IDENTIFICAÇÃO DE PARENTAIS CONTRASTANTES PARA MAPEAMENTO GENÉTICO NO FEIJÃO-CAUPI USANDO MARCADOR MOLECULAR DAF (DNA Amplification fingerprinting)

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1 IDENTIFICAÇÃO DE PARENTAIS CONTRASTANTES PARA MAPEAMENTO GENÉTICO NO FEIJÃO-CAUPI USANDO MARCADOR MOLECULAR DAF (DNA Amplification fingerprinting) L. L. B. AMORIM 1, A. V. C. ONOFRE 2, R. de CARVALHO 1 e A. M. BENKO-ISEPPON 2 Resumo Uma das necessidades de programas de mapeamento envolve o uso de parentais geneticamente contrastantes. Desta forma, o presente estudo objetivou identificar genótipos distintos relacionados a caracteres importantes como resistência a estresses bióticos e abióticos, especialmente considerando o programa de melhoramento Brasileiro. Para isso, 21 acessos de feijão-caupi foram selecionados, sendo analisados pela metodologia de DAF com 15 primers diferentes. De 126 bandas amplificadas, foram identificadas 88 bandas polimórficas, as quais foram incluídas na matriz de dados para a análise UPGMA. O dendrograma gerado apresentou níveis significativos de diversidade, gerando dois clados principais, cada qual com dois subclados incluindo genótipos com diferentes grupamentos. Alguns clados compreenderam acessos com características de resistência similar. Candidatos a parentais com características contrastantes para resistência a estresses bióticos e abióticos puderam ser identificados, o que se apresenta muito promissor para análises de mapeamento no Brasil. Palavras-chave: Vigna unguiculata, diversidade genética, melhoramento genético. IDENTIFICATION CONTRASTING PARENTS OF A MAPPING IN COWPEA USING DAF MOLECULAR MARKERS Abstract Contrasting parental lines are important for mapping purposes. Thus, the present work aimed to identify distinct genotypes regarding important features as resistance to biotic and abiotic stresses in important cowpea accessions, especially considering the Brazilian breeding program. For this purpose 21 cowpea accessions have been selected and analyzed by DAF with 15 different primers. A total of 88 polymorphic bands (from 126 amplified) have been included in the data matrix for the UPGMA analysis. The generated dendrogram presented two major branches, each one with two subclades including genotypes with different grouping. Some clades included accessions with similar resistance features. Contrasting parental candidates for biotic and abiotic resistance features with significant diversity level have been identified what is very promising for future mapping approaches in Brazil. Keywords: Vigna unguiculata, genetic diversity, genetic breeding. 1 Depto.Biologia, UFRPE, CEP , Recife, PE. s: lidiane.amorim@gmail.com, reginaldo-ufrpe@hotmail.com. 2 Depto.Genética, UFPE, Recife, PE. s: vinicius.alberto@gmail.com, celisep@hotlink.com.br.

