Investigação epidemiológica de Borrelia burgdorferi em equinos do. município de Sinop, estado de Mato Grosso, Brasil

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E AMBIENTAIS PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA Investigação epidemiológica de Borrelia burgdorferi em equinos do município de Sinop, estado de Mato Grosso, Brasil Suyane Nayara Garcia Socoloski Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Universitário de Sinop, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Zootecnia. Área de concentração: Zootecnia. Sinop, Mato Grosso Fevereiro de 2017

2 SUYANE NAYARA GARCIA SOCOLOSKI Investigação epidemiológica de Borrelia burgdorferi em equinos do município de Sinop, estado de Mato Grosso, Brasil Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Universitário de Sinop, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Zootecnia. Área de concentração: Zootecnia. Orientador: Prof. Dr. Luciano Bastos Lopes Sinop, Mato Grosso Fevereiro de 2017

3 Dedico este trabalho à minha amada família, pois são minha base e inspiração. Certamente sem esta, eu não chegaria até aqui. III

4 Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. IV

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6 AGRADECIMENTOS À Deus e toda espiritualidade maior, por me guiarem até aqui e pelo amparo nos momentos de dificuldade. À minha família, ao meu namorado Ricardo Bonadimann e sua família, pelo apoio e compreensão. Ao meu orientador Dr. Luciano Bastos Lopes, por me orientar neste estudo, mesmo não sendo sua linha de pesquisa, respeitou minha vontade e me apoio a dar continuidade a este projeto. Obrigada pelas considerações sempre pertinentes, pelo apoio, ensinamentos compartilhados e pela confiança. Ao meu coorientador Dr. Bruno Gomes de Castro, de quem surgiu a ideia inicial deste projeto em 2013, quando eu ainda era uma graduanda. Obrigada pelo apoio e atenção todos esses anos, pela disponibilidade incondicional, sempre pronto a me auxiliar. Ao Dr. Adivaldo Henrique da Fonseca por ceder gentilmente o Laboratório de Doenças Parasitárias da UFRRJ, bem como todos os materiais necessários para a realização da análise sorológica e molecular deste estudo. Ao Dr. Matheus Dias Cordeiro, por não medir esforços para me ajudar na realização da análise sorológica e molecular, parte essencial deste estudo, por todas as discussão pertinentes ao projeto e conhecimentos compartilhados. Obrigada pela atenção e apoio. Ao Médico Veterinário Flávio Lisboa da Costa e o técnico agrícola Evandro de Paula, servidores da secretaria de agricultura do município de Sinop MT, pela colaboração na articulação junto as propriedades visitadas, ajuda extremamente importante na fase à campo deste estudo. Muito Obrigada pela disponibilidade e atenção. VI

7 Aos meus amigos, em especial o Médico Veterinário Rafael dos Santos, por se manter presente, sempre disposto a me auxiliar e me encorajando a buscar novos desafios profissionais. Obrigada pela amizade. Aos proprietários que permitiram que entrássemos em suas propriedades para a realização destes estudo. À todos que de alguma forma me auxiliaram durante estes dois anos de mestrado. À Universidade Federal de Mato Grosso/Campus Sinop, pela oportunidade de realização do curso de mestrado e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela concessão da bolsa de mestrado e pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa. VII

8 Nenhuma atividade no bem é insignificante. As mais altas árvores são oriundas de minúsculas sementes. Chico Xavier VIII

9 BIOGRAFIA Suyane Nayara Garcia Socoloski, filha de Ivo da Silva Socoloski e Silvana Garcia da Veiga, nascida em 21 de março de 1991 no município de Juara-Mato Grosso. No ano de 2009 ingressou no curso de Bacharelado em Medicina Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso - Campus de Sinop-MT, colando grau e obtendo o título de Médica Veterinária em 11 de setembro de Durante os cinco anos de graduação participou de vários projetos como voluntária, no Laboratório de Doenças Infecciosas do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso - Campus de Sinop-MT, bem como, foi monitora da disciplina de Semiologia animal entre os anos de 2012 a 2014, sob a supervisão do professor Dr. Bruno Gomes de Castro. Em março de 2015 ingressou no curso de Pós-Graduação Stricto Sensu, nível de mestrado, do Programa de Pós-Graduação em Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso-Campus Sinop, como bolsista pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), orientada pelo Dr. Luciano Bastos Lopes e coorientada pelo Dr. Bruno Gomes de Castro. No terceiro semestre do mestrado, realizou parte das avaliações do projeto de pesquisa no Laboratório de Doenças Parasitárias da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, sob orientação do Professor Dr. Adivaldo Henrique da Fonseca e o Dr. Matheus Dias Cordeiro, que resultaram na dissertação apresentada a seguir. IX

10 RESUMO SOCOLOSKI, Suyane Nayara Garcia. Dissertação de Mestrado (Zootecnia), Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Universitário de Sinop, fevereiro de 2017, 59 f. Investigação epidemiológica de Borrelia burgdorferi em equinos do município de Sinop, estado de Mato Grosso, Brasil. Orientador: Prof. Dr. Luciano Bastos Lopes. Coorientador: Prof. Dr. Bruno Gomes de Castro. Borrelia burgdorferi sensu stricto é o principal agente etiológico da Doença de Lyme (DL) nos Estados Unidos da América (EUA). No Brasil, acredita-se que uma variante geneticamente similar a essa espiroqueta, seja o agente causal da Síndrome de Baggio-Yoshinari (SBY), uma zoonose emergente brasileira, transmitida por carrapatos, que apresenta manifestações clínicas semelhantes à DL. Os equinos são apontados como importantes hospedeiros na cadeia de transmissão e na manutenção desta espiroqueta no país. Diante disso, objetivou-se com esse estudo detectar a frequência de anticorpos homólogos da classe IgG anti-b. burgdorferi cepa americana G39/40, em equinos do município de Sinop MT, por meio de inquérito soroepidemiológico utilizando o Ensaio de Imunoadsorção Enzimática (ELISA) indireto, como teste diagnóstico. Para tal, foram coletadas amostra de sangue de 367 equinos, provenientes de 81 propriedades na região centro-norte de Mato Grosso. Foi aplicado também um questionário epidemiológico durante as visitas realizadas, obtendo-se informação de identificação e caracterização dos animais e suas respectivas propriedades. Das 367 amostras submetidas a análise sorológica, 214 foram positivas no ELISA indireto para B. burgdorferi sensu stricto, determinando prevalência aparente de 54,04%. Concomitantemente, dos 367 equinos avaliados, amostras de sangue total de 89 animais foram submetidas à análise biomolecular pela nested- Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). De acordo com o teste da PCR, nenhuma das amostras foi positiva, sendo que desses 89 animais testados, 53 eram positivos no ELISA indireto e 36 negativos. Das 81 propriedades analisadas, 75 (92,59%) tiveram pelo menos um equino soropositivo para B. burgdorferi, sendo que destas, cerca de 89% apresentavam pastos próximos à matas, o que predispõe o contato dos equinos com espécies de animais silvestres e carrapatos. Os resultados encontrados reforçam a hipótese da presença de anticorpos anti- Borrelia spp. em equinos no estado de Mato Grosso. Palavras-chave: Equinocultura, carrapato, borreliose, ELISA, PCR. X

11 ABSTRACT SOCOLOSKI, Suyane Nayara Garcia. Master Thesis (Animal Science), Universidade Federal de Mato Grosso, Campus of Sinop, 2017, february, 59 f. Epidemiological investigation of Borrelia burgdorferi in horses of the municipality of Sinop, state of Mato Grosso, Brazil. Adviser: Prof. Dr. Luciano Bastos Lopes. Co-adiviser: Prof. Dr. Bruno Gomes de Castro. Borrelia burgdorferi sensu stricto is the main etiologic agent of Lyme disease (LD) in the United States of America (USA). In Brazil, a variant genetically similar to this spirochete is believed to be the causative agent of Baggio-Yoshinari Syndrome (BYS), a Brazilian emerging zoonosis, transmitted by ticks, that presents clinical manifestations similar to LD. Equines are indicated as important hosts in the transmission chain and in the maintenance of this spirochete in the country. Therefore, the aim of this study was to detect the frequency of homologous antibodies of the class. IgG anti-b. burgdorferi American strain G39/40, in horses of the municipality of Sinop - MT, by means of a seroepidemiological survey using the indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) as diagnostic test. Blood samples were collected from 367 horses from 81 properties of Mato Grosso. It was also applied an epidemiological survey conducted during visits, obtaining identification information and characterization of the animals and their properties. From the 367 samples submitted to serological analysis, 214 were positive according indirect ELISA for B. burgdorferi sensu stricto, determining an apparent prevalence of 54.04%. Concomitantly, from the 367 horses evaluated, whole blood samples from 89 animals were submitted to biomolecular analysis by the nested-polymerase Chain Reaction (PCR). According to the PCR test, none of the samples were positive in this test. Considering these 89 animals tested, 53 were positive in the indirect ELISA and 36 negative. From the 81 analyzed properties, 75 (92.59%) had at least one B. burgdorferi seropositive equine, of which about 89% presented pastures near the forest, which predisposes the contact of the horses with wild animal species and ticks. The results support the hypothesis of the presence of anti-borrelia spp. in the state of Mato Grosso. Key-words: Echinoculture, tick, borreliosis, ELISA, PCR. XI

12 LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES BL BSK DL DO ELISA EM EUA FlgB FlgE HCFMUSP IgG IgM LDI LDP LIM-17 OspA OspB PBS PCR PNPP RIFI SBY SFC STARI UFMT UFRRJ WB Borreliose de Lyme Barbour-Stoenner-Kelly Doença de Lyme Densidade Óptica Ensaio de Imunoadsorção Enzimática Eritema Migratório Estados Unidos da América Flagelina B Flagelina E Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo Imunoglobulina G Imunoglobulina M Laboratório de Doenças Infecciosas Laboratório de Doenças Parasitárias Laboratório de Investigação Médica em Reumatologia Outer Surface Protein A Outer Surface Protein B Tampão Fosfato Salino Reação em Cadeia da Polimerase Paranitrofenilfosfato Reação de Imunofluorescência Indireta Síndrome de Baggio-Yoshinari Síndrome da Fadiga Crônica Southern Tick Associated Rash Illness Universidade Federal de Mato Grosso Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro Western blotting XII

13 SUMÁRIO INTRODUÇÃO GERAL... 1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 3 Contexto Histórico... 3 O gênero Borrelia... 4 Aspectos Epidemiológicos... 8 Patogenia Aspectos clínicos em equinos Diagnóstico Tratamento em equinos Medidas de controle e profilaxia REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAPÍTULO RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO AGRADECIMENTOS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS XIII

14 INTRODUÇÃO GERAL Dentre as enfermidades causadas por bactérias do gênero Borrelia, a Doença de Lyme (DL) ou Borreliose de Lyme (BL) destaca-se, por ser uma zoonose de caráter multissistêmico, que acomete animais domésticos e o homem, tendo como reservatório animais silvestres (Soares et al., 2000). É uma antropozoonose frequente no hemisfério Norte, encontrada nos Estados Unidos da América (EUA), Europa e Ásia, transmitida por carrapatos do complexo Ixodes ricinus, infectados por espiroquetas do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato (Yoshinari et al., 2010). No Brasil, uma enfermidade semelhante à DL tem sido relatada desde 1987 por Talhari et al., e em 1992 os primeiros casos da enfermidade foram identificados no país (Yoshinari et al., 1992). Desde então, foram verificadas diferenças significativas em aspectos epidemiológicos e clínico-laboratoriais entre a doença presente no Brasil e a DL. Diante disto, Gauditano et al. (2005) sugeriram a mudança de nomenclatura da enfermidade para Síndrome de Baggio-Yoshinari (SBY), no intuito de desvincular esta zoonose brasileira da DL e incentivar as pesquisas desta enfermidade emergente no país. A SBY ficou definida como zoonose emergente tipicamente brasileira, transmitida por carrapatos dos gêneros Amblyomma e/ou Rhipicephalus, responsável pelo desenvolvimento de manifestações clínicas semelhantes à DL, exceto pela ocorrência de recidivas e desordens imunológicas, ao longo da prolongada evolução clínica (Yoshinari et al., 2010). Acredita-se que o agente etiológico da SBY seja uma espiroqueta do gênero Borrelia. Entretanto ainda não foi totalmente esclarecido se essas espiroquetas são uma variante geneticamente similar da B. burgdorferi sensu stricto, a qual pertence ao complexo B. burgdorferi sensu lato, ou se estamos frente à uma nova espécie de Borrelia ainda não identificada. Até o momento, estas espiroquetas, nunca foram isoladas nos fluidos biológicos ou em tecidos de pacientes diagnosticados com a SBY no Brasil (Mantovani et al., 2012). 1

15 Animais silvestres e domésticos parecem estar envolvidos no ciclo epidemiológico da SBY, o qual ainda não foi totalmente elucidado. Os equinos são apontados como importantes hospedeiros no ciclo desta enfermidade, uma vez que, estudos sorológicos têm demonstrado que anticorpos anti-borrelia spp. circulam entre equinos em diferentes regiões do país e é possível que os equinos, além de sentinelas e carreadores de carrapatos transmissores de Borrelia spp., possam estar funcionando como hospedeiros reservatórios, ou seja, animais assintomáticos (Campos et al., 2015). Nos últimos anos, vários estudos soroepidemiológicos da borreliose têm sido realizados em animais domésticos e silvestres no Brasil, incluindo alguns relatos de casos da SBY em humanos. No entanto, até o momento não se encontram na literatura pesquisas desta enfermidade em equinos no estado de Mato Grosso, sendo assim, objetivou-se com esse estudo realizar levantamento epidemiológico de Borrelia spp. em equinos no município de Sinop, estado de Mato Grosso. Tendo como objetivos específicos, determinar a prevalência de anticorpos anti-borrelia burgdorferi na população de equinos estudada, bem como, realizar análise descritiva das informações julgadas pertinentes a ocorrência da Borreliose, encontradas nas propriedades e nos animais avaliados. O produto final deste estudo será apresentado no Capítulo 1 sob forma de artigo científico, ainda não traduzido, de acordo com as normas do periódico Tropical Animal Health and Production, ISSN:

16 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Contexto Histórico O primeiro relato sobre os sintomas da DL foi descrito por Buchwald (1883) na Alemanha, onde relatou em humanos uma atrofia difusa de pele de caráter idiopático. Em 1902, a doença foi denominada de Acrodermite Atrófica Crônica (Herxheimer & Hartmann, 1902). Posteriormente Afzelius (1910) descreveu a relação entre essa lesão e a picada do carrapato Ixodes ricinus, referindo-a como eritema migratório (EM). No entanto, somente em 1975 que a doença foi caracterizada e nomeada pelo médico Allen C. Steere, nos EUA, após uma epidemia de artrite oligoarticular juvenil associada ao EM na comunidade de Lyme (Connecticut - EUA). A enfermidade caracterizada como multissistêmica de agente desconhecido foi denominada então de artrite de Lyme ou doença de Lyme (Steere et al., 1977). Em 1982, Burgdorfer e colaboradores isolaram bactérias em carrapatos da espécie Ixodes scapularis e associaram o parasita a ocorrência da enfermidade. Após o seu isolamento, a bactéria foi denominada de Borrelia burgdorferi (Johnson et al., 1984). No Brasil, o primeiro relato de sintomatologia cutânea relacionada a picada de carrapatos foi descrito por Talhari et al. (1987) em três pacientes que apresentavam EM, no estado do Amazonas. Em seguida, novos casos foram relatos no estado do Rio de Janeiro por Filgueira et al. (1989), os quais observaram lesões de pele em humanos. Entretanto, apenas em 1992 foram confirmados os primeiros casos da enfermidade no país, após análise sorológica de dois irmãos que apresentavam febre, EM e artrite, associado ao histórico de picada de carrapato em uma região da mata Atlântica na cidade de Itapevi, no Estado de São Paulo. A sorologia foi realizada através do Ensaio de Imunoadsorção Enzimática (ELISA) indireto e confirmada com o Western blotting (WB), sendo positiva para B. burgdorferi em ambos os testes (Yoshinari et al., 1992). 3

