Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) 1*

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1 Análise da Divergência Genética em Diferentes Tipos de Milho (Zea mays L.) com Base em Marcadores Moleculares ISSR Guilherme F. Pena 1, Érica C. Oliveira 2, Antônio T. A. Júnior 3, Silvério F. P. Júnior 4, Lilian S. Candido 5 e Leandro S.A. Gonçalves 6. 1,2,3,5,6 Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) 1* penabio@yahoo.com.br, 2* erica_biologa@hotmail.com, 3* amaraljr@uenf.br 4 Universidade Federal do Ceará (UFC) Palavras-chave: Zea mays L., ISSR, matriz de dissimilaridade e UPGMA. Introdução Dentre as espécies mais cultivadas, na atualidade, destaca-se o milho (Zea mays L.) devido a sua importância nutricional na alimentação humana e animal, o que possivelmente a torna uma das culturas mais estudadas no mundo. No entanto, relativamente poucos estudos relacionados à ancestralidade e caracterização da variabilidade genética do milho têm sido realizados. Existem vários tipos de milho, todas pertencentes á espécie botânica Zea mays, sendo estes tipos divididos em milho comum e os tipos especiais, os quais se encaixam o milho pipoca e o milho doce. Segundo Leal et al., (2010), a seleção assistida por marcadores moleculares vem se mostrando uma ferramenta de grande utilidade nas estratégias de pesquisa, sobretudo na identificação de grupos heteróticos de linhagens e na inferência da diversidade genética de espécies. Os marcadores moleculares apresentam muitas vantagens, destacando-se a ausência da influência ambiental no processo avaliativo e a melhor exploração da variabilidade genética, diretamente relacionada à heterose, almejada em programas de melhoramento genético. Entre os marcadores moleculares, o Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) possui elevado potencial para quantificação da variabilidade genética (Osipova et al., 2003; Ye et al., 2005). Os ISSRs são uma classe de marcadores dominantes baseados na amplificação da polimerase em cadeia (PCR) com boa repetibilidade, simplicidade técnica e de baixo custo. Utilizando-se este marcador em milho pipoca, Kantety et al. (1995) avaliaram a divergência genética entre o milho dentado e o pipoca e constataram a absoluta separação entre os tipos, além de discriminar, embora com menor distanciamento, três grupos heteróticos de milho pipoca. O presente trabalho tem como objetivo inferir sobre a variabilidade genética de acessos de milho, pertencentes ao banco de germoplasma da UENF, utilizando marcadores ISSR. Material e métodos Foram analisados 35 acessos de milho pertencentes ao Banco de Germoplasma da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) (Tabela 1). 2610

2 Tabela 1 Genótipos de Zea mays com seus respectivos nomes, tipo e procedência. Genótipo Tipo de Grão Procedência VALL 429 Pipoca CIMMYT URUG 298 Pipoca CIMMYT ARZM Pipoca CIMMYT ARZM Pipoca CIMMYT BOYA 462 Pipoca CIMMYT CHZM Pipoca CIMMYT BOZM 260 Pipoca CIMMYT PARA 172 Pipoca CIMMYT PARA 170 Pipoca CIMMYT COMPOSTO Pipoca CIMMYT PAZM Pipoca UEM ARZM Pipoca CIMMYT COLOMBIANA Pipoca UEM ARGENTINA Pipoca UEM SAM Pipoca Sul-americana/EUA PR-023 Pipoca UEM TATU 1 Pipoca UEM PA 091 Pipoca UEM TATU 2 Pipoca UEM SE 013 Pipoca UEM DOCE DE CUBA Doce UENF COMPOSTO FLINT N Duro UENF CATETO SETE LAGOAS Duro Embrapa CATETO COLÔMBIA Duro Embrapa CIMMYT - 11 Duro UENF CATETO ROXO Semiduro Pesagro MAYA Dentado Embrapa CENTRALMEX Dentado Embrapa CATETO AMARELO Dentado Pesagro PIRANÃO 11 Dentado UENF DENTE DE BURRO Dentado UENF ASTECA Dentado Embrapa MAYA ANTIGO Dentado UENF SARACURA Semidentado Embrapa BR 106 Semidentado Pesagro O plantio dos acessos foi realizado em Campos dos Goytacazes, no Colégio Estadual Agrícola Antonio Sarlo e em casa de vegetação, na Unidade de Apoio à Pesquisa da UENF. Os acessos cultivados em casa de vegetação foram: Argentina, PA 091, Colombiana, PAZM , SE 013, TATU 1 e TATU 2. A coleta das folhas foi feitas em bulk, com cerca de 16 indivíduos de cada genótipo, após 45 dias de plantio. Em seguida, foram embaladas em papel alumínio e conservadas em gelo até a transferência ao ultrafreezer a -80 ºC. Os procedimentos laboratoriais, tais como extração de DNA, amplificação de fragmento, eletroforese e fotodocumentação, foram desenvolvidos no Laboratório de Melhoramento Genético Vegetal do Centro de Ciências e 2611