2 Introdução O feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.], também conhecido como feijão-de-corda ou feijãomacassar, está entre as leguminosas comestíveis com maior conteúdo protéico, tendo grande importância social e econômica especialmente para o semi-árido nordestino, como fator fixador de mão-de-obra, gerador de empregos e de matéria-prima, indispensáveis ao progresso da região. Apesar de sua reconhecida variabilidade fenotípica, especialmente no que diz respeito às características agronômicas, poucos estudos foram conduzidos para entendimento das bases genéticas dos genes que controlam tais fatores, Deste modo, é justificável estudos que visem obter informações básicas para o melhoramento genético, como a identificação de parentais promissores para produção de híbridos com resistência a estresses bióticos e abióticos e a obtenção de populações segregantes adequadas ao mapeamento genético de genes agronomicamente importantes (Freire-Filho et al., 1999; Benko-Iseppon et al., 2005). Nesse sentido o uso de métodos modernos de biologia molecular, incluindo marcadores moleculares, torna-se fundamental para uma seleção mais eficiente dos recursos genéticos, facilitando a detecção da real variabilidade genética para fins de melhoramento convencional ou com fins biotecnológicos, uma vez que estes podem ser mais informativos e estáveis que os descritores morfoagronômicos (Benko- Iseppon et al., 2005). O marcador molecular DAF é similar à técnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), diferindo desta por usar baixas concentrações de DNA e maiores concentrações de primer, tornando a reação de amplificação mais específica e aumentando sua reprodutibilidade (Caetano-Anollés et al., 1991; Benko-Iseppon et al., 2003). O presente trabalho tem como objetivo a caracterização genética de acessos do feijão-caupi usando marcadores DAF, visando à seleção de parentais-candidatos para programas de mapeamento e melhoramento, associando características fenotípicas a marcadores de DNA. Material e Métodos Sementes de vinte e um acessos de feijão-caupi selecionados das instituições e bancos de germoplasma listados na tabela 1. Sementes foram postas para germinar em recipientes do tipo GerBox com papel filtro e algodão. Cinco dias após a semeadura plântulas inteiras foram usadas para extração do DNA genômico. O isolamento foi realizado conforme o protocolo descrito por Sharp et al. (1988) seguido da limpeza com fenol/clorofórmio e RNase (Ausubel et al., 1992). A geração de marcadores DAF seguiu metodologia descrita por Caetano-Anollés et al. (1991), com as modificações introduzidas por Benko-Iseppon et al. (2003), utilizando-se 1 ng/µl de DNA molde, 1,5 µl 10x PCR buffer, 2,5 mm de MgCl 2, 10mM de dntp-mix (Fermentas), 20 µm de primer decâmeros (Operon Technologies, Inc) e 0,4 U de Taq DNA polimerase (Biosystems), ajustando-se o volume final de 15 µl com H 2 O bidestilada estéril. A separação dos produtos amplificados ocorreu realizada através de eletroforese horizontal em gel de agarose 1,8%, corados com brometo de etídio, sendo visualizados e fotografados sob luz ultra-violeta. Os fragmentos amplificados foram interpretados quanto a sua presença (1) ou ausência (0) para criação de uma tabela de dupla entrada (bandas x acessos). A similaridade genética entre os acessos foi calculada com base na comparação pareada entre os locos através do coeficiente de Dice. O agrupamento fenético (dendrograma) foi obtido pelo método UPGMA (Unwheited Pair Group Method Using Arithmetic Average). Todas as análises foram realizadas com o auxílio do programa estatístico NTSYS-pc (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System), versão 2.10.

