consecutivos. Ao mesmo tempo, corou-se um corte de cada bloco de tecido com um reagente de controlo negativo. Precisão interinstrumento: corando um total de três cortes de cada bloco de tecido, o procedimento acima foi realizado em três equipamentos Autostainer diferentes por três operadores diferentes. Ao mesmo tempo, corouse uma lâmina de cada bloco de tecido com um reagente de controlo negativo. ( ) PT_004 p. 2/5
3 As experiências de precisão com o Anti-PR,, produziram resultados consistentes com as análises intraensaio, interensaio e interinstrumento. Foram mantidas condições de análise consistentes ao longo do estudo e os reagentes foram conservados a 2-8 C en tre cada análise. Tecidos normais: a tabela 1 contém um resumo da imunorreatividade do Anti-PR, no painel de tecidos normais recomendado. Todos os tecidos foram fixados em formol, impregnados em parafina e corados com Anti-PR,, de acordo com as instruções do folheto informativo. Observou-se uma coloração citoplasmática com o Anti-PR, em vários elementos do tecido diferentes, incluindo o epitélio, o estroma, as células intersticiais e as células inflamatórias. Apesar da observação de coloração citoplasmática, esta não tem um valor diagnóstico de acordo com a finalidade deste anticorpo. Tabela 1: Resumo da reatividade do tecido normal ao Anti-PR, Tipo de tecido (n.º testados) Elementos de tecido positivos Tipo de tecido (n.º testados) Elementos de tecido positivos Suprarrenal (3) 1/3 células na região glomerulosa Nervos, periféricos (3) 0/3 (50%), 1/3 células na região glomerulosa (50%), Ovários (3) 3/3 células estromais (50-70%), Medula óssea (3) 0/3 Pâncreas (3) 2/3 ilhotas de Langerhans (50-90%), Mama (3) 2/3 células epiteliais glandulares (50-90%), Paratiroide (3) 3/3 células epiteliais glandulares (1-10%), Cerebelo (3) 0/3 Pituitária (3) 3/3 células glandulares pituitárias (1-40%), Cérebro (3) 1/3 células meníngeas (100%), Próstata (3) 3/3 células estromais (30-80%), Colo do útero (3) 3/3 células epiteliais (50-90%), Glândula salivar (3) 3/3 células epiteliais glandulares (<1-60%), 3/3 estroma, incluindo células Pele (3) 0/3 inflamatórias (50%), Cólon (3) 1/3 células linfoides/inflamatórias (10%), Intestino delgado (3) 3/3 células estromais e inflamatórias (30-50%), 1/3 células linfoides/inflamatórias Baço (3) 0/3 (10%), Esófago (3) 1/3 células estromais (50%), Estômago (3) 1/3 células intersticiais (20%), Rim (3) 3/3 células intersticiais (1-5%), Testículos (3) 3/3 células intersticiais (5-80%), Fígado (3) 0/3 Timo (3) 0/3 Pulmão (3) 2/3 células intersticiais (1-10%), Tiroide (3) 0/3 2/3 células inflamatórias (1-10%), Amígdalas (3) 0/3 Células mesoteliais (2) 0/2 Útero (2) 2/2 células epiteliais glandulares (100%), Músculo, cardíaco (3) 3/3 miócitos (30%), peri- 2/2 células estromais miometriais (100%), Músculo, esquelético (3) 0/3 Comparação de métodos: o teste Monoclonal Mouse Anti-Human PR, foi efetuado com o EnVision FLEX+ e classificado de acordo com as diretrizes da ASCO/CAP (corte de 1%) (11). O teste Anti-PR (Clone 1294) foi efetuado utilizando o kit ER/PR pharmdx da Dako e classificado de acordo com as diretrizes de classificação da Allred descritas no folheto informativo. Os dados de comparação de métodos são apresentados na tabela 2. Utilizando as respetivas diretrizes de classificação, o teste de Monoclonal Mouse Anti-Human PR, mostrou-se em concordância com o componente de anticorpo PR do kit ER/PR pharmdx da Dako, exibindo valores para concordância geral, positiva e negativa de 94,5%, 95,8% e 93,1%, respetivamente. A tabela 3 apresenta a comparação de ambos os ensaios quando classificados de acordo com as diretrizes da ASCO/CAP. Tabela 2: Concordância entre Anti-PR, (ASCO/CAP) e o componente Anti-PR do kit ER/PR pharmdx (Allred) Componente Anti-PR do kit ER/PR pharmdx Monoclonal Mouse Anti- Human PR, Positivo Negativo Total Percentagem de concordância positiva = 95,8% (95% CI: 91,1-96,8) Percentagem de concordância negativa = 93,1% (95% CI: 90,5-96,7) Percentagem de concordância geral = 94,5% (95% CI: 90,8-96,8) ( ) PT_004 p. 3/5