3 Tecnologias Agropecuárias da UENF (LMGV/CCTA/UENF), em Campos dos Goytacazes, RJ. A extração de DNA foi realizada de acordo com o protocolo mini-prep de Doyle e Doyle (1990), com modificações, com a adição de proteinase K no tampão de extração, na concentração final de 0,125 mg.ml -1. Para a amplificação dos fragmentos foram utilizados 15 iniciadores, a saber: (CT) 8 RC; (CT) 8 TG; (GA) 8 T; (GA) 8 YC; (CTC) 5 RC; (GTC) 6 ; (GA) 6 CC; (GT) 6 CC; (CAC) 3 GC; (AG) 8 YT; (AC) 8 CT; (AC) 8 YG; (CT) 8 RG; (GGAT) 3 GA e (GAA) 6 AA. As amplificações foram realizadas no termociclador de gradiente da marca Eppendorf, de acordo com o seguinte programa: 4 min de desnaturação a 94ºC, seguida por 42 ciclos de amplificação com 94ºC a 1 min, 1 min com T m temperature of melting variando com o iniciador utilizado, extensão final de 7 min a 72ºC. Os fragmentos de DNA foram separados por eletroforese horizontal em gel de agarose a 2,0 % e tampão TAE 1X, a 100 volts por 2 horas e posteriormente corados com a mistura de Blue Juice 6X com Gel Red, na proporção de 1:1. Para a análise dos dados foi utilizado o índice de Jaccard e a partir da matriz de distância foi obtido o agrupamento dos indivíduos com base no método hierárquico unweighted pair group method with the arithmetic averages (UPGMA). Resultados e Discussão Dos 15 iniciadores ISSR avaliados, foram obtidas 105 marcas, sendo 25 monomórficas (23,8%) e 80 polimórficas (76,2%) (Tabela 2). Tabela 2 Nomes e padrão de bandas obtidas pelos 15 primers testados. Primers Monomórficas Polimórficas (CT) 8 RC 1 7 (CT) 8 TG 0 5 (GA) 8 T 5 8 (GA) 8 YC 1 11 (CTC) 5 RC 1 11 (GTC) (GA) 6 CC 3 3 (GT) 6 CC 1 6 (CAC) 3 GC 3 5 (AG) 8 YT 2 7 (AC) 8 CT 2 5 (AC) 8 YG 1 8 (CT) 8 RG 2 6 (GGAT) 3 GA 1 9 (GAA) 6 AA 0 8 Os iniciadores (GA) 8 YC e (CTC) 5 RC obtiveram um maior número de polimorfismo, com 11 bandas polimórficas cada, e o iniciador (GA) 6 CC o menos polimórfico, com três bandas apenas. Com base na matriz de dissimilaridade, os acessos mais próximos foram PR 023 e TATU 2, distantes em 0,14. O acesso PR 023, segundo Scapim et al. (2006), é derivado de 2612

4 híbridos norte-americanos e argentinos. O acesso TATU 2 foi disponibilizado à UEM por um produtor rural da região oeste do Paraná (ambos os acessos são cultivados no Paraná), o que explicaria essa proximidade. Segundo a matriz, os acessos mais distantes foram Maya antigo e Doce de cuba, distantes 0,47. Pelo agrupamento hierárquico UPGMA, considerando-se o ponto de corte a partir de mudanças abruptas no gráfico (0,37), houve a formação de cinco grupos maiores e também a formação de subgrupos, o que demonstra a existência de variabilidade genética entre os acessos do banco de germoplasma da UENF. Na análise do dendrograma, constatou-se a evidenciação de que os acessos mais próximos são PR 023 e Tatu 2, porém, determinou Asteca como o acesso mais distante de Doce de Cuba, contrariando a matriz de distâncias. No entanto, Asteca manteve-se no mesmo subgrupo do acesso Maya antigo. Ainda em relação ao dendrograma foi obtido um coeficiente de correlação cofenética de 0,78, o que indica uma confiável correspondência entre a matriz de distância e o método aglomerativo (figura 1). Doce de Cuba PAZM Argentina 2- Colombiana SAM URUG 298 Tatu 1 Vall 429 Para 172 ARZM PR 023 TATU 2 Composto BOZM 260 Para 170 Boya 462 SE 013 ARZM Piranão 11 Maya Antigo ARZM PA 091 Cateto Colômbia CHZM Cateto Sete Lagoas Composto F. N. BR 106 Cateto Roxo Cimmyt Saracura Centralmex Cateto Amarelo Maya Dente de Burro Asteca Distância Genética Figura 1 Dendrograma de UPGMA obtido com base nos marcadores do tipo ISSR. Pelas considerações de Fidelis et al. (2005), Dente de Burro, Maya e Asteca são materiais que passaram por seleções e, certamente, tiveram modificações nas frequências gênicas, distanciando-os de seus progenitores ancestrais. Em se tratando de populações antigas, houve o agrupamento entre representantes de Centralmex, Cateto Amarelo, Maya, Dente de Burro e Asteca. Centralmex, composto obtido pelo Dr. Ernesto Paterniani na ESALQ/USP, em Piracicaba, teve na origem a recombinação 2613