3 Tabela 1. Procedência, número de acesso e algumas características agronômicas de 21 acessos de feijão-caupi utilizados neste estudo. Ordem/ Espécie Banco de germoplasma Acesso Característica 01. Vigna unguiculata EMBRAPA/CPAMN BR-17 Gurguéia Imune ao CPSMV (Vírus do Mosaico 02. V. unguiculata EMBRAPA/CPAMN CE 315 Altamente suscetível ao CPSMV (Vírus do Mosaico 03. V. unguiculata EMBRAPA/CPAMN Sempre Verde Suscetível ao CPSMV (Vírus do Mosaico 04. V. unguiculata IPA IPA 201 Suscetível ao CPSMV (Vírus do Mosaico 05. V. unguiculata IPA IPA 205 Suscetível ao CPSMV (Vírus do Mosaico 06. V. unguiculata IPA IPA 202 Suscetível ao CPSMV (Vírus do Mosaico 07. V. unguiculata UFC Pitiúba Resistente (Salinidade/Seca) 08. V. unguiculata UFC Pérola Suscetível estresse abiótico (Salinidade/ Seca) 09. V. unguiculata UFC IT81D-1053 Resistente ao ataque de caruncho (Callosobruchus malucatus) 10. V. unguiculata UFC BR-9 Longá Suscetível ao ataque de caruncho (C. malucatus) 11. V. unguiculata UFC CE-109 Resistente nematóide (Meloidogyne incognita) 12. V. unguiculata UFC CE 31 Suscetível nematóide (M. incognita) 13. V. unguiculata EMBRAPA/CPAMN Vita 3 Tolerante estresse abiótico (Salinidade) 14. V. unguiculata EMBRAPA/CPAMN Vita 5 Tolerante (Salinidade) 15. V. unguiculata EMBRAPA/CPAMN Canapu Amarelo Suscetível (Salinidade/Seca) 16. V. unguiculata IPA IPA 206 Suscetível estresse abiótico (Salinidade) 17. V. unguiculata EMBRAPA/CPAMN BR-14 Mulato Imune ao CPSMV (Vírus do Mosaico 18. V. unguiculata EMBRAPA/CPAMN IT-85F 2687 Imune ao CABMV (Mosaico Transmitido por Pulgão) 19. V. unguiculata EMBRAPA/CPAMN TE G Resistente ao CABMV (Mosaico Transmitido por Pulgão) 20. V. unguiculata EMBRAPA/CPAMN Tvu-382 Imune ao CPSMV (Vírus do Mosaico 21. V. unguiculata EMBRAPA/CPAMN IT-86D Resistente ao CABMV (Mosaico Transmitido por Pulgão) Legenda: EMBRAPA/CPAMN=Empresa Brasileira de Pesquisas Agropecuárias, Centro de Pesquisas Agrop. do Meio- Norte, IPA=Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária, Recife, UFC=Universidade Federal do Ceará.

4 Resultados e Discussão Foram amplificados 126 fragmentos de DNA, sendo 88 polimórficos e 38 monomórficos, utilizando 15 primers de DAF. O número de marcas amplificadas variou de dois (OPK-14) a 12 (OPM-2X e R47010) com uma média de 8,4 bandas por primer (Figura 1). O número de fragmentos polimórficos por primer variou de dez (OPI-16) a 11 (OPM- 6X) com média de 5,8 bandas polimórficas por primer (Tabela 2). Xavier et al. (2005), ao estudar 28 acessos de feijão-caupi utilizando 20 primers RAPD obtiveram uma média de 3,7 bandas polimórficas por primer. Simon et al. (2002) amostraram 262 primers com DAF, dentre os quais 48 foram selecionados e recomendados por sua capacidade de gerar polimorfismos (média de 14,8 bandas por primer) em 68 acessos de germoplasma do feijão-caupi e seis espécies de Vigna. He e Prakash (1997), analisando seis genótipos de amendoim, com 559 primers DAF, selecionaram 17 com uma média de 3,7 bandas polimórficas por primer. Esta baixa variabilidade genética no amendoim e no feijão-caupi, apesar da grande diversidade agronômica encontrada nessas leguminosas, tem sido explicada como sendo reflexo dos processos de domesticação e devido à autofecundação. Os genótipos de feijão-caupi foram agrupados em quatro clusters com uma faixa de similaridade genética de 72 a 91% (Figura 2). Cultivares com características fenotípicas contrastantes, tais como imunidade (BR14 Mulato e TVU 382) e suscetibilidade (IT 85F2687) ao CpSMV; resistência (CE109) e suscetibilidade (CE31) ao nematóide de galhas (Meloidogyne incognita); resistência (IT 81D 1053) e suscetibilidade (BR 9 Longá) ao caruncho (Callosobruchus malucatus); resistência (Pitiúba) e suscetibilidade (Canapu Amarelo) a seca/salinidade, foram agrupados em clusters diferentes, demonstrando desta forma haver também um distanciamento genético entre eles. Deste modo, observase que os marcadores moleculares do tipo DAF são informativos para análises de diversidade genética em feijão-caupi, apresentando-se como uma ferramenta útil para seleção de parentais contrastantes, em estudos envolvendo mapeamento genético. Tabela 2. Lista de primers usados na reação de DAF. Primer Seqüência (5? 