Júlia Maria Pavan Soler

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1 MAE54-Genética de Populações MAE5757-Métodos Estatísticos em Genética e Genômica Júlia Maria Pavan Soler pavan@ime.usp.br IME/USP - Sem/6

2 O genoma é um sistema estruturado/organizado. Duas importantes leis contribuem para a caracterização e organização do genoma: Lei do Euilíbrio de Hardy-Weinberg Lei do Euilíbrio de Ligação Objetivo Como o efeito de um gene pode ser mensurado? Caso: diploide e locos dialélicos Modelos de Efeitos fixos

3 Marcadores Moleculares Pontos de referência no genoma variações comuns/raras na seuência de DNA entre indivíduos Posição conhecida Passíveis de Genotipagem Alu repeat no Chr 8 Padrão de Bandas (eletroforese em gel): +/+ presença do repeat nos dois alelos (pesado) -/+ presença do repeat em somente um alelo -/- ausência do repeat nos dois alelos (leve) 3

4 Marcadores Moleculares - SNPs Single Nucleotide Polymorphisms Chips de informação de marcadores para cada indivíduo 6 SNPs SNP: common variants (MAF>%) Imagem (Scanner) Capacidade: Placas com x8 posições (96 chips por vez) AA Aa aa Genotype calls para cada SNP: X i if aa if Aa if AA

5 Genotipagem de SNPs AA Aa aa Dados da intensidade dos alelos A e a para o SNP rs359 Amostra da população brasileira Referência (verde): dados HapMap Os dados (x,y) podem ser transformados para serem melhor representados: Coordenadas polares: inclinação e distância à origem Rotacionar 45: (x-y) versus ½(x+y) (conhecido como gráfico MA, gráfico de Blend-Altman, semelhante ao gráfico do desvio padrão pela média)

6 Genotipagem de SNPs Organismos Poliplóides: Ploidia k (k+) genótipos Ex. Cana de açúcar: SNP com ploidia 5 A a No gráfico com as intensidades de cada alelo (nucleotídeo): O número de raios define a ploidia (os genótipos): AAAAA, AAAAa,..., aaaaa A posição no raio define o número de réplicas: indivíduo com o genótipo AAAaa sendo ue no loco de SNP pode haver duplicação ou deleção de alelos.

7 Genotipagem de SNPs Transformação de Variáveis Organismos Poliplóides: Ploidia k (k+) genótipos A Distribuição da variável U: multimodal (dados simulados) Projeção dos dados na combinação convexa x+y=: x U k x y a

8 Leis de Segregação de Alelos Euilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) A a P P P aa Pa Aa PAPa AA PA (Falconer e Mackay, 996) Independência entre alelos dentro do loco. Probabilidade de genótipos é descrita em termos de probabilidades alélicas. Euilíbrio de Ligação (LD): independência entre locos A B a b P P P P A B PAPB A b PAPb a B PaPB a b PaPb Independência entre alelos de locos diferentes (haplótipos)

9 Euilíbrio de H-W - Sistema MN (%) MM MN NN Total Greenland Iceland American Whites Falconer & Mackay, 996 O sistema MN em Iceland está em euilíbrio de H-W? # total de alelos = x747=494 # alelos M = (x33)+385=85 p(m)=.5696 p(n)=.434 (estimativa!!) MM MN NN Total O Probab. Estimada E p Pr Refaça o teste para as demais populações. H :? o sistema está em euilíbrio suportando o modo de herança Mendeliano 9

10 Euilíbrio de Hardy-Weinberg Genótipo aa Aa AA Total Trinomial P(aa) P(Aa) P(AA), Distribuição sob E. H-W: Simplex Outras alternativas de teste: - Singer et al., 99 - FBST(Pereira e Stern, 999) - J. Graffelman (8, 5) Aa aa AA aa AA Aa Gráfico ternário com a região de aceitação do teste em função de n dado α=5% (à esuerda) e de α dado n=5 (à direita). Graffelman and Camarena (8), Human Heredity 65:

11 Euilíbrio de Ligação Distribuição dos genótipos Multinomial (8 g.l) Análise no nível de indivíduos (n) bb Bb BB Total aa P(aa,bb) P(aa,Bb) P(aa,BB) P(aa) Aa P(Aa,bb) P(Aa,Bb)* P(Aa,BB) P(Aa) AA P(AA,bb) P(AA,Bb) P(AA,BB) P(AA) Total P(bb) P(Bb) P(BB), P(AA,BB)=P(AB) =[P(A).P(B)+D AB ] ; D AB =P(AB)-P(A)P(B) Distribuição dos haplótipos Multinomial (3 g.l) Análise no nível cromossômico (n) b B Total a P(ab) P(aB) P(a) A P(Ab) P(AB) P(A) Total P(b) P(B), H : D AB *: incerteza sobre o arranjo dos haplótipos (em cis ou trans?) - Teste clássico - Teste da razão de verossimilhanças