17 No que se refere aos animais domésticos, os estudos iniciaram-se no estado do Rio de Janeiro, com o relato da ocorrência de anticorpos anti-b. burgdorferi sensu lato em bovinos e a detecção de antígenos circulantes em cães (Fonseca et al., 1994). No ano seguinte foram observadas espiroquetas com características morfológicas de Borrelia spp. em sangue periférico de marsupiais (Fonseca et al. 1995). Ainda em 1995, na região de Cotia-São Paulo onde casos haviam sido descritos em humanos, Joppert relatou soroprevalência de 9,7% de B. burgdorferi em cães. E em 2002, no estado do Rio de Janeiro, Salles et al. (2002), padronizaram o ensaio ELISA indireto para a pesquisa de anticorpos anti-b. burgdorferi em equinos, encontrando uma soroprevalência de 9,8% após levantamento sorológico. O gênero Borrelia Os microrganismos do gênero Borrelia são bactérias pertencentes à Família Spirochaetaceae da ordem Spirochaetales. São classificadas como bactérias Gram-negativas, microaerófilas e móveis. Possuem formato helicoidal que pode variar de 3 a 10 espiras e se reproduzem por fissão binária transversal (Barbour & Hayes, 1986). Suas dimensões variam de 10 a 30μm de comprimento e 0,2 a 0,3μm de diâmetro, possuem ainda 7 a 14 flagelos em cada extremidade, o que confere mobilidade a essas espiroquetas (Krupka et al., 2007). Crescem melhor a 33º C, em meio de cultura Barbour-Stoenner-Kelly (BSK) (Salles, 2001). Existe pelo menos nove enfermidades distintas que possuem como agente etiológico espiroquetas do gênero Borrelia, entre estas estão: (1) Febre recorrente epidêmica humana, causada pela B. recurrentis; (2) Febre recorrente endêmica, causada por mais de 20 espécies do gênero Borrelia, denominadas até recentemente, de acordo com o carrapato vetor; (3) Borreliose aviária ou espiroquetose aviária, determinada pela B. anserina; (4) Aborto epizoótico bovino, causado pela B. coriaceae; (5) Borreliose bovina, a qual pode acometer também ovinos e equinos, ocasionada pela B. theileri; (6) Enfermidade ainda não nominada 4

18 que determina sinais inespecíficos e febre, causada pela B. miyamotoi, pertencente até o momento ao grupo da Febre recorrente; (7) Doença de Masters ou STARI (Southern Tick Associated Rash Illness), enfermidade semelhante a DL, na ausência de sintomatologia sistêmica, determinada pela B. lonestari; (8) DL, causada pelas borrelias pertencentes ao complexo B. burgdorferi sensu lato; (9) SBY, causada por espiroquetas do gênero Borrelia ainda não totalmente descritas (Soares et al., 2000; Sinski et al., 2016; Varela et al., 2004; Mantovani et al., 2012) (Tabela 1). 5

19 Tabela 1. Grupos das borrelioses com as respectivas espécie(s) de Borrelia envolvida(s), os vetor(es), hospedeiro(s) e a distribuição mundial. Doença Borrelia spp. Vetor Hospedeiros Distribuição Febre recurrente epidêmica Febre recurrente endêmica Grupo Febre recurrente: B. recurrentis Borrelia spp.* Pediculus humanus Ornithodorus spp. Homem Homem e roedores Cosmopolita Cosmopolita Borreliose aviária B. anserina Argas spp. Aves Cosmopolita Aborto epizoótico bovino Borreliose bovina B. coriaceae B. theileri Ornithodorus coriaceus R. (Boophilus) microplus Bovinos e cervídeos Bovinos, ovinos e equinos Febre inespecífica B. miyamotoi Ixodes spp. Homem e animais silvestres Doença de Masters B. lonestari Grupo Doença de Lyme: Amblyomma americanum Borreliose de Lyme B. burgdorferi Ixodes spp. Síndrome Baggio- Yoshinari B. garinii Ixodes spp. B. afzelii Ixodes spp. Borrelia spp. Borrelia sp.** Ixodes spp. Amblyomma sp. Rhipicephalus sp. Homem, animais silvestres e domésticos Homem, animais silvestres e domésticos Homem, animais silvestres e domésticos Homem, animais silvestres e domésticos Homem, animais silvestres e domésticos Homem, animais silvestres e América do Norte Cosmopolita América do Norte, Europa e Ásia Sul dos EUA América do Norte, Europa Europa e Ásia Europa e Ásia América do Norte, Europa, Ásia e Norte da África Brasil domésticos * São reconhecidas cerca de 25 espécies do gênero Borrelia, ainda nominadas de acordo com a espécie do carrapato do gênero Ornithodoros transmissor. ** Espiroquetas nunca isoladas no Brasil, ainda não caracterizadas totalmente. Fonte: Adaptado de Fonseca et al. (2005). O complexo B. burgdorferi sensu lato é composto até o momento, por 19 genoespécies de Borrelia spp. conhecidas (Mannelli et al., 2011), sendo que destas, apenas oito são consideradas realmente patogênicas para o homem: B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii, B. lusitaniae, B. valaisiana, B. bissetti, B. spielmanii e B. bavariensis. Nos EUA a B. burgdorferi sensu stricto é o principal agente etiológico da DL, enquanto que na Europa, todas as genoespécies consideradas patogênicas para o homem são encontradas, além de outras 6

20 espécies de Borrelia. Na Ásia, assim como na Europa encontra-se elevada heterogeneidade de estirpes de Borrelia spp., entretanto na maioria das regiões asiáticas B. burgdorferi sensu stricto é raramente detectada sendo B. afzelii e B. garinii, apontadas como as principais espécies envolvidas nos casos da doença que ocorrem neste continente (Franke et al., 2013). Existe ainda um sistema de sorotipagem das espiroquetas pertencentes ao complexo B. burgdorferi sensu lato, esta sorotipagem é baseada na reatividade entre anticorpos monoclonais e as lipoproteínas de superfície OspA (outer surface protein A) e pode ser dividida em oito sorotipos diferentes. O sorotipo 1 corresponde B. burgdorferi sensu stricto, o sorotipo 2 B. afzelii e os sorotipos 3 a 8, B. garinii (Stanek & Reiter, 2011). Mais recentemente nos EUA, uma nova espécie de Borrelia foi identificada. Após análises moleculares e estudos filogenéticos a nova espécie denominada Candidatus Borrelia mayonii foi incluída no complexo B. burgdorferi sensu lato e é responsável por determinar casos da DL cursando com alta espiroquetemia, o que não é comumente observado em infecções clássicas de B. burgdorferi sensu stricto (Pritt et al., 2016). No Brasil, estruturas semelhantes à espiroquetas foram visualizadas em amostras de sangue periférico de pacientes diagnosticados com a SBY. Essas estruturas, quando analisadas à microscopia eletrônica, demonstraram formações parecidas com bacteroides longos não flagelados, cistos e corpos densos. Sugeriu-se, então que essas estruturas seriam variações morfológicas de espiroquetas patogênicas adaptadas a sobreviver em hospedeiros vertebrados e invertebrados no Brasil. Diante disto, o agente da SBY foi inicialmente descrito como espiroquetas de morfologia incompleta e latente, não espiraladas, que se assemelham a Mycoplasma spp., Chlamydia spp. e bacteroides (Mantovani et al., 2007). Posteriormente, a hipótese da participação dos microrganismos latentes Mycoplasma spp. e Chlamydia spp. na etiologia da SBY foi descartada e através de análises sorológicas, moleculares e microscópicas a participação de espiroquetas do complexo B. burgdorferi sensu 7

21 lato como agente etiológico da SBY foi confirmada. Foi sugerido que a SBY seja causada por espiroquetas na morfologia atípica, de vida intracelular, o que justificaria a longa persistência do microrganismo no homem e explicaria os episódios de recorrência clínica (Mantovani, 2010). Até o momento, essas espiroqueta são incultiváveis em meios aeróbicos e anaeróbicos, incluindo o meio BSK adequado para crescimento de borrelias. Tem crescimento lento e momentâneo em meio conhecido como SP4, ideal para desenvolvimento de Mollicutes do gênero Spiroplasma, que são bactérias dotadas de movimento, sem parede e com membrana celular rica em colesterol (Yoshinari et al., 2010). São ainda fracamente coradas por Giemsa ou laranja de acridina e são capazes de invadir células endoteliais in vitro (Shinjo et al., 2009). Contudo, ainda está por ser definido se o agente etiológico da SBY é uma variação genotípica da B. burgdorferi sensu stricto ou se é uma nova espécie de Borrelia sp. ainda não identificada, pois até o momento, estas espiroquetas nunca foram isoladas no Brasil (Mantovani et al., 2012). Aspectos Epidemiológicos A SBY possui distribuição até o momento restrita ao território brasileiro (Mantovani, 2010) embora haja relatos de Borreliose em outros países da América do Sul, como Argentina (Stanchi & Balague, 1993) Colômbia (Miranda et al., 2009) e Uruguai (Barbieri et al., 2013). Segundo Ministério da Saúde é caracterizada como agravo inusitado, sendo, portanto, de notificação compulsória e investigação obrigatória (Brasil, 2010). Acredita-se que espécies de animais silvestres e animais domésticos estejam envolvidos no ciclo epidemiológico desta enfermidade, além dos hospedeiros acidentais humanos e os carrapatos transmissores (Yoshinari et al., 2010). Estudos realizados a campo em áreas de ocorrência da SBY confirmaram a presença de roedores silvestres e marsupiais, que em muitas vezes estavam contaminados com 8

22 espiroquetídeos que possuíam as mesmas características daqueles encontrados em carrapatos e pacientes diagnosticados com a SBY, diante disto, esses animais silvestres foram apontados como potenciais reservatórios do agente no Brasil (Costa et al., 2002). Já foi observado também, a importante relação de pacientes com o desenvolvimento de sintomas clínicos da SBY após contato com animais domésticos como equinos, cães e bovinos (Yoshinari et al., 2010). Estudos como os de Corradi et al. (2006), Mantovani (2010) e Montandon et al. (2014) reforçam a hipótese da participação de animais silvestres e domésticos no ciclo biológico da SBY. No primeiro estudo foi detectado 6,4% de soropositividade para B. burgdorferi em grupo de indivíduos que trabalhavam com animais silvestres, composto por veterinários, biólogos e tratadores oriundos de duas instituições do município de São Paulo. Já na segunda pesquisa foi identificada através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) a B. burgdorferi em amostras de sangue total de bovinos e equinos, as quais apresentaram homologia de 99% com o gene da proteína do gancho flagelar da B. burgdorferi (flge). E no terceiro estudo, realizado em áreas endêmicas do estado de Minas Gerais, foi confirmada pelo teste ELISA indireto a soropositividade para B. burgdorferi em vertebrados domésticos, cães e equinos, e animais silvestres, marsupiais e roedores. A transmissão das bactérias do gênero Borrelia ocorre principalmente através de vetores artrópodes. Os vetores responsáveis pela transmissão da SBY ainda não estão bem estabelecidos, porém sabe-se que são carrapatos não pertencentes ao complexo Ixodes ricinus, pois não foram identificados carrapatos do complexo Ixodes ricinus (I. scapularis, I. pacificus, I. persulcatus e I. ricinus) hematófago para o homem nas áreas de risco para a SBY. Os carrapatos do gênero Amblyomma e Rhipicephalus são apontados como os potenciais vetores da enfermidade, entretanto acredita-se que o Amblyomma cajennense é o principal transmissor de borreliose a humanos e animais no Brasil (Yoshinari et al., 2010). 9

23 A possibilidade da participação dos carrapatos do gênero Rhipicephalus como vetores da SBY não deve ser descartada, pois já se observou a coexistência de anticorpos para B. burgdorferi e Babesia bovis em pacientes diagnosticados com a SBY, sendo que a espécie R. (Boophilus) microplus é a responsável pela transmissão da babesiose em bovinos (Yoshinari et al., 2003). Além disso, Borrelia spp. vem sendo identificada em carrapatos da espécie R. (Boophilus) microplus pela técnica PCR, sendo que o sequenciamento revelou 100% de identidade para o gene 16S rrna com sequências de B. burgdorferi (Madureira, 2007). Mantovani (2010) utilizou novos primers amplificadores do principal gene envolvido na síntese do gancho flagelar da B. burgdorferi, o chamando flge, apresentando homologia de 99% em isolados provenientes de carrapatos da espécie R. sanguineus e R. (Boophilus) microplus. Entretanto, ao compararmos as características biológicas de cada uma destas espécies de carrapatos, A. cajennense, R. (Boophilus) microplus e R. sanguineus, apontadas como potenciais vetores da SBY, sugere-se que a veiculação das espiroquetas entre animais e humanos seria mais facilitada através do A. cajennense, pois além de se tratar de um carrapato trioxeno ou seja, necessitam de três hospedeiros para completarem seu ciclo de vida, é também a espécie entre as três citadas, mais inespecífica. A espécie R. sanguineus também é um carrapato trioxeno. Porém, esta é mais especifica quando comparado ao A. cajennense, normalmente estes carrapatos completam seu ciclo de vida apenas em cães. Já o R. (Boophilus) microplus diferente das outras duas espécies de carrapatos citadas, trata-se de um carrapato monoxeno, parasitando normalmente bovinos. Nava et al. (2014) ao realizarem estudo sobre o A. cajennense, constataram que essa espécie de carrapato é na verdade um complexo de seis espécies distribuídas ao longo das Américas, sendo que destas seis, duas estão presentes no Brasil, sendo elas o A. cajennense e o A. sculptum. Os autores ressalvam ainda que o A. sculptum é a espécie de maior distribuição entre os estados brasileiros, englobando os estados do Espírito Santo, Minas Gerais, Rio de 10

24 Janeiro, São Paulo, Paraná, Pernambuco, Piauí, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul e Goiás enquanto que o A. cajennense somente é encontrado na região Amazônica da América do Sul, estando restrito aos estados do Pará, Rondônia, Roraima, Tocantins e Amapá. Os carrapatos de gênero Amblyomma são classificados como trioxenos (Rodrigues et al., 2015). Os equinos, capivaras e antas são considerados os principais hospedeiros para todos os estágios parasitários dessa espécie de carrapato. Porém, devido à baixa especificidade parasitária, especialmente nas fases imaturas, outras espécies de animais também podem servir como hospedeiros, inclusive os seres humanos (Labruna et al., 2001). Estes ectoparasitas apresentam apenas uma geração por ano, isso ocorre devido a chamada diapausa comportamental das larvas, momento em que, estas permanecem inativas até que fatores climáticos, como o fotoperíodo, exibem condições favoráveis para estas começarem a busca por hospedeiros (Labruna et al., 2003). Esses carrapatos sofrem portanto influência direta da sazonalidade, sendo que, as fases imaturas ocorrem nos períodos de outono e inverno, enquanto que os adultos ocorrem com maior frequência na primavera e verão (Guedes & Leite, 2008). O ciclo de vida dos carrapatos do gênero Amblyomma está demonstrado esquematicamente na figura 1. 11