5 de vários materiais Tuxpenos, de grãos dentados, originários do México. O Cateto Amarelo é do tipo dentado, com o endosperma amarelo, porém não se tem conhecimento sobre sua origem. O acesso Maya é uma variedade Tuxpeno de grãos dentados gerada pelo IAC. Dente de Burro é do tipo dentado, com endosperma amarelo. Quanto ao acesso Asteca, da raça Tuxpeno de porte alto, dentado, apresentando a coloração do endosperma amarelo-alaranjado, utilizado como um dos parentais da variedade BR 106. É válido atentar para o fato dos acessos Maya e Asteca pertencerem à mesma variedade e ou raça (Tuxpeno) e serem posicionados no mesmo subgrupo, conforme o resultado obtido pelo UPGMA. O que se pode verificar é que os acessos do tipo dentado e duro estão muito próximos, geneticamente. Como exemplo, cita-se o acesso Saracura, cedido pela Embrapa Milho e Sorgo, que é um composto de 36 variedades de milho, sendo selecionado desde 1986, para adaptação a solos encharcados, estando, atualmente, no 18 ciclo de seleção que foi agrupado próximo ao CIMMYT-11, que é um milho do tipo duro. O agrupamento não revelou proximidade com BR 106, que se classifica como semidentado, apresentando porte baixo e coloração do endosperma amarelo-alaranjada. Segundo Benchimol et al. (2000), BR 106 foi desenvolvido por intercruzamento de um composto brasileiro de maturação tardia (desenvolvido por intercruzamento de três populações) com uma população Mexicana com maturação precoce, seguido por três gerações de recombinação e seleção para planta com altura baixa e maturação precoce. Apesar de BR 106 conter em sua genealogia genes do acesso Asteca, provavelmente estes acessos não ficaram próximos devido às seleções e aos procedimentos de melhoramento aplicados ao BR 106, que constitui um cultivar recomendada. Conclusões Com base nos resultados obtidos foi possível concluir que: Há variabilidade entre os acessos avaliados, o que os torna uma fonte útil em programas de melhoramento genético; A formação de grupos heteróticos possibilitou observar um possível estreitamento da base genética entre os cultivares de milho pipoca disponíveis comercialmente; Referências Bibliográficas BENCHIMOL, L. L.; SOUZA JR, C. L.; GARCIA, A. A. F.; KONO, P. M. S.; MANGOLIN, C. A.; BARBOSA, A. M. M.; COELHO, A. S. G.; SOUZA, A. P. Genetic diversity in tropical maize inbred lines: heterotic group assignment and hybrid performance determined by RFLP markers. Plant Breeding, 119: , DOYLE, J. J.; DOYLE, J. L. Isolation of plant DNA fresh tissue. Focus, 12:13-15, FIDELIS, R. R.; MIRANDA, G.V.; SANTOS, I. C.; GALVÃO, J. C. C. Metodologia de seleção de cultivares de milho para eficiência na absorção e utilização de nitrogênio. Revista Ceres, 52(304): ,

6 KANTETY, R.V.; ZENG, X.; BENNETZEN, J.; ZEHR, B. E. Assessment of genetic diversity in dent and popcorn (Zea mays L.) inbred lines using inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification. Molecular Breeding, 1: , LEAL, A. A.; MANGOLIN, C. A.; AMARAL JÚNIOR, A. T.; GONÇALVES, L. S. A.; SCAPIM, C. A.; MOTT, A. S.; ELOI, I. B. O.; CORDOVÉS, V; SILVA, M. F. P. Efficiency of RAPD versus SSR markers for determining genetic diversity among popcorn lines. Genetics and Molecular Research, 9 (1): 9-18, OSIPOVA, E. S.; KOVEZA, O. V.; TROITSKIJ, A.V.; DOLGIKH, Y. I.; SHAMINA, Z. B.; GOSTIMSKIJ, S.A. Analysis of Specific RAPD and ISSR Fregments in Maize (Zea Mays L.) Somaclones and Development of SCAR Makers on Their Basis. Russian Journal of Genetics, 39: , SCAPIM, C. A.; PINTO, R. J. B; AMARAL JUNIOR, A.T.; MORA, F.; DANDOLINI, T. S. Combining ability of white grain popcorn populations. Crop Breeding and Applied Biotechnology, 6: , YE, C.; YU, Z.; KONG, F.; WU, S.; WANG, B. R-ISSR as new tool for genomic fingerprinting, mapping, and gene tagging. Plant Molecular Biology Reporter, 23: ,