12 Euilíbrio de Ligação Distribuição dos genótipos Multinomial (8 g.l) Distribuição dos haplótipos Multinomial (3 g.l) Modelo Saturado ln L ln L PA, PB, D AB Dados Modelo Restrito Euilíbrio de Ligação H : D AB ln L ln L PA, PB, D AB Dados Estatística da razão de verossimilhanças: ln L ln L ~

13 Exemplo: Teste de Deseuilíbrio de Ligação Distribuição de genótipos nos Locos e Loco Loco BB Bb bb Total AA Aa aa Total Estimativas Censuradas dos Parâmetros (eliminando obs AaBb) # haplótipos AB = ()++5=45 # haplótipos ab = +(3)+3 =9 # haplótipos Ab = 5+(5)+3 =38 # haplótipos ab = 3+3+()=46 A a B 45 (.848) 38 (.45) 9 (.835) 46 (.9) b Teste de Independência Clássico Pˆ Dˆ A.553 AB 3.83 ( p.5) Pˆ B (.553)(.4684).3878 estimativas viciadas Concl.?

14 Teste de Deseuilíbrio de Ligação Distribuição de genótipos nos Locos e Loco Loco BB Bb bb Total AA Aa aa Total Estimativas dos Parâmetros com Dados Completos incorporando a incerteza sobre o arranjo dos haplótipos nos casos duplo heterozigoto Algoritmo EM ou uso das informações do HapMap A a P(AB)=()+5+5x)/(9) B b x? Algoritmo EM convergiu em x=.9 Pˆ Dˆ A (3 73/ ) /9 AB ln[ L( P, P, D ) / L( P, P )] 8.89 ( p.799 A B AB.3).555 A B Concl.? Pˆ B

15 Coeficiente de Deseuilíbrio de Ligação D A B P AB P A P B D é uma Medida de Covariância se A está presente X caso contrário E X P( X ) A se B está presente Y caso contrário E XY P( X ; Y ) AB X Y E XY EX EY AB A B E Y P( Y ) B

16 Coeficientes de Deseuilíbrio de Ligação, min, min ' D se D D se D D b a B A B a b A ; r D r b a B A ' D D = r = : Euilíbrio de ligação (independência entre locos) B A AB D (Lewontin, 964; Hill and Weir, 968; Lin, 5)

17 Estrutura do Genoma Eventos de Recombinação (Ligação): Medida de distância citogenética (cm) Material de indivíduo (meiose) Material de indivíduo (meiose) Recombinantes Sem Ligação (Locos Distantes ) Não Recombinantes Ligação (Locos Próximos ) 7

18 Declínio do Deseuilíbrio theta: fração de Recombinação Fontes de Deseuilíbrio (fuga da independência/associação) Ligação Genética Variação Amostral ( deriva em populações finitas) Mutação, Seleção Efeito de Fundador: pop. isolada com único ancestral Estratificação ou Miscigenação (Paradoxo de Simpson): o deseuilíbrio pode ocorrer entre locos não ligados (distantes)

19 Como definir e estimar o efeito de um gene sobre uma variável de interesse?

20 Padrão de Variação Fenotípica Gene (X) Ambiente Fenótipo (Y) Monogênicos Pleiotropia Epistasia (Y,Y ) (G,G ),, Fenótipo (Y) = Gene (X) + Ambiente (E)

21 Padrão de Variação Fenotípica Y n X G G Y n X E E X G G Y n X EE XG G X E XG EG Y n X X X X E E G G G G Y Y X n G Modelos considerando o gene como um fator de efeito fixo sobre Y Modelos mais gerais podem ser definidos com o gene como aleatório! X

22 Mapeamento de Genes Y E Y X Y E Y X Componente Fixo Componente Aleatório Modelado como Efeito Fixo Componente Genético Modelado como Efeito Aleatório Mapear variantes ( genes ) comuns na população Mapear variantes raras, ue expliuem a covariância entre indivíduos (parentesco)

23 Mapeamento de Genes Fator Fixo Y X Dados de pressão arterial (Y) e genótipo de um marcador SNP (X) para uma amostra aleatória de 69 funcionários de uma empresa. Delineamento com Indivíduos não relacionados e variável de interesse uantitativa (delineamento pouco utilizado). Há evidência de algum efeito do SNP sobre o fenótipo Y?