25 Figura 1. Ciclo biológico do Amblyomma cajennense e Amblyomma sculptum (Rodrigues et al., 2015). O mecanismos de transmissão do agente etiológico da SBY ainda não está totalmente descrito, porém a literatura traz informações importantes sobre a transmissão de Borrelia spp. a partir de carrapatos ixodídeos, conhecidos como carrapatos duros, à exemplo Amblyomma spp. e Ixodes spp. De acordo com Butler et al. (2005), os humanos e animais adquirem a infecção por meio do repasto sanguíneo de larvas ou ninfas de carrapatos, sendo que o DNA de B. burgdorferi sensu lato é mais frequentemente encontrado nos carrapatos fêmeas. Estas espiroquetas podem ser transmitidas entre os carrapatos pela forma transestadial (nos diferentes estágios de desenvolvimento), transovariana (fêmeas para sua prole) e ainda, através do mecanismo de co-alimentação, ao estarem aderidos ao mesmo hospedeiro. Uma vez que o carrapato está aderido ao hospedeiro e ingurgitado, as espiroquetas migram através do mesentério e hemocele atingindo as glândulas salivares cerca de 18 horas após o início da adesão. 12

26 Com relação a via transovárica, a percentagem de espiroquetas transmitidas da fêmea aos ovos é muito baixa, podendo o número de bactérias diminuir ou mesmo desaparecer quando ocorrer a muda dos ovos em larvas. Devido a este fator, as larvas parecem não ser vetores importantes de borrelias (Stanek et al., 2012). Neste contexto as ninfas são apontadas como as principais transmissoras de borrelias, uma vez que, pelo tamanho diminuto, nem sempre são percebidos (Hamer et al., 2010). Um fator relevante quanto a eficiência de transmissão destas bactérias é o tempo de fixação do carrapato no hospedeiro, sendo que para os ixodídeos são necessárias pelo menos 48 horas para uma transmissão eficiente via saliva (Piesman et al., 1987). Entretanto, vários autores têm verificado que o período necessário de fixação dos carrapatos ao hospedeiro para uma eficiente transmissão é dependente da genoespécie de Borrelia e do próprio vetor (Stanek et al., 2012). Além da transmissão dessas espiroquetas via carrapatos, alguns autores relataram outras possíveis vias de transmissão, como pela transfusão sanguínea ou transplante de tecido em roedores, humanos e cães (Dorward et al., 1991), pela via congênita em cães (Gustafson et al., 1993), via infecção oral, dípteros hematófagos e via transplacentária em bovinos (Burgess, 1988), e transmissão por vias de contato em equinos (Manion et al., 1998). No entanto essas formas de transmissão não são consideradas relevantes na casuística da doença. Nos últimos anos, vários estudos soroepidemiológicos da borreliose tem sido realizados em animais domésticos e silvestres no Brasil, incluindo alguns relatos de casos da SBY em humanos. Pesquisas já foram publicadas em diferentes estados brasileiros como, Rio Grande do Sul (Campos et al., 2015), Paraná (Nascimento et al., 2016; Gonçalves et al., 2015), São Paulo (Shinjo et al., 2009; Brooks et al., 2012), Rio de Janeiro (Madureira et al., 2007; Cordeiro et al., 2012; Corrêa, 2011; Silva et al., 2013; Prado et al., 2014), Minas Gerais (Montandon et al., 2014), Mato Grosso do Sul (Naka et al., 2008; Rezende et al., 2016), Mato grosso (Soares, 13

27 2013), Pará (Rodrigues et al., 2007; Galo et al., 2009) e Amazonas (Santos et al., 2010; Santos et al., 2011). Segundo Ministério da Saúde, casos isolados já foram relatados também nos estados de Santa Catarina e Rio Grande do Norte (Brasil, 2010). Com relação as pesquisas da borreliose em equinos realizados no Brasil, estudos já foram realizados em alguns estados, demostrando que sua frequência de ocorrência é bastante relevante. O primeiro trabalho publicado foi realizado no estado do Rio de Janeiro, onde Salles et al. (2002), padronizaram a técnica de ELISA indireto para equinos e realizaram levantamento sorológico, encontrando uma prevalência de 9,8% de equinos soropositivos para B. burgdorferi. Posteriormente, também no estado do Rio de Janeiro, Madureira et al. (2007), relataram um total de 28,4% de equinos reagentes positivos ao ELISA indireto, com anticorpos da classe IgG anti-b. burgdorferi. No estado do Pará, Madureira et al. (2009) encontraram 7,2% de frequência de equinos soropositivos para B. burgdorferi. Neste estudo foi realizado também, análise morfométrica e genotípica de B. theileri isolado de equino, sendo a primeira descrição genotípica de isolado brasileiro de B. theileri, a qual causa a borreliose bovina mas pode cometer também equinos. Galo et al. (2009), também no estado do Pará, verificaram 26,7% de equinos positivos para B. burgdorferi pelo ELISA indireto. Já em 2010, Mantovani ao realizar estudo para a identificação do agente etiológico da SBY, encontrou pela técnica PCR (1/26) equino positivo para o gene da proteína do gancho flagelar da B. burgdorferi (flge), este animal era proveniente da UFRRJ. Em seguida no estado do Paraná, foi relatado soroprevalência de 38,9% de anticorpos anti-b. burgdorferi em equinos de um assentamento rural da região norte do estado (Nascimento et al., 2016). Anticorpos anti- B. burgdorferi foram também detectados em 9,68% dos equinos avaliados em áreas endêmicas do estado de Minas Gerais (Montandon et al., 2014). Já em equinos de uso militar do município de Resende-RJ, foi verificado soroprevalência de 29,89% (Prado et al., 2014). Soroprevalência diferentes desta, sendo de 44,66%, foi encontrada também em equinos de uso militar, porém no 14

28 estado do Rio Grande do Sul, município de São Borja (Campos et al., 2015). Vale ressalvar que os equinos avaliados neste estudo apresentavam diferentes níveis de infestação pelo carrapato R. (Boophilus) microplus. E por fim, em 2016, foi obtido média de 21% de soroprevalência para B. burgdorferi em equinos provenientes do estado de São Paulo, especificamente das cidades com casos suspeitos da SBY (Basile, 2016). Patogenia No que se refere a patogenia da SBY, o período de incubação é em média de 10 dias, mas pode variar de três dias a semanas (Costa et al., 2001). Sabe-se que as espiroquetas do complexo B. burgdorferi sensu lato possuem atividades de estimulação celular e imunológicas próprias, as chamadas lipoproteínas de superfície exterior (outer surface lipoproteins - Osp s). A OspA e OspB estimulam os linfócitos B e a produção de citocinas pelos macrófagos e células endoteliais (Ma e Weiss, 1993), resultando na penetração das espiroquetas através do endotélio vascular. Os neutrófilos também são ativados pelas lipoproteínas OspA de maneira similar à ativação realizada pelo LPS (lipopolissacarídeo de bactérias gram-negativas) (Basile et al., 2013). Entretanto, Chang et al., (2000) afirmam que B. burgdorferi é capaz de se evadir do sistema imunológico dos hospedeiros vertebrados, podendo estabelecer infecções crônicas, pois conseguem residir em alguns tecidos específicos como a pele, fáscias, tecido perineural e membranas sinoviais por longos períodos de tempo. As espiroquetas encontradas em pacientes com a SBY são consideradas estruturalmente modificadas, possivelmente em razão da deleção ou repressão gênica, expressam menos lipoproteínas da membrana externa (Osps) e flagelos periplásmicos, o que as confere resistência à ação de anticorpos e antibióticos, além de estimularem menor reposta imunológica por parte do hospedeiro. Portanto, ao invadirem células como as endoteliais, estas espiroquetas latentes 15

29 defendem-se melhor das agressões externas e são capazes de causar sintomas clínicos recorrentes (Yoshinari et al., 2010). Aspectos clínicos em equinos As características clínicas da borreliose nos equinos são vagamente descritas na literatura nacional, o que se tem feito é extrapolar as informações de manifestações clínicas da DL em equinos nos EUA e outros países. Em estudo recente, Basile (2016) descreve resultados significativos com relação aos sinais da SBY nos equinos. Inicialmente a autora realizou levantamento epidemiológico da enfermidade nos equinos, obtendo prevalência de 21% de soropositividade no estado e obteve informações importantes como a relação entre a soropositividade e a presença de carrapatos da espécie A. sculptum, presença de capivaras na propriedade, linfopenia, abortamento e retenção de placenta nas propriedades visitadas. Em seguida, em uma segunda fase do estudo, dois equinos adultos foram infectados experimentalmente com B. burgdorferi cepa G39/40 e avaliados durante 90 dias de infecção. A autora constatou que os animais apresentaram sinais clínicos e alterações hematológicas inespecíficas somente nos primeiros 11 dias de infecção, foi observado a presença de anemia normocítica hipocrômica discreta, dores musculares, palidez de mucosas, letargia e aumento de linfonodos, sinais que podem facilmente ser confundidos com a piroplasmose crônica, causada pelos protozoários Babesia caballi e Babesia equi. Com relação aos sintomas da DL em equinos nos EUA, Magnarelli et al. (2000) descreve que na maioria dos casos, os equinos são assintomáticos, sendo que apenas 5% a 10% dos animais apresentam sinais clínicos, os quais podem ser mal-estar, febre, rigidez, inchaço das articulações, laminite e em alguns casos envolvimento ocular como uveíte, problemas cardíacos e encefalite. Segundo os autores uma possível explicação para este leque de manifestações clínicas da DL nos equinos é a alta probabilidade de infecções mistas com outros 16

30 patógenos, como o Anaplasma phagocytophilum. Em áreas endêmicas para a DL nos EUA, equinos soropositivos para B. burgdorferi foram observados apresentando ainda hipersensibilidade da pele com perda de pelo e descamação nas áreas onde previamente havia carrapato fixado (Magnarelli et al., 1988). Assim como, dermatite nos membros, edema transitório das patas e poliartrites já foram relatados (Cohen et al., 1988). Diagnóstico Para que o diagnóstico da borreliose seja confiável é imprescindível, que além de se utilizar exames complementares padronizados e de eficácia comprovada, realiza-se também, uma anamnese completa do paciente em questão. Deve-se levar em consideração todo o histórico envolvendo o caso clínico, os fatores epidemiológicos, a sintomatologia clínica e posteriormente a análise laboratorial positiva (Madureira, 2004). Segundo Corrêa, (2007) o diagnóstico clínico da borreliose em animais domésticos é difícil, uma vez que, estes animais quando sintomáticos à enfermidade, apresentam sinais inespecíficos. Assim como em humanos a dificuldade no diagnóstico clínico da SBY também é relatada, especialmente na fase latente da doença (Mantovani et al., 2007). Um método direto de diagnóstico da borreliose é o isolamento de Borrelia spp., o qual pode ser realizado em meios como o BSK, a partir de saliva, hemolinfa, tecidos de carrapatos; além de soro, fluidos corporais e tecidos de humanos e animais, obtendo-se crescimento da espiroqueta à temperatura de 33ºC em aproximadamente sete dias (Dickinson & Battle, 2000). Porém existem limitações a serem considerados, uma vez que, nem todas as espécies de Borrelia são de fácil cultivo ou ainda não são cultiváveis (Oliveira et al., 2004). A visualização destas espiroquetas pode ser realizada em microscopia de campo escuro, de contraste de fase ou em tecidos corados pela prata (Quinn et al., 1994). Outro método de diagnóstico e visualização destas espiroquetas é por meio de esfregaços sanguíneos periféricos, 17

31 preferencialmente corados pelo Giemsa ou pelo método de Fontana. No entanto, é necessário que o indivíduo e/ou animal apresente uma alta espiroquetemia no momento da execução da técnica, o que não ocorre normalmente na maioria das vezes (Matton & Melckebeke 1990). No Brasil, até o momento não foi isolado bactérias do complexo B. burgdorferi sensu lato nos fluidos biológicos e em tecidos de animais e humanos diagnosticados com a SBY, mesmo quando utilizando meios de cultivo próprios para este microrganismo (BSK) (Yoshinari et al., 2010). Diante disto, pesquisas recentes buscam outras formas de cultivo, isolamento e identificação de Borrelia spp. no país. Nestes contexto o cultivo in vitro de B. burgdorferi com linhagens celulares de carrapatos pode ser útil no esclarecimento de aspectos relativos a biologia desta bactéria dentro do vetor, demonstrando-se como ferramenta auxiliar para uma melhor compreensão da espiroqueta encontrada em nosso país (Teixeira, 2014). As análises laboratoriais para a detecção da borreliose são baseadas principalmente em técnicas imunológicas (Magnarelli et al., 2004). No Brasil as técnicas sorológicas têm sido amplamente utilizadas para pesquisa de anticorpos anti-igg e anti-igm tanto em humanos quanto em animais, nas áreas de risco ou enzoótica para borrelioses, servindo como suporte na confirmação de casos clínicos e para definir o perfil epidemiológico dessa enfermidade no país (Yoshinari et al., 2003). O ensaio ELISA indireto é o método mais utilizado para fins de diagnóstico e levantamento epidemiológico, em todas as regiões onde a borreliose é descrita, sendo considerado a principal ferramenta para diagnóstico desta enfermidade (Steere, 1989). No Brasil o ELISA indireto para detecção de IgG anti-b. burgdorferi já foi padronizado para humanos (Costa, 1998; Barros, 2000) bovinos (Ishikawa et al., 1997) cães (Soares et al., 1999) e equinos (Salles et al., 2002) utilizando-se antígeno sonicado total de B. burgdorferi stricto senso cepa G39/40 de origem americana, uma vez que ainda não se isolou a agente no país. 18

32 Cada técnica de detecção de anticorpos tem vantagens e desvantagens quanto à sensibilidade, especificidade, facilidade de padronização e custo (Magnarelli et al., 2004). Entretanto o ELISA é o mais empregado e reconhecido método para diagnosticar eficazmente a borreliose. Porém, devem ser estabelecidos critérios para cada laboratório, padrões de controle adequados, com o título mínimo e linha de corte ( cutoff ) seguros. Neste contexto os kits comerciais para diagnóstico devem ser evitados, devido a possibilidade de ocorrência de reações cruzadas com outras espécies de Borrelia spp. (Magnarelli, 1989). Diferentes tipos de antígenos podem ser utilizados na pesquisa de anticorpos anti- Borrelia spp., além do extrato de célula total sonicado da B. burgdorferi já mencionado, como as proteínas recombinantes (Magnarelli et al., 2010) os peptídeos (Craft et al., 1986) e até mesmo as espiroquetas íntegras, porém estas demonstraram resultados inferiores, quando comparado aos outros tipos de antígenos citados (Bennett, 1995). Várias proteínas de superfície de B. burgdorferi foram avaliadas para atuarem como antígeno em testes sorológicos, entretanto esta espiroqueta produz distintas proteínas externas de membrana durante a infecção em mamíferos (Stevenson et al., 2002). Esta alteração na expressão da superfície antigênica da B. burgdorferi é modulada em resposta ao ataque imune do hospedeiro (Liang et al., 2004) e devido essas variações antigênicas que ocorre nas espécies de Borrelia a identificação sorológica em nível de espécie pode ser comprometida (Hadani et al., 1985). Reações cruzadas entre anticorpos contra B. burgdorferi e Leptospira spp. já foram registradas em pesquisas soroepidemiológicas envolvendo animais, porém não foi demonstrado relação significativa (Wells et al. 1993). Reações cruzadas entre B. burgdorferi e Treponema spp. também já foram observadas em humanos e animais (Magnarelli et al., 1990), entretanto, posteriormente, foi reportado que reações cruzadas entre estes agentes não são significativas (Magnarelli & Anderson, 1998). Em um estudo realizado com bovinos, foi verificado reação cruzada entre as espécies B. burgdorferi, B. theileri e B. coriaceae, ao utilizarem a reação de 19

