Aula de Bioquímica I. Exemplos de Mecanismos de Catálise Enzimática

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1 Aula de Bioquímica I Tema: Exemplos de Mecanismos de Catálise Enzimática Prof. Dr. Júlio César Borges Depto. de Química e Física Molecular DQFM Instituto de Química de São Carlos IQSC Universidade de São Paulo USP borgesjc@iqsc.usp.br

2 Enzimas Proteolíticas: Proteases Renovação de proteínas - Reciclagem de Aminoácidos novas proteínas - Energia Livre a partir de aminoácidos - Digestão Regulação celular - Desenvolvimento - Coagulação sanguínea - Inflamação Hidrólise de ligações peptídicas - Adição de uma molécula de água - t 1/2 para hidrólise em ph neutro 10 a 1000 anos Ressonância Carbono da Carbonila é menos eletrófilo Menor suscetibilidade a ataque nucleófilo

3 SERINA-PROTEASES Mecanismo envolve a participação de uma Ser particularmente reativa - Funciona como um poderoso nucleófilo para atacar o C da Carbonila da ligação peptídica - Catálise covalente formação de um intermediário ligado à Enzima

4 SERINA-PROTEASES Quimotripsina - Cliva ligações Peptídicas do lado carboxílico de aminoácidos hidrófobos volumosos Sequência substrato da Quimotripsina Nomenclatura de especificidade para interações Proteases-substrato P n = posição dos radicais Amino-cidível P n = posição dos radicais Carboxi-cidível S n = Local na enzima para o radical Amino S n = Local na enzima para o radical Carboxi

5 SERINA-PROTEASES Identificação do sítio ativo Marcação covalente com DIFP (diisopropylphosphofluoridate) Apenas a Ser reativa ligou ao DIFP - 1 de 20 Ser na Quimotripsina Estudos de Cinética enzimática Uso de substrato cromogênico: Clivagem de uma ligação Éster libera produto amarelo

6 SERINA-PROTEASES Identificação do sítio ativo Estudos de Cinética enzimática Stopeed-flow (fluxo interropido) Reação em 2 fases

7 SERINA-PROTEASES Identificação do sítio ativo Reação em 2 fases Reação em duas etapas 1º) Acilação Formação de Acil-Enzima 2º) Desacilação Saída do grupo abandonador

8 SERINA-PROTEASES Quimotripsina Quimotripsinogênio produzido no pâncreas e ativado no estômago Ativação proteolítica

9 SERINA-PROTEASES Sítio ativo é formado pela Tríade catalítica - Asp, His e Ser forma rede de H-bound que reduz pka da Ser catalítica Hiper-polarização da OH da Ser - Formação de um íon alcóxido reativo poderoso nucleófilo

10 SERINA-PROTEASES Quimotripsina Estrutura protéica

11 SERINA-PROTEASES Quimotripsina Estrutura protéica

12 SERINA-PROTEASES Mecanismo envolve: - Catálise ácido-base - Catálise nucleofílica +

13 SERINA-PROTEASES Sistema de revezamento de cargas

14 SERINA-PROTEASES Mecanismo envolve: - Catálise eletrostática - Catálise por tensionamento ajuda a formar a estrutura tetraédrica - Intermediário tetraédrico é estabilizado pelo Buraco Oxi-ânion 1 Subtilisina Carboxipeptidase II

15 SERINA-PROTEASES Tríade catalítica - Importância foi estudada por mutagênese sítio específica - Atividade analisada por Cinética Enzimática Subtilisina Mutantes S221A, H64A e D32A e Triplo Mutante Menor atividade catalítica em 10 6 x Mantém K M constante Afinidade E + S inalterada Triplo mutante é ainda 10 3 vezes mais ativo do que Tampão Explicação O mecanismo de catálise por tensionamento é mantida.