24 Efeito Genético Fator Fixo Modelos ANOVA : fator em três níveis (genótipo do SNP=aa, Aa, AA). Temos graus de liberdade para estudar o efeito do gene (SNP) X ai y i ax - para aa para Aa para AA ai dx para aa para Aa para AA Efeito do Gene na Média de Y X di di e i V E H y V e y i i : a d aa Aa AA i a d a e AA aa a AA aa aa Aa AA aa Aa AA aa Aa AA Aditivo Dominante(+) Dominante(-) d Aa AA aa

25 Modo Recessivo de Herança Modo Dominante de Herança 6 Média Y 6 Média Y a d a a d a Modo Codominante de Herança Média Y a d a

26 Efeito Genético Y Y d a a a a d Modelos Gerais (interpretação?)

27 PS PS M Boxplot of PS by M M Analysis of Variance Source DF SS MS F p Regression Residual Error Total Exemplo Estimação dos Ef Genéticos Y X e X a d MM mm PS = Xa Xd Predictor Coef SE Coef T p Constant Adit Domi ˆ mm aˆ 6.3 dˆ ˆ Mm 54. ˆ 6.39 ˆ MM 77.6

28 LAB: Exercício de Simulação de Dados e Estimação de Efeitos Genéticos Gerar dados de marcadores SNP em E. H-W: X i se aa se Aa se AA X i ~ Binomial n ; p P( A) P P P X i ( X i p X p i p) ( p) Gerar variáveis uantitativas Y tal ue: Y ij ~ N( j, ² ); j = + a X a + d X d Realizar análises dos dados

29 LAB: Resultados para n=6, m= e 5 runs Y ij ~ N( j, ²=4 ) j = + 5 X aj ; d=

30 LAB: Efeitos Genéticos (Fixos) Ajustar modelos para estimar o efeito do marcador molecular (variável SNP: número de alelos A ) y j = + a X a + d X d + e ; e ij ~ N( j, ² ) Parametrização : modelo com efeito aditivo e de dominância do marcador X a = (aa), (Aa), (AA) X d = (aa), (Aa), (AA) E(Y aa)= aa = E(Y Aa)= Aa = + a + d E(Y AA)= AA = + a a = ( AA - aa )/ d = Aa ( AA + aa )/ = aa

31 LAB: Efeitos Genéticos (Fixos) Ajustar modelos para estimar o efeito do marcador molecular (variável SNP: número de alelos A ) y j = + a X a + d X d + e ; e ij ~ N( j, ² ) Parametrização : modelo com efeito aditivo e de dominância do marcador X a = - (aa), (Aa), (AA) E(Y aa)= aa = - a E(Y Aa)= Aa = + d E(Y AA)= AA = + a a = ( AA - aa )/ d = Aa ( AA + aa )/ = ( AA + aa )/ X d = (aa), (Aa), (AA)

32 LAB: Efeitos Genéticos (Fixos) Ajustar modelos para estimar o efeito do marcador molecular (variável SNP: número de alelos A ) y j = + a X a + d X d + e ; e ij ~ N( j, ² ) Parametrização 3: modelo com efeito linear e uadrático X a = (aa), (Aa), (AA) E(Y aa)= aa = E(Y Aa)= Aa = + a + d E(Y AA)= AA = + a + 4d a =? d =? X d = (aa), (Aa), 4 (AA) Como os parâmetros a e d estão definidos?

33 LAB: Efeitos Genéticos (Fixos) Ajustar modelos para estimar o efeito do marcador molecular (SNP: var. uantitativa discreta número de alelos de risco) y j = + a X a + e ; e ij ~ N( j, ² ) Parametrização 4: Modelo com somente o efeito linear/aditivo do marcador X a = (aa), (Aa), (AA) E(Y aa)= aa = E(Y Aa)= Aa = + a Mais usada! a = AA - Aa E(Y AA)= AA = + a Solução de mínimos uadrados (ou máxima verossimilhança) ˆ ˆ a AA ˆ aa X Y ai i a X a' X a X a' Y ˆ Y ˆ a X a ( n ) s nx X a Y

34 LAB: Efeitos Genéticos (Fixos) Ajustar modelos para estimar o efeito do marcador molecular (SNP: fator em 3 níveis de resposta) y j = + X + X + e ; e ij ~ N( j, ² ) Parametrização 5: genótipo homozigoto como casela de referência X = (aa), (Aa), (AA) E(Y aa)= aa = X = (aa), (Aa), (AA) E(Y Aa)= Aa = + E(Y AA)= AA = + = Aa - aa = AA aa = aa