33 imunofluorescência indireta (RIFI) como método para o diagnóstico. Diante disto, foi constatado que nas regiões onde ocorre a coexistência dessas espiroquetas os estudos soroepidemiológicos podem ser comprometidos. Os autores avaliaram ainda o teste ELISA, o qual foi sugerido como a técnica de eleição para estudos epidemiológicos, pois não observaram reações cruzadas entre esses três agentes (Rogers et al., 1999). No Brasil reações cruzadas entre B. burgdorferi e B. theileri não podem ser descartadas, pois a B. theileri é uma espécie que acomete comumente bovinos e equinos, tendo como vetor o carrapato R. (Boophilus) microplus (Madureira, 2004). Outras técnicas sorológicas como a RIFI e o WB também podem ser utilizadas para a realização do diagnóstico de borrelioses (Magnarelli et al., 2004). A RIFI é uma técnica de utilização restrita, pois trata-se de uma prova subjetiva, poder ser usada para triagem ou ocasionalmente, quando as informações clínicas e epidemiológicas fortalecem o diagnóstico (Bennett, 1995). A maioria das pesquisa envolvendo métodos diagnóstico para borrelioses, relatam a superioridade do ELISA indireto, com relação a sensibilidade, especificidade e operacionalidade quando comparado a RIFI (Golightly, 1993). Já o WB por sua vez, tem sido empregado posteriormente ao ELISA como teste confirmatório (Soares et al., 2000). O problema deste teste é sua operacionalidade, pois é uma técnica demorada e de custo elevado também (Corrêa, 2011). Segundo Mantovani (2010), embora testes como o ELISA e WB sejam úteis do ponto de vista prático para método diagnóstico, estes devem ser interpretados com muita cautela, devido a possível ocorrência de falsos negativos e positivos. Yoshinari et al. (2010), afirmam ainda, que deve-se levar em consideração que os títulos dos ensaios no país são baixos e flutuantes e que a interpretação dos resultados de sorologias realizadas com metodologias adaptadas ao nosso meio é diferente das realizadas nos EUA e Europa e Ásia. 20

34 Diante dos possíveis gargalos do diagnóstico sorológico da B. burgdorferi e pelo fato desta espiroqueta nunca ter sido isolado no Brasil, os ensaios biomoleculares como a PCR tornaram-se ferramentas promissoras para a pesquisa da B. burgdorferi no país. A PCR é a mais precisa das técnicas e garante resultado específico através da amplificação do DNA do agente causal, podendo ser empregada em fluidos e tecidos de humanos e de animais, e em fragmentos de carrapatos (Lienbling et al., 1993). No entanto, nos últimos anos, várias tentativas de amplificação de genes que codificam proteínas de superfície (Osp) e flagelares de B. burgdorferi já foram realizadas sem sucesso no Brasil, possivelmente devido as características distintas da B. burgdorferi encontrada em nosso meio, uma vez que essa, é considerada de morfologia atípica, sem flagelos e desprovida de inúmeros constituintes da membrana externa. Isso explicaria também a baixa sensibilidade dos testes sorológicos para a B. burgdorferi de origem americana realizados no país (Mantovani, 2010), Contudo, Mantovani (2010) conseguiu pela primeira vez no Brasil, detectar positividade na PCR, apresentando no sequenciamento, homologia de 99% com B. burgdorferi em amostras de pacientes diagnosticados com SBY, de carrapatos, equino e bovino. Esses resultados moleculares só foram obtidos desenhando-se novos primers para amplificação do principal gene envolvido na síntese do gancho flagelar de Borrelia spp., o chamado flge (SAL et al., 2008). Entretanto segundo a autora, mesmo que o emprego destes primers, permitam a identificação do agente etiológico da SBY, este não é procedimento laboratorial útil na rotina diagnóstica. Vale ressaltar que a PCR é raramente utilizada na prática clínica, pois além de ser uma técnica onerosa, é necessário que existam borrelias circulantes ou em tecidos para a detecção (Magnarelli, 1995), o que é difícil de se encontrar, pois normalmente a enfermidade causada pela B. burgdorferi cursa com baixa espiroquetemia (Aguero-Rosenfeld et al., 2005). 21

35 No que diz respeito ao diagnostico diferencial da SBY, enfermidades como a sífilis, leishmaniose visceral, doenças autoimunes como lúpus eritematoso sistêmico, esclerodermia, artrite reumatoide, infecções virais, rickettsioses agudas e as neuropatias crônicas, podem cursar com sorologia falso-positiva na pesquisa da SBY (Yoshinari et al., 1999). Na presença de alterações fisiológicas como anemia, leucopenia, elevação de transaminases ou bilirrubinas deve-se cogitar a hipótese de coinfecções com outras zoonoses transmitidas por carrapatos como a babesiose e a ehrlichiose. Assim como, doentes que desenvolvem torpor, confusão mental ou coma, na presença de exantema cutâneo, devem ser diagnosticados também para Rickettsioses, como a Febre Maculosa brasileira ou novas Rickettsioses ditas brandas (Yoshinari et al., 2010). Tratamento em equinos Com relação ao tratamento da borreliose em equinos no Brasil, a literatura é escassa, pois não são comuns os relatos de casos de equinos sintomáticos à enfermidade, o que se têm feito é a extrapolação de informações pertinentes sobre o tratamento para a eliminação da B. burgdorferi em equinos nos EUA e outros países. No entanto, Basile (2016) descreveu resultados pertinentes quanto ao tratamento da borreliose em equinos no Brasil ao realizar experimento com animais pertencentes ao estado de São Paulo. Durante a terceira fase deste experimento, foi submetido ao tratamento com ceftriaxona sódica por via intravenosa dois equinos adultos infectados experimentalmente com B. burgdorferi cepa americana G39/40. Segundo a autora, já durante a primeira aplicação, os animais desenvolveram uma reação anafilactóide de moderada à severa, com consequência de síndrome cólica para um deles e laminite para o outro, demostrando a inviabilidade de se utilizar este fármaco para este tratamento. Posteriormente os equinos se recuperaram e foram finalmente tratados com oxitetraciclina. 22

36 A oxitetraciclina é amplamente utilizada como tratamento de eleição para a eliminação eficaz da B. burgdorferi em equinos nos EUA, como citam os autores, Chang et al., (2005) ao relatarem que somente a oxitetraciclina promoveu resultados negativos tanto na cultura quanto na PCR de tecidos (linfonodos, pele, fáscias musculares, membranas sinoviais, pericárdio, meninges). A oxitetraciclina pode ser prescrita na dosagem de 5,0 mg/kg, via intravenosa, a cada 24 h, durante quatro semanas, sendo observado elevada eficiência na eliminação da DL em equinos (Chang et al., 2005). Outras prescrições são ainda relatadas, como o tratamento realizado com oxitetraciclina (6,6 mg/kg, via intravenosa, a cada 12 h) durante três semanas, mostrando-se eficaz em equinos quando comparado ao uso de doxiciclina (10 mg/kg, VO, a cada 12 h) ou ceftiofur (2,2 mg/kg, IM, a cada 12 h) realizados em pôneis infectados experimentalmente (Divers et al., 2003). Medidas de controle e profilaxia As medidas de controle e profilaxia para a SBY em humanos e a borreliose em equinos no Brasil, baseia-se principalmente na redução do risco à picada do carrapato. No homem, o risco à picada pode ser evitado e/ou diminuído, tomando-se as seguintes precauções: primeiramente deve-se evitar ambientes infestados por carrapatos, como pastos e matas, no entanto quando tal for inevitável, deve-se caminhar sempre pelo centro das trilhas e usar roupas adequadas, com cores claras para fácil observação destes artrópodes, com mangas compridas e calças por dentro das meias ou uso de botas altas (Stanek et al., 2012). Segundo Ministério da Saúde, medidas como a investigação epidemiológica com delimitação de focos e áreas de risco para a enfermidade; ações de educação em saúde sobre o ciclo de transmissão, bem como, sobre os danos da doença; a orientação de moradores e/ou trabalhadores de áreas infestadas de vetores para a adoção de medidas de proteção do corpo e uso de repelentes e o tratamento dos casos suspeitos e/ou confirmados, conforme esquema de 23

37 antibioticoterapia preconizado são extremamente importantes e devem ser adotadas para uma eficiente prevenção e controle das infecções causadas pela Borrelia sp. encontrada em nosso país (Brasil, 2010). Nos equinos, o rigoroso controle ectoparasitário é medida indispensável para prevenção da borreliose. Neste contexto, o controle estratégico é uma das principais ferramentas a serem utilizadas para uma eficiente eliminação e/ou redução de infestações nos equinos. Esta técnica leva em consideração a resistência parasitária frente à bases utilizadas indiscriminadamente e os aspectos sazonais no ciclo de vida dos carrapatos. Baseia-se na aplicação de carrapaticidas adequados, de forma sistematizada e racional, o programa deve ser colocado em prática na época mais favorável ao produtor e menos favorável ao carrapato (Catto et al., 2010). Este tipo de método de controle visa a redução da carga parasitária sobre os animais, a descontaminação das pastagens e a manutenção das mesmas com baixo nível de infestação (Alves-Branco et al., 2001). O controle estratégico utilizado no combate aos carrapatos do gênero Amblyomma (A. cajennense e A. sculptum) e o R. (Boophilus) microplus são completamente diferentes, devidos as distintas características biológicas que estes apresentam. Portanto, deve-se respeitar os intervalos utilizados para o tratamento destes carrapatos (Leite et al., 1997). Os equinos devem ser mantidos em pastos separados dos bovinos, pois eles podem sofrer infestação mista, fato este, que pode gerar complicações e custos adicionais no controle ectoparasitário, pois as bases químicas e também as dosagens utilizadas podem ser distintas de acordo com a espécie do carrapato (Rodrigues et al., 2015). Vale ressaltar ainda que, a presença de animais em pastos sujos, tomados por plantas invasoras, influência de maneira negativa o controle dos carrapatos, pois favorece o aparecimento de outros animais da fauna silvestre como pequenos mamíferos, as quais podem atuar como hospedeiros destes ectoparasitas, em especial nas fases imaturas e se tornarem fontes para manutenção de carrapatos no ambiente (Oliveira, 2004). 24

38 Considerando-se as particularidades parasitárias e a dinâmica sazonal dos carrapatos A. cajennense e A. sculptum, recomenda-se um controle estratégico realizando banhos carrapaticidas a cada sete a dez dias durante o período correspondente à presença de larvas e ninfas (abril a outubro). Entre os intervalos dos banhos carrapaticidas, recomenda-se ainda, retornar esses animais na pastagem de origem, na tentativa de que esses sirvam como aspiradores de carrapatos, ou seja, funcionem como armadilhas para os carrapatos e com isso reduza a carga parasitária presente na pastagem, consequentemente, diminuindo o parasitismo nos animais (Leite et al., 1997). Tal prática também é recomendada no controle do carrapato R. (Boophilus) microplus (Rodrigues et al., 2005). Sugere-se que os banhos carrapaticidas devem ser realizados a cada sete dias, de abril a outubro, pelo menos no primeiro ano de implantação do controle estratégico, quando se tratar de áreas com altas taxas de infestações. Nos anos seguintes, quando for verificada a redução no número de carrapatos adultos, o controle pode abranger apenas o período de larvas (abril a julho), facilitando o tratamento, reduzindo os custos e os riscos de contaminação ambiental (Labruna et al., 2004). Para que os banhos carrapaticidas sejam efetivos, deve-se disponibilizar no mínimo, quatro a cinco litros de calda carrapaticida por equino adulto, seguindo-se as recomendações dos fabricantes. No entanto, muitas vezes isso é negligenciado pelos criadores, os quais utilizam volumes bem inferiores aos recomendados (Labruna, 2000). Com relação aos carrapaticidas comerciais a serem utilizados, Vieira et al. (2002) afirmam que os produtos comerciais à base de piretróides, são os únicos indicados para o tratamentos em equinos, sendo que, as formulações para aplicação na forma de banhos, aspersão ou pulverização são as mais indicadas. Em contra partida, os produtos à base de amitraz, por motivo de incompatibilidade específica, não devem ser utilizados em equinos, devido o risco de intoxicações irreversíveis. 25

39 Outras práticas como a rotação de pastejo e a integração lavoura-pecuária, que consiste na retirada dos animais da pastagem por pelo menos 60 dias e tem como objetivo promover a morte da maioria das larvas nas pastagens, podem auxiliar no controle dos carrapatos (Catto et al., 2010). 26

40 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AFZELIUS, A. Verhandlungen der Dermatologischen Gesellschaft zu Stockholm. Archives of Dermatology and Syphilogy, v.101, p , AGUERO-ROSENFELD, M.E.; WANG, G.; SCHWARTZ, I. et al. Diagnosis of Lyme borreliosis. Clinical Microbiology Reviews, v.18, p , ALVES-BRANCO, F.P.J.; PINHEIRO, A.C.; SAPPER, M.F.M. [2001] Os Programas Estratégicos para o Controle do Carrapato dos Bovinos. Comunicado técnico 43. Embrapa Pecuária Sul. Available at: < Accessed on: Dec. 15, BARBIERI, A.M.; VENZAL, J.M.; MARCILI, A. et al. Borrelia burgdorferi sensu lato infecting ticks of the Ixodes ricinus complex in Uruguay: first report for the Southern Hemisphere. Vector-Borne and Zoonotic Diseases, v.13, p , BARBOUR, A.G.; HAYES, S.F. Biology of Borrelia species. Microbiological Reviews, v.50, p , BARBOUR, A.G.; MAUPIN, G.O.; TELTOW, G.J. et al. Identification of an uncultivable Borrelia species in the hard tick Amblyomma americanum: possible agent of a Lyme disease-like illness. The Journal of Infectious Diseases, v.173, p , BARROS P. J. L. Caracterização clínica e laboratorial da doença de Lyme no Brasil, através de métodos imunológicos e reação em cadeia de polimerase f. Tese (Doutorado em Medicina) Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, São Paulo. BASILE, R.C. [2016]. Borreliosis in horses: epidemiology, experimental infection and therapeutic. Available at: < uence=3&isallowed=y> Accessed on: Nov. 19, BASILE, R.C.; ARAÚJO, R.A.; SILVA, M.H.M. et al. Borreliose de Lyme símile em equinos: uma doença negligenciada e emergente. Revista brasileira de Medicina Equina, v.8, p.12-16, BENNETT, C.E. Ticks and Lyme disease. Advances in Parasitology, v. 36, p , BRASIL - MINISTÉRIO DA SAÚDE. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Doenças infecciosas e parasitárias: guia de bolso. 8 ed. Brasília: Ministério da Saúde, p. BROOKS, J.B.B.; SILVA, C.; SOUZA, C.S. et al. Doença de Baggio-Yoshinari e acometimento neurológico. Relato de caso. Hansenologia Internationalis, v.37, p.91-92, BUCHWALD, A. Ein Fall von diffuser idiopathischer Hautatrophie. Derm Vierteljahresschr, v.10, p , BURGDORFER, W.; BARBUR, A.G.; HAYES, S.F. Lyme disease: a tick-borne spirochetosis? Science, v.216, p , BURGESS, E.C. Borrelia burgdorferi infection in Winconsin horses and cows. Annals New York Academy of Sciences, v.539, p , BUTLER, C.M.; HOUWERS, D.J.; JONGEJAN, F. et al. Borrelia burgdorferi infections with special reference to horses. A review. Veterinary Quarterly, v.27, p , CAMPOS, C.H.C.; PRADO, R.F.S.; CORDEIRO, M.D. et al. [2015]. Soroprevalência de Borrelia spp. em equinos de uso militar do município de São Borja, Estado do Rio Grande do Sul. Available at: < os/acervo/525.pdf> Accessed on: Oct. 20,