16 SERINA-PROTEASES Quimotripsina, Tripsina, Elastase e TEV Evolução Divergente Apresentam ~ 40% de identidade na seqüência Estrutura terciária similar Mecanismo de catálise similar Diferem na especificidade por substratos Superposição da Quimotripsina e Tripsina Alta similaridade estrutural

17 SERINA-PROTEASES Quimotripsina, Tripsina e Elastase Evolução Divergente Bolsão S1 Principal fator de especificidade destas enzimas

18 SERINA-PROTEASES Tripsina Bovina - Tríade catalítica - Substrato Arg no bolsão - Asp enterrado no cerne da Estrutura - 5 Pontes dissulfeto

19 SERINA-PROTEASES - Quimotripsina Subtilisina Carboxipeptidase II e ClpP protease Sem correlação na estrutura primária e terciária Evolução convergente A Natureza parece ter descoberto de maneira independente o mesmo mecanismo catalítico pelo menos Quatro vezes

20 Outras PROTEASES 1- Ativação do nucleófilo 2- Polarização da lig. Peptídica 3- estabilização do intermediário tetraédrico Serino-proteases Cisteino-proteases Metalo-proteases Aspartato-proteases

21 INIBIDORES DE PROTEASES Muitos medicamentos são inibidores de proteases Ex: Captopril: Inibidores da Enzima Conversora de Angiotensina: antihipertensivos

22 INIBIDORES DE PROTEASES Muitos medicamentos são inibidores de proteases Aspartato proteases

23 INIBIDORES DE PROTEASES Muitos medicamentos são inibidores de proteases Inibidores da aspartil protease do HIV

24 ANIDRASE CARBÔNICA Tornando mais rápida uma reação rápida Não-catalisada V = 1,3 x 10-1 (s -1 ) Catalisada V = 1,0 x (s -1 ) Catálise depende da presença de 1 íon Zn 2+, coordenado por 3 His, localizado no fundo do Sítio Ativo à 15 Angstrons da superfície da enzima

25 ANIDRASE CARBÔNICA Catálise por Zn 2+ ocasiona a ativação de uma molécula de H 2 O Dependência da V em função do ph - Catálise Básica Efeito do ph na Atividade da Anidrase carbônica 15,7 Zn 2+ reduz o pka da H 2 O de 15,7 para 7,0 - Aumento da [HO ] local mesmo em ph = 7,0 - Íon HO é um nucleófilo mais poderoso do que a H 2 O

26 ANIDRASE CARBÔNICA Catálise ocorre em 4 etapas - Catálise por Orientação - Catálise base geral Próton liberado é captado pela His64

27 ANIDRASE CARBÔNICA Mecanismo de Catálise apoiado pelo Análogo sintético de coordenação do Zn 2+ - Em ph 9,2, o complexo sintético mostra V hidratação do CO x maior O Análogo sintético reduz o pka da H 2 O = 8,7

28 ANIDRASE CARBÔNICA Regeneração da Enzima depende da liberação do próton passo limitante V da hidratação do CO 2 = 1,3 x (s -1 ) K Se a k -7 = = 1x10 M k k difusão do H = (1x10 + é = 10 M s k 1 M) (1x M -1 s -1 ) M -1 s x10 s - A liberação do H+ é fator limitante para a Velocidade da Reação k? O meio celular é tamponado!!!! buffer com pka = A Keq será = 1

29 ANIDRASE CARBÔNICA A Velocidade da reação depende da presença de um tampão para receber os prótons liberados da H 2 O para formar o nucleófilo OH A difusão do meio limita k 'e k 'a M s A taxa de retirada de prótons será dada por k1.[b] k '.[ B] = (10 M s )*(10 M ) = 10 s Concentração de Tampão da ordem de mm ( M) são suficientes para alcançar Velocidades de s -1

30 ANIDRASE CARBÔNICA O Zn 2+ está a 15 Å de profundidade da superfície da enzima Sem contato com o meio externo O transporte de H + do sítio ativo para o tampão depende de um mecanismo especial His64 LANÇADEIRA DE PRÓTONS na estrutura da proteína