35 Fenótipo (Y) uantitativo Efeito Genético de um Marcador Molecular (X) Modelos de Regressão (ANOVA) Outros modelos a serem testados: Valores de X G Genótipo H : EY G X G Modelo AA Aa aa EfeitoDominante Efeito Recessivo H : EY G Efeito Aditivo Efeito Aditivo - Efeito Aditivo,5 uso de um grau de liberdade para testar o efeito do gene Testes de H : = : Estatística F, Estatística Razão de Verossimilhanças

36 Efeitos Genéticos Ajuste de Modelos de Regressão para dados de um mapa ou plataforma de marcadores moleculares Modelo Genético Modelo Esporádico : H H : E Y GM GM : E Y X g Testar o Efeito Linear do Marcador via Estatísticas F: MMod F ~ F g. l. Mod; g. l. Res M Re s Testes via Estatísticas da Razão de Verossimilhança (Estatísticas Lod Score) RV Lod log L L L ˆ ln ln ~ p ˆ ˆ L ˆ L L ˆ ˆ Estatística LogScore: mudança de escala na estatística razão de verossimilhanças p: diferença no número de parâmetros sob o modelos completo (H) e reduzido (H)

37 Tabela de ANOVA H:... k F.V. g l S M F p Modelo k- n j ( y y j ) SMod / (k-) MMod / MRes Resíduo N-k TOTAL N- ij ij ( y ij y j ( y ij y) ) SRes / (N-k) F MMod M Re s ~ F k ; N k Suposições clássicas (análise de diagnóstico?): normalidade, homocedasticidade e independência

38 Modelos Genéticos Euivalência entre Estatísticas n n y j y j STotal y j y j SR ˆ Resíduo j j S S Total Residual n/ Estatística Lod Score: Lod log Sob condições de regularidade válidas Estatística Razão de Verossimilhanças: RV ln Lod log e.7 RV Lod 4.6 Lod log e Estatística F: F n k k S S S Total Resíduo Resíduo n k k / n

39 Mapas e Plataformas de Marcadores Passo : Modelos Uni-Locos no Mapeamento Genético Testar o efeito de cada marcador separadamente Modelo Genético Modelo Esporádico : H H g : E Y GM GM : E Y X g ; g,..., G Problema de alta dimensão Problemas: - Definir como o efeito do loco será testado (com ou g.l. no caso de locos bialélicos) - Adotar um nível de significância global para o conjunto de locos testados: correção para múltiplos testes (Bonferroni, FDR) - GWAS (Genome Wide Association Studies): adotar α c = -8

40 Gráfico Manhattan Estatísticas Lod Score (ou F, ou AIC, ou log(p-valor) ) na ordenada e a posição de marcadores na abscissa Mapeamento da pressão basal: mapa com 3 marcadores Testes com g.l. e dados completos. E Y G X g X,, g Chr4 - Marcador NPYa Chr Marcadores R56 R46

41 Gráfico Manhattan Chr MTPB R36 Chr4 TGFAA Mapeamento da pressão arterial sistólica: mapa com 3 marcadores Testes com g.l. e dados completos. E Y G X g X,, g

42 Mapeamento Genético Liu, Ajuste de modelos unilocos para estudar o efeito de milhares de SNPs Poucos sinais significantes estudar efeitos mais gerais (multilocos e interação com o ambiente, pleiotropia)

43 Modelos para Pares de Locos Epistasia Gene (X) Ambiente Fenótipo (Y) Genótipos Conjuntos de Múltiplos Locos Loco E G G G Loco G G G Y G G G G M M M M* M Alternativas de Análise: Análise por Loco Análise por Haplótipo (conhecer/estimar a fase haplotípica) Análise por Loco: considerar os efeitos principais de cada loco (aditivo e de dominância) bem como os efeitos de interação entre pares de locos ( Epistasia ) G G G

44 Modelos para Pares de Locos a a : H Efeitos Aditivos Marginais Efeito de Interação (Aditivo/Aditivo)

45 Modelos para Pares de Locos Como pesuisar o espaço Biloco? M odelo Esporádico (Nulo) Modelo Loco Modelo Loco M odelo Aditivo (Conjunto) * M odelo Completo(Epistasia) M M M M M G Y E M G Y E M G Y E M M G E Y M M M M G Y E 3 Testes para uma seüência de Pares de Locos Teste do efeito de interação (com g.l.) pode-se adotar testes com ou 3 g.l 3 Comparação do modelo aditivo conjunto com cada modelo de um único Loco 3