41 CATTO, J.B.; ANDREOTTI, R.; KOLLER, W.W. [2010]. Atualização sobre o controle estratégico do carrapato-do-boi. Comunicado técnico 123. Embrapa Gado de Corte. Available at: < Accessed on: Jan. 11, CHANG, Y.F.; KU, Y.W.; CHANG, C.F. et al. Antibiotic treatment of experimentally Borrelia burgdorferi-infected ponies. Veterinary Microbiology, v.107, p , CHANG, Y.F.; NOVOSOL, V.; MCDONOUGH S.P. et al. Experimental infection of ponies with Borrelia burgdorferi by exposure to Ixodid ticks. Veterinary Pathology, v.37, p.68-76, COHEN, D.; BOSLER, E.M.; BERNARD, W. et al. Epidemiologic studies of Lyme Disease in horses and their public health significance. Annals New York Academy of Sciences, v.539, p , CORDEIRO, M.D.; MEIRELES, G.S.; SILVA, J.B. et al. Soroprevalência para Borrelia spp. em cães no município de Seropédica, Estado do Rio de Janeiro. Revista Brasileira de Medicina Veterinária, v.34, p CORRADI, D.A.; CARVALHO, V.M.; COUTINHO, S.D. Anticorpos para Borrelia burgdorferi em indivíduos que trabalham com animais silvestres. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.58, p , CORRÊA F.N. Pesquisa de Anticorpos Homólogos anti-borrelia burgdorferi em Búfalos (Bubalus bubalis) do Estado do Pará f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica. CORRÊA, F. N. Estudo Epidemiológico de Borrelia burgdorferi, Babesia bovis, Babesia bigemina e Anaplasma marginale em Búfalos (Bubalus bubalis) do Estado do Rio de Janeiro f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica. COSTA, I.P. Pesquisa de anticorpos anti-borrelia e do agente etiológico, em soro e líquor de pacientes com manifestações clínicas compatíveis com a Doença de Lyme, no Estado de Mato Grosso do Sul f. Tese (Doutorado em Medicina) Universidade de São Paulo, São Paulo. COSTA, I.P.; BONOLDI, V.L.N.; YOSHINARI, N.H. Perfil clínico e laboratorial da Doença de Lyme-símile no Estado de Mato Grosso do Sul: análise de 16 pacientes. Revista Brasileira de Reumatologia, v.41, p , COSTA, I.P.; BONOLDI, V.L.N.; YOSHINARI, N.H. Search for Borrelia sp in ticks from potential reservoir in an urban forest in the State of Mato Grosso do Sul, Brazil: a short report. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.97, p , CRAFT, J.E.; FISCHER, D.K.; SHIMAMOTO, G.T. et al. Antigens of Borrelia burgdorferi recognized during Lyme Disease. The Journal of Clinical Investigation, v.78, p , DICKINSON, F.O.; BATTLE, M.C. Lyme borreliosis. The Infections Diseases Review, v.2, p.23-26, DIVERS, T.; CHANG, Y.F.; MCDONOUGH, P.L. [2003]. Equine Lyme disease: a review of experimental disease production, treatment efficacy and vaccine protection. Available at: < Accessed on: Jan. 11, DORWARD, D.W.; SCHWAN, T.G.; GARON, C.F. Immune capture and detection o Borrelia burgdorferi antigens in urine, blood or tissues from infected ticks, mice, dogs and humans. Journal of Clinical Microbiology, v.29, p , ENGSTROM, S.M.; SHOOP, E.; JOHNSON, R.C. Immunoblot interpretation criteria for serodiagnosis of early Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology, v.33, p ,

42 FILGUEIRA, A.L.; TROPPE, B.M.; GONTIJO FILHO, P.P. Doença de Lyme. Rio Dermatológico, Ano 2, n.1, FONSECA, A.H.; ISHIKAWA, M.M.; SOARES, C.O. et al. Lyme borreliosis serology in cattle in Brazil. Revista da Universidade Rural, Série Ciências da Vida, v.18, p.85-89, FONSECA, A.H.; SALLES, R.S.; SALLES, S.A.N. et al. Borreliose de Lyme-símile: uma doença emergente e relevante para a Dermatologia no Brasil. Anais Brasileiros de Dermatologia, v.80, p , FONSECA, A.H.; SOARES, C.O.; CRUZ, F.C.M. et al. Doença de Lyme em bovinos e caninos no estado do Rio de Janeiro. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINÁRIA, 23., 1994, Recife. Anais... Recife: SPEMVE, p.123. FONSECA, A.H.; SOARES, C.O.; ISHIKAWA, M.M. et al. Detection of Borrelia sp. in opossum (Marsupialia: Didelphidae) in Brazil. In: Annals of XXV Congress Of World Veterinary Association, Congress of Wordl Small Animal Of Veterinary Association, 20., 1995,Yokohama. Anais Yokohama, p FRANKE, J.; HILDEBRANDTB, A.; DORNA, W. Exploring gaps in our knowledge on Lyme borreliosis spirochaetes Updates on complex heterogeneity, ecology, and pathogenicity. Ticks and Tick-borne Diseases, v.4, p.11-25, FRASER, C.; CASJENS, S.; HUANG, W. et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature, v.390, p , GALO, K.R.; FONSECA, A.H.; MADUREIRA, R.C. et al. Frequência de anticorpos homólogos anti-borrelia burgdorferi em equinos na mesorregião metropolitana de Belém, Estado do Pará. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.29, p , GAUDITANO, G.; BONOLDI, V.L.N.; COSTA, I.P. et al. Síndrome de Lyme-símile ou complexo infecto-reacional do carrapato Síndrome de Baggio-Yoshinari. Revista Paulista de Reumatologia, v.4, p.16-17, GOLIGHTLY, M.G. Antibody assays. In: COYLE, P.K. (Ed.) Lyme Disease. Mosby Year Book: Boston, p GONÇALVES, D.D.; MOURA, R.A.; NUNES, M. et al. Borrelia burgdorferi sensu lato in humans in a rural area of Paraná State, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, v.46, p , GUEDES, E.; LEITE, R.C. Dinâmica sazonal de estádios de vida livre de Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum (Acari: Ixodidae) numa área endêmica para febre maculosa, na região de Coronel Pacheco, Minas Gerais. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v.17, p.78-82, GUSTAFSON, J.M.; BURGESS, E.C.; WACHAL, M.D. Intrauterine transmission of Borrelia burgdorferi in dogs. American Journal of Veterinary Research, v.54, p , HADANI, A.; GUGLIELMONE, A.A.; BERMÚDEZ, A.C. Deteccion de espiroquetas del genero Borrelia en bovinos de la provincia de Salta, Argentina. Revista de Medicina Veterinaria Argentina, v.66, p , HAMER, S.A.; TSAO, J.I.; WALKER, E.D. et al. Invasion of the Lyme Disease Vector Ixodes scapularis: Implications for Borrelia burgdorferi Endemicity. Ecohealth, v.7, p.47-63, HERXHEIMER, K.; HARTMANN, K.U. Acrodermatitis chronica atrophicans. Archiv fur Dermatologie und Syphilis, v.61, p , ISHIKAWA, M.M. Pesquisa de Anticorpos Anti Borrelia burgdorferi em Condições Experimentais e de Infecções Naturais em Bovinos f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica. ISHIKAWA, M.M.; FONSECA, A.H.; SOARES, C.O. et al. Padronização de ensaio imunoenzimático ELISA indireto para pesquisa de anticorpos IgG contra Borrelia 29

43 burgdorferi em bovinos. Revista Brasileira de Medicina Veterinária, v.19, p , JOHNSON, R.C.; SCHIMID, G.P.; HYDE, F.W. et al. Borrelia burgdorferi sp. Nov. etiologic agent of Lyme disease. International Journal of Systematic Bacteriology, v.34, p.496, JOPPERT, A.M. Estudo soro-epidemiológico da infecção por Borrelia burgdorferi em cães da região de Cotia, São Paulo f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo. KRUPKA, M.; RASKA, M.; BELAKOVA, J. et al. Biological aspects of Lyme disease spirochetes: unique bacteria of the Borrelia burgdorferi species group. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky Olomouc Czech Republic, v.151, p , LABRUNA, M.B. Aspectos da biologia e epidemiologia dos carrapatos de eqüinos no Estado de São Paulo f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) Universidade de São Paulo, São Paulo. LABRUNA, M.B.; AMAKU, M.; METZNER, J.A. et al. Larval Behavioral Diapause Regulates Life Cycle of Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae) in Southeast Brazil. Journal of Medical Entomology, v.40, p , LABRUNA, M.B.; CERQUEIRA, R.L.; OLIVEIRA, A.A.G. et al. Controle estratégico do carrapato Amblyomma cajennense em equinos. Ciência Rural, v.34, p , LABRUNA, M.B.; KERBER, C.E.; FERREIRA, F. et al. Risk factors to tick infestations and their occurrence on horses in the State of São Paulo, Brazil. Veterinary Parasitology, v.97, p.1-14, LEITE, R.C.; OLIVEIRA, P.R.; LOPES, C.M.L. et al. Alguns aspectos epidemiológicos das infestações por Amblyomma cajennense: uma proposta de controle estratégico. In: SIMPÓSIO SOBRE CONTROLE DE PARASITOS: CONTROLE DE PARASITOS DE EQUINOS. 2., 1997, Colina. Anais... Colina: Instituto de Zootecnia, p.9. LIANG, F.T.; YAN, J.; MBOW, M.L. et al. Borrelia burgdorferi Changes Its Surface Antigenic Expression in Response to Host Immune Responses. Infection and Immunity, v.72, p , LIENBLING, M.R.; NISHIO, M.J.; RODRIGUEZ, A. et al. The polymerase Caín reaction for the detection of Borrelia burgdorferi in human body fluids. The Arthrits Rheumatology, v.36, p , LOPES, N.T.C. Identificação de genoespécies do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.) circulantes na fauna ixodideológica em Portugal. 2013, 104f. Dissertação (Mestrado em Medicina) Universidade Nova de Lisboa, Lisboa. MA, Y.; WEISS, J.J. Borrelia birgdorferi outer surfasse lipoproteins OspA and OspB possess B-cell mitogenic and cytokine-stimulartory properties. Infection and Immunity, v.61, p , MADUREIRA, R.C. Freqüência de anticorpos homólogos anti- Borrelia burgdorferi em equinos dos municípios de Três Rios, Vassouras e Valença, Estado do Rio de Janeiro f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica. MADUREIRA, R.C. Sorologia para Borrelia burgdorferi em eqüinos do Estado do Pará e caracterização genotípica de isolados de Borrelia spp p. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica. MADUREIRA, R.C.; CORREA, F.N.; CUNHA, N.C. et al. Ocorrência de anticorpos homólogos anti-borrelia burgdorferi em equinos de propriedades dos municípios de Três Rios e Vassouras, estado do Rio de Janeiro. Revista Brasileira de Ciência Veterinária, v.14, p.43-46,

44 MADUREIRA, R.C.; RANGEL, C.P.; BARBOSA NETO, J.D. et al. Sorologia para Borrelia burgdorferi em equinos da ilha de Marajó e município de Castanhal, Pará, Brasil. Revista de Ciências da Vida, v.29, p.09-15, MAGNARELLI, L. A.; MILLER, J. N.; ANDERSON, J. F. et al. Cross-reactivity of nonspecific treponemal antibody in serologic tests for Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology, v.28, p , MAGNARELLI, L.A. Current status of laboratory diagnosis for Lyme disease. The American Journal of Medicine, v.98, p.10s-14s, MAGNARELLI, L.A. Quality of Lyme disease tests. Journal of the American Medical Association, v.262, p , MAGNARELLI, L.A.; ANDERSON, J.F. Enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of class-specific immunoglobulins to Borrelia burgdorferi. American Journal of Epidemiology, v.127, p , MAGNARELLI, L.A.; ANDERSON, J.F.; SHAW, E. et al. Borreliosis in equids in northeastern United States. American Journal of Veterinary Research, v.49, p , MAGNARELLI, L.A.; BUSHMICH, S.L.; SHERMAN, B.A. et al. A comparison of serologic tests for the detection of serum antibodies to whole-cell and recombinant Borrelia burgdorferi antigens in cattle. The Canadian Veterinary Journal, v.45, p , MAGNARELLI, L.A.; IJDO, J.W.; VAN ANDEL, A.E. et al. Serologic confirmation of Ehrlichia equi and Borrelia burgdorferi infections in horses from the northeastern United States. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.217, p , MAGNARELLI, L.A.; WILLIAMS, S.C.; FIKRIG, E. Seasonal prevalence of serum antibodies to whole cell and recombinant antigens of Borrelia burgdorferi and Anaplasma phagocytophilum in white-tailed deer in Connecticut. Journal of Wildlife Diseases, v.46, p , MANION, T.B.; KHAN, M.I.; DINGER, J. et al. Viable Borrelia burgdorferi in the urine of two clinically normal horses. The Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.10, p , MANNELLI, A.; BERTOLOTTI, L.; GERN, L. et al. Ecology of Borrelia burgdorferi sensu lato in Europe: transmission dynamics in multi-host systems, influence of molecular processes and effects of climate change. FEMS Microbiology Reviews, v.36, p , MANTOVANI, E. Identificação do agente etiológico da doença de Lyme símile brasileira (Síndrome de Baggio-Yoshinari) f. Tese (Doutorado em Medicina) Universidade de São Paulo, São Paulo. MANTOVANI, E.; COSTA, I.P.; GAUDITANO, G. et al. Description of Lyme disease-like syndrome in Brazil. Is it a new tick borne disease or Lyme disease variation? Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v.40, p , MANTOVANI, E.; MARANGONI, R.G.; GAUDITANO, G. et al. Amplification of the flge gene provides evidence for the existence of a Brazilian Borreliosis. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v.54, p , MATTON, P.; MELCKEBEKE, H.V. Bovine borrelioses: comparison on simple methods for detection of spirochaete in the blood. Tropical Animal Health Production, v.22, p , MIRANDA, J., MATTAR, S., PERDOMO, K. et al. [Seroprevalence of Lyme borreliosis in workers from Cordoba, Colombia]. Revista de Salud Pública, v.11, p ,