4 Tabela 3: Concordância entre Anti-PR, (ASCO/CAP) e o componente Anti-PR do kit ER/PR pharmdx (ASCO/CAP) Componente Anti-PR do kit ER/PR pharmdx Monoclonal Mouse Anti- Human PR, Positivo Negativo Total Percentagem de concordância positiva = 99,1% (95% CI: 93,0-98,0) Percentagem de concordância negativa = 93,3% (95% CI: 92,8-98,0) Percentagem de concordância geral = 96,2% (95% CI: 93,0-98,0) Reprodutibilidade interlaboratorial: o teste de reprodutibilidade do Anti-PR, foi efetuado em três laboratórios de análise ao longo de cinco dias não consecutivos em 21 amostras únicas de cancro da mama, e classificado de acordo com as diretrizes da ASCO/CAP (corte de 1%), para um total de 315 avaliações. As tabelas 4, 5 e 6 apresentam informações relacionadas com a reprodutibilidade do ensaio entre os locais. Os cálculos de percentagem de concordância geral, positiva média e negativa média apoiam os resultados altamente reproduzíveis do ensaio PR (PgR 636) quando utilizados para a determinação do estado de PR num ambiente clínico. Tabela 4: Reprodutibilidade interlaboratorial do Anti-PR, entre o local 1 e o local 2 Local 2 Local 1 Positivo Negativo Total Percentagem de concordância positiva média = 96,5% Percentagem de concordância negativa média = 95,8% Tabela 5: Reprodutibilidade interlaboratorial do Anti-PR, entre o local 1 e o local 3 Local 3 Local 1 Positivo Negativo Total Percentagem de concordância positiva média = 99,2% Percentagem de concordância negativa média = 98,9% Tabela 6: Reprodutibilidade interlaboratorial do Anti-PR, entre o local 2 e o local 3 Local 3 Local 2 Positivo Negativo Total Percentagem de concordância positiva média = 95,7% Percentagem de concordância negativa média = 94,7% ( ) PT_004 p. 4/5
5 Referências 1. Henderson C.Breast cancer. In: Harrison s principles of internal medicine, 12th edition, Wilson JD, Braunwald E, Isselbacher KJ, Petersdorf RG, Martin JB, Fauci AS, Root RK (eds). McGraw-Hill, Inc. New York, Fuqua SAW. Estrogen and progesterone receptors and breast cancer. Diseases of the Breast, Harris et al, eds. Lippincott-Raven, p McGuire WL, Clark GM. The prognostic role of progesterone receptors in human breast cancer. Sem Oncol 1983;10:2. 4. Clark GM, McGuire WL, Hubay CA, Pearson OH, Marshall JS. Progesterone receptors as prognostic factor in stage II breast cancer. N Engl J Med 1983;39: Ravdin PM, Green S, Dorr TM, McGuire WL, Fabian C, Puch RP, et al. Prognostic significance of progesterone receptor levels in estrogen receptor-positive patients with metastatic breast cancer treated with tamoxifen: Results of a prospective southwest oncology group study. JCO 1992;10: Chevallier B, Heintzmann F, Mosseri V, Dauce JP, Bastit P, Graic Y, Brunelle P, Basuyay JP, Comoz M, Asselain B. Prognostic value of estrogen and progesterone receptors in operable breast cancer: Results of a univariate and multivariate analysis. Cancer 1988; 62: Page DL, Jensen RA, Simpson JF. Routinely available indicators of prognosis in breast cancer. Breast Can Res Treat 1998;51: Allred DC, Harvey JM, Berardo M, Clark GM. Prognostic and predictive factors in breast cancer by immunohistochemical analysis. Mod Pathol 1998;11: Fitzgibbons PL, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, et al. Prognostic factors in breast cancer. College of American Pathologists consensus statement. Arch Pathol Lab Med 2000;124: Press M, Spaulding B, Groshen S, Kaminsky D, Hagerty M, Sherman L, et al. Comparison of different antibodies for detection of progesterone receptor in breast cancer. Steroids 2002; 67: Hammond MEH, Hayes DF, Dowsett M, Allred C, Hagerty KL, Badve S, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations for Immunohistochemical Testing of Estrogen and Progesterone Receptors in Breast Cancer. Arch Pathol Lab Med 2010;134: Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A ( )- CLSI, 940 West Valley Road, Suite Wayne, PA USA Edição 11/15 ( ) PT_004 p. 5/5
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