31 ANIDRASE CARBÔNICA O Zn 2+ está a 15 Å de profundidade da superfície da enzima Sem contato com o meio externo O transporte de H + do sítio ativo para o tampão depende de um mecanismo especial

32 ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO Enzimas de Restrição Enzimas Especializadas em degradar DNA exógeno em bactérias - Mecanismo de defesa contra infecção viral Endonucleases de Restrição tipo II Clivam dentro da seqüência de reconhecimento Grande importância na Engenharia Genética, Biologia Molecular e Biotecnologia Permitem a construção de moléculas de DNA específicas - Clonagem de DNA Emprego em testes de paternidade

33 ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO Especificidade das Enzimas de Restrição: Altíssima - Atuar somente na sequência de reconhecimento e NÃO devem degradar o DNA endógeno Reconhecem sequências específicas Sítios de restrição - Seqüência palindrômica = permite a mesma leitura em ambos os sentidos Reconhecem apenas o DNA Exógeno Metilases Enzimas específicas que modificam o DNA endógeno no mesmo sítio de reconhecimento Para cada Enzima de Restrição existe uma Metilase correspondente - Enzima de Restrição + Metilase: Sistema de restrição-modificação

34 ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO Mecanismo da Hidrólise Presença de Intermediários ligados à enzima? Mecanismo 1 Catálise covalente Mecanismo 2 Hidrólise direta 1 Passo Inversão da configuração do P. 2 Passos sem inversão da configuração do P.

35 ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO Mecanismo da Hidrólise Uso de fosfotiatos marcador de estereoisomeria 1 Passo com inversão da configuração do P Sem intermediários reacionais Sem catálise covalente Envolve hidrólise direta

36 EcoRV Dependência de Magnésio Co-fator - Mecanismo em Deslocamento Sequencial Ordenado 1º DNA 2º H 2 0 Íon Magnésio (Co-fator) Coordenado por 6 ligantes - 3 H 2 O - 2 Asp - 1 O do Pi Ativa uma H 2 O para Ataque Nucleofílico no grupo fosfato Catálise por íon Metálico - Posicionamento Ordem de ligação à EcoRV 1º: DNA 2º: Co-fator Mg 2+ 3º: H 2 0 reativa - Catálise Eletrostática - Catálise ácido-base

37 EcoRV Interação EcoRV-DNA ocorre por simetria Bilateral Sequência de reconhecimento é uma sequência invertida Enzima dimérica age nas duas fitas do DNA Interação EcoRV-DNA Metilação no DNA endógeno A Enzima envolve o DNA

38 EcoRV Afinidade EcoRV-DNA Inespecífico e específico é similar - Distorção do DNA só ocorre com interações produtivas com DNA específico

39 EcoRV Afinidade EcoRV-DNA Inespecífico e específico é similar - Distorção do DNA só ocorre com interações produtivas com DNA específico Catálise por tencionamento Distorção do DNA ajuda a posicionar o Pi próximos aos grupos Asp reativos Distorção do DNA tem um grande custo entrópico que é compensado pelas interações produtivas com DNA específico

40 EcoRV Complexo catalítico é montado somente após ser garantida a especificidade da interação Enzima-DNA Distorção do DNA - Reação só progride se a especificidade for garantida - Mecanismo em Deslocamento Sequencial Ordenado A Enzima usa a Energia livre de ligação com o DNA para deformar o Substrato e preparar o complexo catalítico para a reação. Mg 2+ é coordenado pelo Pi a ser clivado e Asp posicionados próximos na conformação distorcida DNA cognato = específico DNA não-cognato = inespecífico

41 ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO TIPO II Sem identidade Sequencial Com identidade Estrutural São proteínas homólogas transferência gênica horizontal O gene foi disseminado por um plasmídio após a divergência evolutiva das bactérias