3 ) Nº total de bandas Polimórfica OP-K14 CCCGCTACAC OPJ16 CCACACTACC OP-J12 CCACACTACC OPK06 CACCTTTCCC OPE-6 AAGACCCCTC G06 CTGAGACGGA R460-2 GCAGGATACG R GACCGACACG AIV GCGAAAGCCAA OPG-10 AGGGCCGTCT OPI16 CCACACTACC OP-K08 GAACACTGGG OPM-6X CTGGGCAACT R CGCAGACCTC OPM-2X ACAACGCCTC 12 06

5 Figura 1. Perfil de um gel de DAF usando o primer R em 21 acessos do feijão-caupi. M=,padrão de peso molecular (ladder 100 pb). Figura 2. Dendrograma resultante de análise UPGMA, indicando a similaridade genética, a partir de DAF, entre os entre os 21 acessos de feijão-caupi. Conclusão A análise da relação genética de acessos de Vigna unguiculata baseado em marcadores DAF permitiu a detecção polimorfismos significativos, úteis na seleção de parentais contrastantes para geração de populações segregantes apropriadas para o mapeamento genético. Alguns genótipos com características fenotípicas semelhantes (resistência/susceptibilidade) agruparam-se, sugerindo uma possível associação a características importantes para o melhoramento. Agradecimentos Os autores agradecem ao CNPq, a FACEPE, ao BNB/ RENORBIO, IPA, a UFC e a Embrapa Meio- Norte.

6 Referências AUSUBEL, F.M.; BRENT, R.; KINGSTON, R.E.; MOORE, D.D.; SEIDMAN, J.G.; SMITH, J.A.; STRUHL, K. Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons: New York. BENKO-ISEPPON, A.M., WINTER, P., HÜTTEL, B, STAGGINUS, C., MÜHLBAUER, F. and KAHL, G. Markers closely linked to Fusarium resistance genes in chickpea show homology to pathogenesis-related genes located on Arabidopsis chromosome 5 and 1. Theoretical and Applied Genetics, n.103, p , BENKO-ISEPPON, A.M.; SOARES-CAVALCANTI, N.M.; WANDERLEY-NOGUEIRA, A.C.; BERLARMINO, L.C.; SILVA, R.R.M.; ALMEIDA, P.M.L.; BRUNELLI, K.R.; KIDO, L.M.H.; KIDO, E.A. Genes associados a estresses bióticos e abióticos em feijão-caupi [Vigna unguiculata (l.) Walp.] e outras angiospermas, pp In: NOGUEIRA, R.J.M.C.; ARAÚJO, E.L.; WILLADINO, L.G.; CAVALCANTE, U.M.T. (Eds.): Estresses ambientais: danos e benefícios em plantas. Recife: Imprensa Univ.- UFRPE, CAETANO-ANOLLÉS, G. BASSAM, B.J. and GRESSHOFF, P.M. DNA amplification fingerprinting using short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/Technology n.9, p , FREIRE-FILHO, F.R., RIBEIRO, V.Q., BARRETO, P.D.; SANTOS, C.A.F. (1999). Melhoramento genético do caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp.) na região nordeste. In: QUEIRÓS, M.; GOEDERT, C.O.; RAMOS, S.R.R., Eds Recursos genéticos e melhoramento de plantas para o Nordeste Brasileiro EMBRAPA, CPATSA, Petrolina. HE, G.; PRAKASH, C.S. Identification of polymorphic DNA markers in cultivated penaut (Arachis hypogaea L.). Euphytica, v.97, p , SHARP, P.J; KREISS, M.; SHEWRY, P. & GALE, M.D. Location of b-amylase sequences in wheat and its relatives. Theoretical and Applied Genetics, n.75, p , SIMON M.V. RESENDE L.V.; BENKO-ISEPPON A.M.; WINTER P. & KAHL G. Aplicabilidade da análise de fingerprinting de DNA na determinação da diversidade genética intra e interespecífica do gênero Vigna. Horticultura Brasileira, v. 20, n. 2, p.1-5, XAVIER, G.R; MARTINS, L.M.V.; RUMJANEK, N.M.; FREIRE-FILHO, F.R. Variabilidade genética em acessos de caupi analisada por meio de marcadores RAPD. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 40, p , 2005.