45 MONTANDON, C.E.; YOSHINARI, N.H.; MILAGRES, B.S. et al. Evidence of Borrelia in wild and domestic mammals from the state of Minas Gerais, Brazil. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology, v.23, p , NAKA, E.M.; COSTA, I.P.; ARÃO, C.A.P. et al. Pesquisa de anticorpos anti-borrelia e anti- Babesia em soro de crianças com manifestações clínicas e epidemiologia compatíveis com a doença de Lyme-simile no Estado de Mato Grosso do Sul. Revista Brasileira de Reumatologia, v.48, p.74-85, NASCIMENTO, D.A.G.; VIEIRA, R.F.C.; VIEIRA, T.S.W.J. et al. Serosurvey of Borrelia in dogs, horses, and humans exposed to ticks in a rural settlement of southern Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v.25, p , NAVA, S.; BEATI, L.; LABRUNA, M.B. et al. Reassessment of the taxonomic status of Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) with the description of three new species, Amblyomma tonelliae n. sp., Amblyomma interandinum n. sp. and Amblyomma patinoi n. sp., and reinstatement of Amblyomma mixtum Koch, 1844, and Amblyomma sculptum Berlese, 1888 (Ixodida: Ixodidae). Ticks and Tick-borne Diseases, v.5, p , OLIVEIRA, A.; FONSECA, A.H.; ISHIKAWA, M.M. et al. Cinética do crescimento de Borrelia burgdorferi (Spirochaetaceae) em diferentes meios de cultivo. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.24, p.61-64, OLIVEIRA, P.R. [2004]. Biologia e controle de Amblyomma cajennense. Available at: < Accessed on: Jan. 11, PIESMAN, J.; MATHER, T.N.; SINSKY, R.J. et al. Duration of tick attachment and Borrelia burgdorferi transmission. Journal of Clinical Microbiology, v.25, p , PRADO, R.F.S.; CORDEIRO, M.D.; PIRES, M.S. et al. [2014]. Soroprevalência de Borrelia spp. em equinos de uso militar no município de Resende, estado do Rio de Janeiro. Available at: < Accessed on: Sep. 11, PRITT, B.S.; MEAD, P.S.; JOHNSON, D.K.H. et al. Identification of a novel pathogenic Borrelia species causing Lyme borreliosis with unusually high spirochaetaemia: a descriptive study. Lancet Infectious Diseases, v.16, p , QUINN, P.J.; CARTER, M.E. MARKEY, B.K. et al. Clinical Veterinary Microbiology. 1.ed. London: Wolf Publishing, p REZENDE, J.; LOPES, F.A.; ALVES, F.C.G. et al. Detection of Borrelia burgdorferi Sensu Lato in Mato Grosso Do Sul, Brazil. JSM Tropical Medicine and Research, v.1, p.1003, RODRIGUES, B.D.; MEIRELES, V.M.B.; BRAZ, M.N. Borreliose de Lyme Símile Relato de Caso, Lyme Disease First Case Report in Pará. Revista Paraense de Medicina, v.21, p.63-67, RODRIGUES, V.S.; PINA, F.T.B.; BARROS, J.C. et al. [2015] Carrapato-estrela (Amblyomma sculptum): ecologia, biologia, controle e importância. Comunicado técnico 132. Embrapa Gado de Corte. Available at: < df> Accessed on: Jan. 10, ROGERS, A.B.; SMITH, R.D.; KAKOMA, I. Serologic cross-reactivity of antibodies against Borrelia theileri, Borrelia burgdorferi and Borrelia coriaceae in cattle. American Journal of Veterinary Research, v.60, p , SAL, M.S.; LI, C.; MOTALAB, M.A. et al. Borrelia burgdorferi uniquely regulates its motility genes and has an intricate flagellar hook-basal body structure. Journal of Bacteriology, v.190, p ,

46 SALLES, R.S. Borreliose de Lyme em equinos no estado do Rio de Janeiro f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica. SALLES, R.S.; FONSECA, A.H.; SCOFIELD, A. Sorologia para Borrelia burgdorferi latu sensu em eqüinos no estado do Rio de Janeiro. A Hora Veterinária, v.22, p.46-49, SANTOS, M.; RIBEIRO-RODRIGUES, R.; HADDAD, J.V. et al. Borreliose de Lyme. Anais Brasileiros de Dermatologia, v.85, p , SANTOS, M.; RIBEIRO-RODRIGUES, R.; TALHARI, C. et al. Presence of Borrelia burgdorferi Sensu Lato in patients with morphea from the Amazonic region in Brazil. International Journal of Dermatology, v.50, p , SATO, M.T.; SCHMITT, A.; GREBOGE, P. et al. Neurorretinite associada à ceratite intersticial: relato do primeiro caso de doença de Lyme no Estado do Paraná. Revista Brasileira de Oftalmologia, v.62, p , SHINJO, S.K.; GAUDITANO, G.; MARCHIORI, P.E. et al. Manifestação neurológica na Síndrome de Baggio-Yoshinari (Síndrome brasileira semelhante à doença de Lyme). Revista Brasileira de Reumatologia, v.49, p , SILVA, J.B.; BAÊTA, B.D.A.; RIBEIRO, C.C.D.U. et al. Detection of Antibodies against Borrelia burgdorferi in Periparturient Cows and Calves during the First Year Old by Indirect Enzyme- Linked Immunosorbent Assays (ielisa). Global Journal of Science Frontier Research, v.13, p.15-19, SINSKI, E.; WELC-FALECIAK, R.; ZAJKOWSKA, J. Borrelia miyamotoi: A human tickborne relapsing fever spirochete in Europe and its potential impact on public health. Advances in Medical Sciences, v.61, p , SOARES, C.O.; FONSECA, A.H.; ISHIKAWA, M.M. et al. Sorologia para borreliose em cães procedentes da Baixada Fluminense, estado do Rio de Janeiro. Revista Brasileira de Medicina Veterinária, v.21, p SOARES, C.O.; ISHIKAWA, M.M.; FONSECA, A.H. et al. Borrelioses, agentes e vetores. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.20, p.1-19, SOARES, H.S. Pesquisa de carrapatos, agentes transmitidos por carrapatos e tripanossomatídeos em animais silvestres dos estados do Mato Grosso e Pará f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, São Paulo. STANCHI, N.O.; BALAGUE, L. J. Lyme disease: antibodies against Borrelia burgdorferi in farm workers in Argentina. Revista de Saúde Pública, v.27, p , STANEK, G., WORMSER, G.P., GRAY, J. et al. Lyme borreliosis. Lancet, v.379, p , STANEK, G.; REITER, M. The expanding Lyme Borrelia complex - clinical significance of genomic species? Clinical Microbiology and Infection, v.17, p , STEERE, A.C. Lyme disease. The New England Journal of Medicine, v.321, p , STEERE, A.C.; MALAWISTA S.E.; SNYDMAN, D.R. et al. Lyme arthritis: an epidemic of oligoarticular arthritis in children and adults in three Connecticut comminities. The Arthrits Rheumatology, v.20, p. 7-17, STEVENSON, B.; EL-HAGE, N.; HINES, M. et al. Differential binding of host complement inhibitor factor H by Borrelia burgdorferi Erp surface proteins: a possible mechanism underlying the expansive host range of Lyme disease spirochetes. Infection and Immunity, v.70, p , TALHARI, S.; SCHETTINI, A.P.M.; PARREIRA, V.J. et al. Eritema crônico migrans/doença de Lyme Estudo de três casos. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE DERMATOLOGIA, 1987, Goiânia. Anais... Goiânia: Sociedade Brasileira de Dermatologia,

47 TEIXEIRA, R.C. Estudo da interação de Borrelia burgdorferi e Borrelia anserina (SPIROCHAETALES: SPIROCHAETACEAE) com diferentes linhagens de células de carrapatos (ACARI: IXODIDAE) f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica. VARELA, A.S.; LUTTRELL, M.P.; HOWERTH, E.W. et al. First culture isolation of Borrelia lonestari, putative agent of southern tick-associated rash illness. Journal of Clinical Microbiology, v.42, p , VIEIRA, A.M.L.; SOUZA, C.E.; LABRUNA, M.B. et al. [2002]. Manual de vigilância acarológica - estado de São Paulo, superintendência de controle de endemias SUCEN. Available at: < Accessed on: Nov. 22, WELLS, S.J.; TRENT, A.M.; ROBINSON, R.A. et al. Association between clinical lameness and Borrelia burgdorferi antibody in dairy cows. The American Journal Veterinary Research, v.54, p , YOSHINARI, N.H.; ABRÃO, M.G.; BONOLDI, V.L.M. et al. Coexistence of Antibodies to Tick borne Agents of Babesiosis and Lyme Borreliosis in Patients from Cotia County, State of São Paulo, Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.98, p , YOSHINARI, N.H.; BARROS, P.J.L.; CRUZ, F.C.M. et al. Clínica e sorologia da doença de Lyme no Brasil. Revista Brasileira de Reumatologia, v.32, p.57-61, YOSHINARI, N.H.; BARROS, P.J.L.; FONSECA, A.H. et al. Borreliose de Lyme. Zoonose emergente de interesse multidisciplinar. Newslab, v.12, p , YOSHINARI, N.H.; BARROS, P.J.L.; GAUDITANO, G. et al. Report of 57 cases of Lymelike disase (LLD) in Brazil. Arthritis & Rheumatology, v.43, p.188, YOSHINARI, N.H.; MANTOVANI, E.; BONOLDI, V.L.N. et al. Doença de Lyme-símile brasileira ou síndrome Baggio-Yoshinari: zoonose exótica e emergente transmitida por carrapatos. Revista da Associação Médica Brasileira, v.56, p ,

48 CAPÍTULO 1 Investigação epidemiológica de Borrelia burgdorferi em equinos do município de Sinop, estado de Mato Grosso, Brasil 35

49 Investigação epidemiológica de Borrelia burgdorferi em equinos do município de Sinop, estado de Mato Grosso, Brasil Suyane Nayara Garcia Socoloski 1, Bruno Gomes de Castro 2, Matheus Dias Cordeiro 3, Adivaldo Henrique da Fonseca 3, Marcio Barizon Cepeda 3, Luciano Bastos Lopes 4 RESUMO Borrelia burgdorferi sensu stricto é o principal agente etiológico da Doença de Lyme (DL) nos Estados Unidos da América (EUA). No Brasil, acredita-se que uma variante geneticamente similar a essa espiroqueta, seja o agente causal da Síndrome de Baggio-Yoshinari (SBY), uma zoonose emergente brasileira, transmitida por carrapatos, que apresenta manifestações clínicas semelhantes à DL. Os equinos são apontados como importantes hospedeiros na cadeia de transmissão e na manutenção desta espiroqueta no país. Diante disso, objetivou-se com esse estudo detectar a frequência de anticorpos homólogos da classe IgG anti-b. burgdorferi cepa americana G39/40, em equinos do município de Sinop MT, por meio de inquérito soroepidemiológico utilizando o Ensaio de Imunoadsorção Enzimática (ELISA) indireto, como teste diagnóstico. Para tal, foram coletadas amostra de sangue de 367 equinos, provenientes de 81 propriedades na região centro-norte de Mato Grosso. Foi aplicado também um questionário epidemiológico durante as visitas realizadas, obtendo-se informação de identificação e caracterização dos animais e suas respectivas propriedades. Das 367 amostras submetidas a análise sorológica, 214 foram positivas no ELISA indireto para B. burgdorferi sensu stricto, determinando prevalência aparente de 54,04%. Concomitantemente, dos 367 equinos avaliados, amostras de sangue total de 89 animais foram submetidas à análise biomolecular pela nested- Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). De acordo com o teste da PCR, nenhuma das amostras foi positiva, sendo que desses 89 animais testados, 53 eram positivos no ELISA indireto e 36 1 Programa de Pós-Graduação em Zootecnia-ICAA-UFMT; Alexandre Ferronato nº 1200 Setor Industrial, Sinop- MT; (66) ; suyane_garcia@hotmail.com. 2 Laboratório de Doenças Infecciosas-UFMT; Alexandre Ferronato nº 1200 Setor Industrial, Sinop-MT; (66) ; castrobg@gmail.com. 3 Laboratório de Doenças Parasitárias-UFRRJ; Rodovia BR 465, Km 07, s/n - Zona Rural, Seropédica-RJ; (21) ; mathcordeiro@hotmail.com, adivaldofonseca@yahoo.com, marciobarizoncepeda@yahoo.com.br. 4 Embrapa Agrossilvipastoril, Sinop-MT; Rodovia MT, nº 222, Km 2,5, Zona Rural, Sinop-MT; (66) ; luciano.lopes@embrapa.br. 36

50 negativos. Das 81 propriedades analisadas, 75 (92,59%) tiveram pelo menos um equino soropositivo para B. burgdorferi, sendo que destas, cerca de 89% apresentavam pastos próximos à matas, o que predispõe o contato dos equinos com espécies de animais silvestres e carrapatos. Os resultados encontrados reforçam a hipótese da presença de anticorpos anti- Borrelia spp. em equinos no estado de Mato Grosso. Palavras-chave: Equinocultura, Carrapato, Borreliose, ELISA, PCR. ABSTRACT Borrelia burgdorferi sensu stricto is the main etiologic agent of Lyme disease (LD) in the United States of America (USA). In Brazil, a variant genetically similar to this spirochete is believed to be the causative agent of Baggio-Yoshinari Syndrome (BYS), a Brazilian emerging zoonosis, transmitted by ticks, that presents clinical manifestations similar to LD. Equines are indicated as important hosts in the transmission chain and in the maintenance of this spirochete in the country. Therefore, the aim of this study was to detect the frequency of homologous antibodies of the class. IgG anti-b. burgdorferi American strain G39/40, in horses of the municipality of Sinop - MT, by means of a seroepidemiological survey using the indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) as diagnostic test. Blood samples were collected from 367 horses from 81 properties of Mato Grosso. It was also applied an epidemiological survey conducted during visits, obtaining identification information and characterization of the animals and their properties. From the 367 samples submitted to serological analysis, 214 were positive according indirect ELISA for B. burgdorferi sensu stricto, determining an apparent prevalence of 54.04%. Concomitantly, from the 367 horses evaluated, whole blood samples from 89 animals were submitted to biomolecular analysis by the nested-polymerase Chain Reaction (PCR). According to the PCR test, none of the samples were positive in this test. Considering these 89 animals tested, 53 were positive in the indirect ELISA and 36 negative. From the 81 analyzed properties, 75 (92.59%) had at least one B. burgdorferi seropositive equine, of which about 89% presented pastures near the forest, which predisposes the contact of the horses with wild animal species and ticks. The results support the hypothesis of the presence of anti-borrelia spp. in the state of Mato Grosso. Key-words: Echinoculture, Tick, Borreliosis, ELISA, PCR. 37