46 Modelos para Pares de Locos Efeito de Epistasia Genótipo Ambiente Fenótipo Interação entre Genes Y AA Aa aa Y AA Aa aa bb Bb BB Efeitos Genéticos Aditivos bb Bb BB Efeitos Genéticos Não Aditivos

47 Modelos para Pares de Locos (Kao and Zeng, ) y a X a d X d a * * X a d X d i aa X a X a i dd X d X d Loco Loco Epistasia ef. aditivo Epistasia ef. de dominância i * ad X a X * d i da X d X a Epistasia ef. Aditivo com ef. dominância Loco e Loco em Euilíbrio de Ligação (LD) Modelo com Locos: 8 graus de liberdade (Fatorial 3²)

48 Mean of Traco Mean Efeito de Epistasia Gráficos de Perfis de Médias Main Effects Plot (data means) for Traco Interaction Plot (data means) for Traco 3 GenoL GenoL 6 4 GenoL GenoL Há evidência da existência de efeito de interação entre os locos e na variação da resposta Y?

49 Ajuste do Modelo de Epistasia Traco = 8, + 3,9 a -,44 d + 4,3 a -, d -,88 aa +,3 ad -,76 da -,4 dd Predictor Coef SE Coef T P Constant 7,966,367 56,73, a 3,96,4554 8,56, d -,437,6334 -,7,945 a 4,84,4554 9,6, d -,99,6334 -,7,863 aa -,879,4963 -,8,86 ad,8,99,3,893 da -,759,99 -,8,934 dd -,4,67 -,,9 S =, R-S = 9,% R-S(adj) = 9,3% Analysis of Variance Source DF SS MS F P Regression 8 889,5,3 6,, Residual Error 9 87,7,96 Total ,

50 Mean of traco Mean Efeito de Epistasia Gráficos de Perfis de Médias do Traço Main Effects Plot (data means) for traco Interaction Plot (data means) for traco GenoL GenoL GenoL GenoL Há evidência da existência de efeito de interação entre os locos e?

51 Ajuste do Modelo de Epistasia traco = 3,6 + 3,5 a +,57 d + 3,75 a -,544 d + 4, aa,876 ad +,45 da +,3 dd Predictor Coef SE Coef T P Constant 3,685,95 46,7, a 3,59,49 8,37, d,575,583,98,33 a 3,7476,49 8,94, d -,544,583 -,93,353 aa 4,55,4568 8,99, ad -,8756,8385 -,4,99 da,446,8385,9,77 dd,36,66,,66 S =,9965 R-S = 96,% R-S(adj) = 95,7% Analysis of Variance Source DF SS MS F P Regression 8 87,47 5,93 78,33, Residual Error 9 73,87,8 Total 99 88,33

52 Exercício no R: Gerar n=5 observaçõesde dados genotípicos e fenotípicos Loco: PA=.5 PT=.5 PC=.45 PG=.45 Loco: PA=.5 PT=.5 PC=.35 PG=.35 mi=65, a= 5, a=, aa= 5, d=, d=, dd=, ad=, da=, s=8 Médias amostrais [,] [,] [,3] [,] [,] [3,] > fit <- glm(fenotipos[,3] ~ ad + ad + adad, x=true) Coefficients Estimate Std. Error t value Pr(> t ) (Intercept) < e-6 *** ad e-6 *** ad * adad < e-6 *** Signif. codes: ***. **. *.5..

53 Fenótipo Exercício no R: Gerar n=5 observaçõesde dados genotípicos e fenotípicos Loco: PA=.5 PT=.5 PC=.45 PG=.45 Loco: PA=.5 PT=.5 PC=.35 PG=.35 mi=65, a= 5, a=, aa= 5, d=, d=, dd=, ad=, da=, s=8 Perfis médios - Efeitos genéticos epistáticos Loco

54 Modelos Genéticos Gerais Controle de ualidade dos Dados Modelos Uniloco Univariados: definir os efeitos genéticos e o nível de significância conjunto (correção para múltiplos testes) Modelos Multilocos Univariado: Como pesuisar o espaço multilocos (locos em LD)? Como selecionar o conjunto ótimo de locos (busca exaustiva, condicional ou conjunta)? Como definir os efeitos multilocos (modelos aditivos, epistáticos, haplotípicos)? Modelos Multivariados Modelos de efeitos genéticos aleatórios ou mistos