51 INTRODUÇÃO Borrelia burgdorferi sensu stricto é uma espiroqueta de importância epidemiológica em saúde pública e animal. Na América do Norte é responsável por causar a maior parte dos casos da Doença de Lyme (DL), uma antropozoonose transmitida por carrapatos do complexo Ixodes ricinus, frequentemente diagnosticada, nos Estados Unidos da América (EUA), na Europa e Ásia. Essa espiroqueta, juntamente com a B. garinii, B. afzelii e mais de dez outras espécies conhecidas, compõem o chamado complexo Borrelia burgdorferi sensu lato, agente etiológico da DL no hemisfério norte (Franke et al. 2013). No Brasil, uma enfermidade semelhante a DL tem sido relatada desde o fim da década de 80 (Talhari et al. 1987). A denominada Síndrome de Baggio-Yoshinari (SBY), é definida como zoonose emergente tipicamente brasileira, transmitida por carrapatos dos gêneros Amblyomma e/ou Rhipicephalus, responsável pelo desenvolvimento de manifestações clínicas semelhantes à Doença de Lyme, exceto pela ocorrência de recidivas e desordens imunológicas, ao longo da prolongada evolução clínica (Yoshinari et al. 2010). Acredita-se até o momento, que seu agente etiológico seja uma variante geneticamente similar de B. burgdorferi sensu stricto ou ainda, uma nova espécie de Borrelia até então, não identificada. Essas espiroquetas, ainda não foram isoladas nos fluidos biológicos ou em tecidos de pacientes diagnosticados com a SBY no Brasil (Mantovani et al. 2012). Os equinos são apontados como importantes hospedeiros no ciclo da SBY, estudos sorológicos tem demonstrado que espiroquetas do gênero Borrelia circulam entre equinos em diferentes regiões do país e é possível que estes animais, além de sentinelas e carreadores de carrapatos transmissores de Borrelia spp., possam ainda, estar funcionando como hospedeiros reservatórios, ou seja, animais assintomáticos a infecção (Campos et al. 2015). Contudo, até o momento não existe na literatura, relato de levantamento soroepidemiológicos para B. burgdorferi em equinos no estado de Mato Grosso, Brasil. Diante disto, objetivou-se com este estudo, determinar a prevalência de equinos soropositivos para anticorpos homólogos da classe IgG anti-b. burgdorferi sensu stricto cepa americana G39/40, do município de Sinop, estado de Mato Grosso, por meio de inquérito soroepidemiológico utilizando o Ensaio de Imunoadsorção Enzimática (ELISA) indireto como método diagnóstico. 38

52 MATERIAL E MÉTODOS Região do estudo Este estudo foi realizado em propriedades com presença de equinos localizadas no município de Sinop MT (Figura 2). De acordo com o Instituto de Defesa Agropecuária do Estado de Mato Grosso (INDEA-MT), em 2015, o plantel de equinos registrado no município era de animais, distribuídos em 412 propriedades (Anexo 1). Figura 2. Mapa esquemático de Sinop MT. Definição da amostra O cálculo amostral para a estimativa da prevalência da infecção por Borrelia sp. nos equinos foi realizado através da ferramenta online EpiTools (AusVet Animal Health Services 2016). Foi incluído neste cálculo o plantel total de 1853 equinos. Como prevalência esperada, foi considerado o valor de 50% devido a prevalência desconhecida da B. burgdorferi em equinos no estado. O erro máximo esperado foi de 10%. O nível de confiança definido para o estudo foi de 95%. De acordo com os resultados do cálculo amostral, o número mínimo de animais a serem avaliados foi de 358. Foi definido então, que propriedades que abrigassem menos de cinco equinos, a coleta de sangue deveria ser realizada em todos equinos, enquanto que, as propriedades que abrigassem mais de cinco equinos, a coleta seria realizada apenas em 20% destes. 39

53 Elaboração do questionário zoosanitário Foi construído um questionário epidemiológico adaptado de Madureira (2004), no intuído de se obter informações para caracterização dos animais, bem como, de suas respectivas propriedades (Anexo 2). Dados de identificação da propriedade e dos animais como: nome, raça (Quarto de Milha, Mestiços e outras raças), sexo (Macho e Fêmea) idade (até 4 anos, > 4 até 15 anos e > 15 anos) e finalidade (Esporte, Serviço, Reprodução e mais de uma finalidade), além de informações sobre o manejo sanitário, visando principalmente o controle ectoparasitário, foram incluídos no questionário. Estes, foram aplicados através de entrevista presencial durante a coleta de sangue dos equinos. Coleta das amostras A amostragem foi realizada por conveniência, sendo que 81 propriedades foram visitadas (Figura 3). Coletou-se sangue através de venopunção jugular, independente da raça, sexo ou idade. Para a realização do ELISA indireto foram coletadas amostras de sangue de 367 equinos em tubos sem anticoagulante, as quais posteriormente foram processadas no Laboratório de Doenças Infecciosas da Universidade Federal de Mato Grosso (LDI-UFMT) - Campus Sinop, através de centrifugação e os soros obtidos foram aliquotados em microtubos e armazenados à -20 C até o momento da análise sorológica. Já para a realização da nested- Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), foram coletadas amostras de sangue dos últimos 89 equinos avaliados em tubos com anticoagulante EDTA, as quais foram aliquotados em microtubos e armazenados à -20 C até o momento da análise molecular. Figura 3. Delimitação geográfica do município de Sinop MT e as regiões (círculos vermelhos) onde foram visitadas as propriedades avaliadas neste estudo. 40

54 Análise sorologia A sorologia para B burgdorferi foi realizada no Laboratório de Doenças Parasitárias da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (LDP-UFRRJ) através da técnica ELISA, padronizada por Salles et al. (2002). Para tal, foram utilizadas microplacas de poliestireno de 96 orifícios (CORNING ), as quais foram inicialmente sensibilizadas com 100 μl do antígeno de B. burgdorferi cepa americana G39/40 diluído a 20 μg/ml em tampão carbonato ph 9,6 e então incubadas durante 12 horas em câmara úmida à 4ºC. Após está etapa de sensibilização, as placas foram lavadas três vezes com tampão salino fosfato PBS Tween 20 0,05% ph 7,4 (PBS T 20), bloqueadas com 200 μl de Leite em pó 6% diluído em PBST e incubadas por uma hora e trinta minutos, em câmara úmida a 37º Celsius. Em seguida, foram realizadas novamente as três lavagens das placas. Os soros controles positivos e negativos utilizados para o teste pertenciam ao banco de soro do LDP-UFRRJ. Foram utilizados sete soros controles negativos e dois controles positivos em cada placa, os quais juntamente com os soros testes, foram diluídos na concentração de 1:800 em PBS T 20 e dispostos 100 μl nas placas e então incubados à 37º Celsius por mais uma hora e trinta minutos em câmara úmida. Posteriormente, três lavagens foram realizadas como na etapa anterior. Em seguida, foi disposto 100 μl de conjugado IgG de coelho, anti-igg equina ligado à fosfatase alcalina (Sigma Chemical) na diluição de 1:1000 em PBST e então as placas foram incubadas por mais uma hora e trinta minutos nas mesmas condições anteriores e após isso, foi realizado as lavagens das placas novamente. Posterior à está última incubação, foi empregado 100 μl do substrato revelador Paranitrofenilfosfato de Sódio (PNPP - SIGMA Chemical) diluído em Tampão de Dietanolamina ph 9,8 na concentração de 1 mg/ml. Logo em seguida, as placas foram monitoradas em espectrofotômetro para microplacas de 96 orifícios (Termo Scientific Uniscience Multiskan FC) com o filtro de comprimento de onda de 405 ηm, até que os dois controles positivo atingissem densidade óptica próxima de 1. Esta última leitura foi salva e posteriormente utilizada na avaliação do resultado do teste. Os sete soros controles negativos foram utilizados para definir o ponto de corte Cutoff do ensaio, seguindo metodologia descrita por Frey et al. (1998), com nível de confiança de 99,0%. A fórmula matemática de Frey se baseia em um fator t (distribuição t-student), segundo a média mais três vezes o desvio padrão dos valores da densidade óptica (DO) dos controles negativos. Posteriormente, o valor de cutoff de cada uma das placas foi igualado a 100, aplicando-se a fórmula (DO soro teste x 100/cutoff), no intuito de se corrigir o efeito da variação 41

55 da DO obtida com a leitura das diferentes placas testadas, sendo assim, os resultados de cada soro teste foram expressos na forma de Índice de Densidade Óptica (IDO). Análise molecular Foi realizado ainda, análise molecular através da nested-pcr de 89 amostras de sangue dos 367 equinos coletados, sabendo-se que destes, 53 animais eram positivos no ELISA indireto e 36 eram negativos. O DNA das amostras de sangue dos equinos e do controle positivo foram extraídos utilizando-se o kit comercial Wizard Genomic DNA Purification Kit (marca PROMEGA), conforme recomendação do fabricante. A PCR, foi realizada de acordo com Barbour et al. (1996). O DNA extraído das 89 amostras de sangue foi analisado individualmente pela nested-pcr com iniciadores direcionados para amplificação de porções do gene flagelina B (flab) presente em espiroquetas do gênero Borrelia. Para a primeira reação foram utilizados os primers FlaLL (5 - ACATATTCAGATGCAGACAGAGGT-3 ) e FlaRL (5 - GCAATCATAGCCATTGCAGATTGT-3 ) em um volume final de 25 μl contendo 2,5 μl de DNA, 1.0 μm de cada primer, Tris-HCl (10mM), MgCl2 (1.5 mm), dntp (1.25 mm) e TaqDNA polimerase (1.5 U). Para a segunda reação foram utilizados os primers FlaLS (5 - AACAGCTGAAGAGCTTGGAATG-3 ) e FlaRS (5 - CTTTGATCACTTATCATTCTAATAGC-3 ) num volume final de 25 μl contendo 1 μl do produto final da reação primária somando aos reagentes nas mesmas concentrações citados acima. As condições no Thermociclador para ambas as reações (primária e nested) consistiram em uma desnaturação inicial por 5 minutos a 95ºC, seguido de 40 ciclos, com desnaturação a 95ºC por 1 minuto, anelamento a 55ºC por 1 minuto, e extensão a 72ºC por 1 minuto. Em cada bateria de reação foram utilizados como controle positivo, DNA de Borrelia anserina em cultivo e água como controle negativo. Como produto final do nested-pcr foi esperado uma banda de 330 nt a ser visualizada em gel de agarose a 1,5%, corado por brometo de etídeo e visualizado à trans-iluminação pela ultra violeta. Análise estatística Após o diagnóstico laboratorial, os dados foram armazenados em planilhas no programa Excel (Microsoft ) e posteriormente foram analisados. A prevalência animal foi estimada definindo o peso específico de cada unidade amostral dentro do seu plantel e na população em 42

56 estudo, segundo método descrito por Dargatz e Hill (1996) e Dohoo et al. (2003) através do pacote estatístico Stata 11 (Statistics, Stata Corporation, USA). RESULTADOS A análise soro-epidemiológica das 367 amostras de soros testadas revelou que 214 animais foram reagentes positivos ao ELISA indireto para a pesquisa de anticorpos da classe IgG anti-b. burgdorferi, determinando prevalência aparente de 54,04%. Os índices de densidade óptica encontrados, variaram de 45,93 a 672,97 (figura 4). Figura 4. Distribuição dos índices de densidades ópticas dos soros-teste em relação ao Cutoff (DOx100/ cutoff ) obtidas a partir do ensaio ELISA indireto para Borrelia burgdorferi em equinos do município de Sinop-MT. A avaliação dos dados obtidos a partir do questionário zoosanitário aplicado nas propriedades visitadas, com relação ao gênero dos equinos estudados, revelou que as fêmeas obtiveram maior frequência de animais soropositivos em relação aos machos (Tabela 2). 43

57 Tabela 2. Frequência sorológica de anticorpos anti-borrelia burgdorferi em equinos (n=367) do município de Sinop, Estado de Mato Grosso, determinada pelo ELISA indireto, em relação ao gênero dos animais analisados. Gênero Macho Fêmea Relativa Absoluta Relativa Absoluta Positivo 54,12% 28,61% 63% 29,70% (105/194) (105/367) (109/173) (109/367) Negativo 45,87% 24,25% 36,99% 17,43% (89/194) (89/367) (64/173) (64/367) Total 100% 52,86% 100% 47,13% (194/194) (194/367) (173/173) (173/367) Já com relação a faixa etária, a qual foi dividida em três grupos, foi observado que a frequência de animais soropositivos foi diretamente proporcional à idade dos equinos, onde os equinos idosos apresentaram a maior frequência de positivos e assim consecutivamente (Tabela 3). Tabela 3. Frequência sorológica de anticorpos anti-borrelia burgdorferi em equinos (n=367) do município de Sinop, Estado de Mato Grosso, determinada pelo ELISA indireto, em relação à faixa etária dos animais avaliados. Faixa etária Até 4 anos > 4 15 anos > 15 anos Relativa Absoluta Relativa Absoluta Relativa Absoluta Positivo 51,87% 18,80% 61,32% 35,42% 68,18% 4,08% (69/133) (69/367) (130/212) (130/367) (15/22) (15/367) Negativo 48,12% 17,43% 38,67% 22,34% 31,81% 1,90% (64/133) (64/367) (82/212) (82/367) (7/22) (7/367) Total 100% 36,23% 100% 57,76% 100% 5,99% (133/133) (133/367) (212/212) (212/367) (22/22) (22/367) A análise segundo as diferentes raças dos animais avaliados no estudo, revelaram que: 55,68% dos equinos da raça Quarto de Milha, 59,39% dos equinos Mestiços e 62,68% dos 44

58 equinos de outras raças, 14 animais da raça Paint Horse, 14 da raça Mangalarga, 11 da raça Crioulo e 3 Pôneis, foram positivos no ELISA indireto para B. burgdorferi, sendo portanto, a maior frequência encontrada nos equinos classificados em outras raças (Tabela 4). Tabela 4. Frequência sorológica de anticorpos anti-borrelia burgdorferi em equinos (n=367) do município de Sinop, Estado de Mato Grosso, determinada pelo ELISA indireto, em relação as diferentes raças dos animais estudados. Raça Quarto de Milha Mestiços Outras Raças Relativa Absoluta Relativa Absoluta Relativa Absoluta Positivo 55,68% 25,34% 59,39% 21,52% 62,68% 11,44% (93/167) (93/367) (79/133) (79/367) (42/67) (42/367) Negativo 44,31% 20,16% 40,60% 14,71% 34,32% 6,26% (74/167) (74/367) (54/133) (54/367) (23/67) (23/367) Total 100% 45,50% 100% 36,23% 100% 18,25% (167/167) (167/367) (133/133) (133/367) (67/67) (67/367) Com relação as diferentes finalidades que os equinos avaliados neste estudo eram submetidos, foi observado que os animais que eram submetidos a mais de uma finalidade, apresentaram a maior frequência de soropositivos em relação aos outros que eram direcionados para atividades específicas (Tabela 5). 45

59 Tabela 5. Frequência sorológica de anticorpos anti-borrelia burgdorferi em equinos (n=367) do município de Sinop, Estado de Mato Grosso, determinada pelo ELISA indireto, em relação as diferentes finalidades que os animais estudados eram submetidos. Finalidade Esporte Serviço Reprodução > 1 Finalidade Relativa Absoluta Relativa Absoluta Relativa Absoluta Relativa Absoluta Positivo 48,44% 21,25% 61,33% 12,53% 64,86% 6,53% 70,21% 17,98% (78/161) (78/367) (46/75) (46/367) (24/37) (24/367) (66/94) (66/367) Negativo 51,55% 22,61% 38,66% 7,90% 35,13% 3,54% 29,78% 7,62% (83/161) (83/367) (29/75) (29/367) (13/37) (13/367) (28/94) (28/367) Total 100% 43,86% 100% 20,43% 100% 10,08% 100% 25,61% (161/161) (161/367) (75/75) (75/367) (37/37) (37/367) (94/94) (94/367) Das 81 propriedades avaliadas neste estudo, 75 (92,59%) apresentaram pelo menos um equino soropositivo para pesquisa de anticorpos anti-b. burgdorferi. De acordo com a análise dos questionários aplicados nestas propriedades foi observado que, 89,33% (67/75) apresentavam pastos próximos à matas e apenas 10,66% (8/75) não apresentavam. Em 53,33% (40/75) propriedades, os responsáveis entrevistados, responderam ter problemas frequentes com infestações de carrapatos nos equinos, enquanto que nas outras 46,66% (35/75) os entrevistados afirmaram não ter problemas de infestações nos animais. Os valores de frequência relativa e absoluta das propriedades com relação à presença de pastos próximos a matas e presença de carrapatos estão descritos na Tabela 6. 46

60 Tabela 6. Frequência de propriedades com presença de equinos soropositivos para anticorpos anti-borrelia burgdorferi do município de Sinop, Estado de Mato Grosso, determinada pelo ELISA indireto, em relação a presença de pastos próximos à matas e presença de carrapatos nos equinos. Propriedades Pastos próximos à matas Presença de carrapatos Sim Não Sim Não Relativa Absoluta Relativa Absoluta Relativa Absoluta Relativa Absoluta Positivo 93,05% 82,71% 88,88% 9,87% 90,90% 49,38% 94,59% 43,20% (67/72) (67/81) (8/9) (8/81) (40/44) (40/81) (35/37) (35/81) Negativo 6,94% 6,17% 11,11% 1,23% 9,09% 4,93% 5,40% 2,46% (5/72) (5/81) (1/9) (1/81) (4/44) (4/81) (2/37) (2/81) Total 100% 88,88% 100% 11,11% 100% 54,32% 100% 45,67% (72/72) (72/81) (9/9) (9/81) (44/44) (44/81) (37/37) (37/81) De acordo com as informações obtidas com relação ao controle e profilaxia dos carrapatos nas propriedades visitadas que apresentaram animais positivos no ELISA indireto, foi observado que: em 58 (77,33%) propriedades era utilizado carrapaticidas, sendo que destas, em 44 (75,86%) o tratamento era realizado apenas quando os responsáveis pelos equinos visualizam carrapatos no corpo dos animais, e nas outras 14 (24,13%) propriedades o controle era realizado de maneira sistemática com protocolos de manejo para utilização dos carrapaticidas, enquanto que em 17 (22,66%) propriedades não era realizado nenhum tipo de tratamento. A Tabela 7, apresenta os valores de frequência relativa e absoluta das propriedades com relação a utilização de carrapaticida. 47

61 Tabela 7. Frequência de propriedades com presença de equinos soropositivos para anticorpos anti-borrelia burgdorferi do município de Sinop, Estado de Mato Grosso, determinada pelo ELISA indireto, em relação à utilização de carrapaticida para o controle e profilaxia de infestações. Propriedades Utilização de carrapaticida Sim Não Relativa Absoluta Relativa Absoluta Positivo 92,06% 71,60% 94,44% 20,98% (58/63) (58/81) (17/18) (17/81) Negativo 7,93% 6,17% 5,55% 1,23% (5/63) (5/81) (1/18) (1/81) Total 100% 77,77% 100% 22,22% (63/63) (63/81) (18/18) (18/81) Sobre as propriedades avaliadas neste estudo, vale ainda ressaltar que das 81 visitadas, oito apresentavam apenas um equino, sendo que destas, em seis (75%), estes animais foram positivos no ELISA indireto. A criação de outras espécies de animais junto com os equinos foi observada em cerca de 94% (76/81) das propriedades estudadas e em 92,10% (70/76) destas, foi verificado equinos soropositivos para B. burgdorferi. Os cães e os bovinos foram as espécies mais frequentes e o pastejo consorciado de bovinos e equinos ocorria em 76,54% (62/81) das propriedades, destas 90,32% (56/62) apresentaram equinos positivos ao ELISA indireto. Com relação à análise molecular, das 89 amostras de sangue analisadas pela PCR, sendo que destas 53 eram positivas no ELISA indireta, nenhuma amostra foi positiva, para os primers utilizados como amplificadores de porções do gene flagelina B (flab) presente em espiroquetas do gênero Borrelia. DISCUSSÃO A prevalência obtida no presente estudo de 54,04% de equinos soropositivos para B. burgdorferi é maior do que as prevalências já relatadas em outros levantamentos soroepidemiológicos realizados em equinos em diferentes estados brasileiros. A elevada frequência, cerca de 89%, de propriedades que possuíam pastos próximos à matas observada 48

62 neste estudo, pode estar associada com a elevada soropositividade de B. burgdorferi encontrada nos equinos, uma vez que, este fato predispõe o contato dos equinos com espécies de animais silvestres, os quais são considerados possíveis reservatórios. Basile (2016) ao realizar levantamento soroepidemiológico para B. burgdorferi em equinos no estado de São Paulo, além de obter média de 21% de soropositividade nestes animais, afirmou ainda, que este existe grande relação entre a soropositividade, a presença de carrapatos A. sculptum e a presença de capivaras nas propriedades. Salles et al. (2002) descreveram ainda que a alta percentagem, cerca de 43%, de equinos soropositivos para B. burgdorferi encontrada no município de Seropédica/RJ, teria correlação direta, com o fato desses animais serem criados extensivamente e com alta infestação por carrapatos das espécies A. cajennense, Dermacentor nitens e Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Deve-se considerar ainda, a possível relação entre a presença do pastejo consorciado de equinos e bovinos, observada em 76,54% das propriedades visitadas no presente estudo e a elevada soroprevalência encontrada nos equinos para Borrelia spp., uma vez que, existe a possibilidade de ocorrência de reações cruzadas entre B. burgdorferi e B. theileri, responsável por causar a borreliose bovina, mas também pode ser encontrada em equinos e ovinos (Soares et al. 2000). Segundo Rich et al. (2001) há uma estreita associação filogenética entre B. theileri e outras espiroquetas do gênero Borrelia que causam manifestações clínicas da DL. Rogers et al. (1999), ao utilizarem a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para sorologia em bovinos, observaram reação cruzada entre as espiroquetas B. burgdorferi, B. coriaceae e B. theileri, no entanto, o mesmo resultado não foi observado ao utilizarem o ensaio ELISA indireto com antígenos de extrato de célula total. Porém os autores alertaram para a possíveis ocorrência de falsos positivos em testes sorológicos, principalmente em áreas onde esses agentes coexistem. No Brasil reações cruzadas entre B. burgdorferi e B. theileri não podem ser descartadas, como demostrou Madureira (2007) ao realizar a primeira descrição genotípica da B. theileri no país. Campos et al. (2015) ao verificarem prevalência de 44,66% para Borrelia spp. em equinos em São Borja/RS, relataram que a presença do pastejo misto de equinos e bovinos, possibilitou a infestação dos equinos pelo carrapato R. (Boophilus) microplus, o qual é o transmissor da B. theileri. Os autores sugeriram então que a presença desse vetor estava associada à soropositividade para B. burgdorferi e que as reações cruzadas entre estas espiroquetas devem ser consideradas. 49

63 Nascimento (2012) encontrou cerca de 39% de equinos positivos para B. burgdorferi, porém utilizando técnica de diagnóstico distinta para triagem, ao invés do ELISA indireto foi utilizado a RIFI precedida pelo método de Western Blot (WB) para confirmação. Outros estudos realizados no Brasil para a pesquisa de anticorpos anti-b burgdorferi em equinos através do ELISA indireto, apresentaram prevalências inferiores à relatada neste estudo, como é o caso dos estudos de Prado et al. (2014) realizado em equinos de uso militar no município de Resende-RJ, que encontraram positividade em 29,89% dos animais. Madureira et al. (2007) realizado em equinos de propriedades dos municípios de Três Rios e Vassouras, também no estado do Rio de Janeiro, que encontraram 28,4% de prevalência, já outros dois estudos no estado do Pará, encontraram 26,7% (Galo et al. 2009) e 7,2% de prevalência (Madureira et al. 2009). A PCR negativa para Borrelia ou o gene flab nas 89 amostras de equinos analisadas no presente estudo corrobora com os resultados descritos por Montandon et al. (2014) que ao analisarem amostras de DNA provenientes de carrapatos, coletados de animais silvestres e domésticos dos municípios de Santa Cruz do Escalado, Pingo D'Água e Caratinga/MG, não observaram nenhuma amostra positiva na PCR, utilizando amplificadores para o principal gene envolvido na síntese do gancho flagelar de Borrelia spp. No entanto, na análise sorológica pelo ELISA indireto, os autores encontraram prevalência de 9,68% (15/155) para B. burgdorferi em equinos. Soares (2013) também obteve resultado negativo na PCR para Borrelia spp., em todas amostras de tecidos de animais silvestres e carrapatos analisados. Em contrapartida Madureira (2007) obteve resultado positivo na PCR, para o gene 16S rrna da B. burgdorferi em isolado de carrapato R. (Boophilus) microplus proveniente do estado do Mato Grosso do Sul. Assim como, Mantovani (2010) obteve resultado positivo na PCR, para o gene flge em uma amostra de equino (1/26) oriundo da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro e em duas amostras de carrapatos, sendo um R. sanguineus e um R. (Boophilus) microplus, oriundos do estado do Espírito Santo. O insucesso do diagnóstico molecular para Borrelia spp. em amostras biológicas de pacientes humanos e animais no Brasil pode ser explicado frente as hipóteses levantadas quanto as características desta espiroqueta encontrada no país. Acredita-se que é uma espiroqueta muito distinta da B. burgdorferi descrita no Hemisfério Norte causadora da DL, uma vez que, no Brasil foram descritas espiroquetas de morfologia atípica, latente e de apresentação cística. Sugere-se a presença de uma nova espécie de Borrelia spp., ou uma estirpe de B. burgdorferi geneticamente similar, as quais não podem ser corretamente identificadas na PCR ao se utilizar 50

64 primers destinados para o diagnóstico molecular da B. burgdorferi encontrada no Hemisfério Norte (Mantovani et al. 2007). Via de regra, quantidades enormes de DNA são necessárias para se obter positividade na PCR-nested com o uso do primer flge, com o qual foi possível detectar amostras positivas para Borrelia spp. no Brasil (Mantovani et al. 2012). Este fato, torna a análise molecular inapropriada para diagnóstico laboratorial da borreliose, pois é necessário que as borrelias estejam circulantes durante a fase aguda da infecção, o que na maioria das vezes é difícil, pois geralmente o diagnóstico é realizado no estágio latente da enfermidade (Mantovani 2010). Diante disto, resultados falsos negativos podem ser observados. CONCLUSÃO Apesar do insucesso na amplificação do DNA de Borrelia, a elevada soroprevalência de anticorpos anti-b. burgdorferi nos equinos, indica a presença de Borrelia sp. no município de Sinop - MT e reforça a importância dos equinos como sentinelas da infecção. AGRADECIMENTOS À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AUSVET ANIMAL HEALTH SERVICES. EpiTools epidemiological calculators Accessed 09 Dec 2016 Barbour, A.G. et al., Identification of an uncultivable Borrelia species in the hard tick Amblyomma americanum: possible agent of a Lyme disease-like illness, The Journal of Infectious Diseases, 173, Basile, R.C. Borreliosis in horses: epidemiology, experimental infection and therapeutic uence=3&isallowed=y. Accessed 19 Nov 2016 Campos, C.H.C. et al. Soroprevalência de Borrelia spp. em equinos de uso militar do município de São Borja, Estado do Rio Grande do Sul s/acervo/525.pdf. Accessed 20 Out 2016 Dargatz, D.S., and Hill, G.W., Analysis of survey data, Preventive Veterinary Medicine, 28,

65 Dohoo, I., Martin, W., and Stryhn, H., Sampling. In: I. Dohoo, W. Martin, H. Stryhn (eds) Veterinary epidemiologic research, 2003, (Atlantic Veterinary College, Charlottetown), Franke, J., Hildebrandtb, A., and Dorna, W., Exploring gaps in our knowledge on Lyme borreliosis spirochaetes Updates on complex heterogeneity, ecology, and pathogenicity, Ticks and Tick-borne Diseases, 4, Frey, A., Canzio, J.D., and Zurakowski, D., A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays, Journal of Immunological Methods, 221, Galo, K.R. et al., Frequência de anticorpos homólogos anti-borrelia burgdorferi em equinos na mesorregião metropolitana de Belém, Estado do Pará, Pesquisa Veterinária Brasileira, 29, Madureira, R.C. Freqüência de anticorpos homólogos anti- Borrelia burgdorferi em equinos dos municípios de Três Rios, Vassouras e Valença, Estado do Rio de Janeiro Frequencai-B-burg-equinos-RJ-Dissertacao-UFRRJ.pdf. Accessed 20 Sep 2016 Madureira, R.C. et al., Ocorrência de anticorpos homólogos anti-borrelia burgdorferi em equinos de propriedades dos municípios de Três Rios e Vassouras, estado do Rio de Janeiro, Revista Brasileira de Ciência Veterinária, 14, Madureira, R.C. Sorologia para Borrelia burgdorferi em eqüinos do Estado do Pará e caracterização genotípica de isolados de Borrelia spp Sorologia-para-Borrelia-burgdorferi-em-equinos-do-estado-do-par%C3%A1-Tese.pdf. Accessed 15 Dez 2016 Madureira, R.C. et al., Sorologia para Borrelia burgdorferi em equinos da ilha de Marajó e município de Castanhal, Pará, Brasil, Revista de Ciências da Vida, 29, Mantovani, E. Identificação do agente etiológico da doença de Lyme símile brasileira (Síndrome de Baggio-Yoshinari) Accessed 14 Jan 2017 Mantovani, E. et al., Description of Lyme disease-like syndrome in Brazil. Is it a new tick borne disease or Lyme disease variation?, Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 40, Mantovani, E. et al., Amplification of the flge gene provides evidence for the existence of a Brazilian Borreliosis, Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, 54,

66 Montandon, C.E. et al., Evidence of Borrelia in wild and domestic mammals from the state of Minas Gerais, Brazil, Brazilian Journal of Veterinary Parasitology, 23, Nascimento, D.A.G. Prevalência de anticorpos anti-borrelia spp. em humanos, cães e equinos de assentamento rural da região norte do Paraná, Brasil Accessed 15 Jan 2017 Prado, R.F.S. et al. Soroprevalência de Borrelia spp. em equinos de uso militar no município de Resende, estado do Rio de Janeiro Accessed 11 Set 2017 Rich, S.M. et al., Lone star tick infecting Borreliae are most closely related to the agent of bovine Borreliose, Journal of Clinical Microbiology, 39, Rogers, A.B., Smith, R.D., and Kakoma, I Serologic cross-reactivity of antibodies against Borrelia theileri, Borrelia burgdorferi and Borrelia coriaceae in cattle, American Journal of Veterinary Research, 60, Salles, R.S. et al., Sorologia para Borrelia burgdorferi latu sensu em eqüinos no estado do Rio de Janeiro, A Hora Veterinária, 22, Soares, C.O. et al., Borrelioses, agentes e vetores, Pesquisa Veterinária Brasileira, 20, 1-19 Soares, H.S. Pesquisa de carrapatos, agentes transmitidos por carrapatos e tripanossomatídeos em animais silvestres dos estados do Mato Grosso e Pará Accessed 10 Jan 2017 Talhari, S. et al., Eritema crônico migrans/doença de Lyme Estudo de três casos. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE DERMATOLOGIA, 1987, Goiânia. Anais... Goiânia: Sociedade Brasileira de Dermatologia. Yoshinari, N.H. et al., Doença de Lyme-símile brasileira ou síndrome Baggio-Yoshinari: zoonose exótica e emergente transmitida por carrapatos. Revista da Associação Médica Brasileira, 56,

67 ANEXOS Anexo 1. Oficio disponibilizado pelo INDEA contento os valores totais de propriedades que possuem equídeos no município de Sinop, bem como, o plantel de equídeos cadastrado no município, dados estes utilizados para o cálculo amostral do projeto. 54