VARIABILIDADE GENÉTICA ENTRE OS ISOLADOS DE Alternaria macrospora DO ALGODOEIRO

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1 VARIABILIDADE GENÉTICA ENTRE OS ISOLADOS DE Alternaria macrospora DO ALGODOEIRO Yeshwant R. Mehta 1, D. Cassetari Neto 2, Edivaldo Cia 3, Maria A Pizzinato 3, Eliria, A. Teixeira 4, H.C. Cunha 4. (1) IAPAR, C.P. 481, Londrina, PR, yrmehta@pr.gov.br, (2) Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá, MT, (3) IAC, C.P 28, Campinas, SP, (4) Agência Rural, Goiania, GO. RESUMO A Alternaria causada por Alternaria macrospora é transmitida pela semente e se manifesta em todas as fases de desenvolvimento da planta. Estudou-se a variabilidade genética entre os isolados de A. macrospora provenientes de diferentes cultivares e regiões produtoras do algodão no Brasil, através de análise molecular. A única espécie de Alternaria ocorrendo no Brasil foi a A. macrospora. Segundo análise de RAPD, 75% dos isolados dos estados do Paraná, São Paulo, e Mato Grosso formaram um grupo a 90% de similaridade. Os isolados do Estado de Goiás foram distintos dos demais isolados a 65-80% de precisão. Alguns isolados que mostraram diferença em agressividade na cultivar EPAMIG LIÇA, também mostraram diferença entre si, segundo análise de RAPD e ERIC/REP-PCR. Os isolados menos agressivos formaram um grupo separado, enquanto que, o isolado não patogênico de A. alternata formou um grupo totalmente distinto. Análise da região ITS mostrou padrão de bandas semelhantes para todos os isolados. Conclui-se que para estudos sobre a medição de grau de resistência das cultivares, a utilização de mistura dos isolados mais agressivos provenientes das regiões geograficamente diferentes é desejável. INTRODUÇÃO A Alternaria causada por Alternaria macrospora é uma doença importante do algodoeiro no Brasil. A doença é transmitida pela semente e se manifesta em todas as fases de desenvolvimento da planta entre as folhas cotiledonárias e o amadurecimento de maçã. Os sintomas típicos da doença são manchas circulares (2-3 mm) com centro esbranqueçado (Mehta et al, 2003). Entretanto, nos trabalhos de casa de vegetação, a Alternaria transmitida pelas sementes naturalmente infectadas, produziu dois tipos de sintomas nas plântulas da cultivar ITA 90, 35 dias após o plantio. Um tipo de sintoma foi caracterizado como manchas circulares e outro como manchas necróticas lineares extendidas para as nervuras da folhas primárias. O segundo tipo de sintoma foi considerado incomum para a Alternaria, pois era muito semelhante aquele causado por Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum. O Postulado de Koch confirmou A. macrospora como agente causal de ambos os sintomas. Conhecimento detalhado sobre a diversidade do patógeno é essencial para compreender a estrutura genética da população do patógeno a fim de auxiliar na definição de estratégias dos programas de melhoramento genético. O presente trabalho visa identificar variabilidade genética entre os isolados de A. macrospora provenientes de diferentes cultivares e regiões produtoras do algodão no Brasil, através de análise molecular. MATERIAL E MÉTODOS Nos trabalhos de casa de vegetação, a Alternaria transmitida pelas sementes naturalmente infectadas, produziu dois tipos de sintomas nas plântulas da cultivar ITA 90, 35 dias após o plantio. Um tipo de sintoma foi caracterizado como manchas circulares e outro como manchas necróticas lineares extendidas para as nervuras da folhas primárias. O segundo tipo de sintoma foi considerado incomum para

2 a Alternaria, pois era muito semelhante aquele causado por Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum. O Postulado de Koch confirmou A. macrospora como agente causal de ambos os sintomas. O presente trabalho visa identificar variabilidade genética entre os isolados de A. macrospora. Prospecção foi realizada nos campos comerciais do algodoeiro dos estados de Goiás, Mato Grosso, São Paulo e Paraná, entre 1999 e 2002, abrangendo diversas cultivares e regiões para garantir a maior representatividade possível da população de Alternaria spp. ocorrendo no Brasil. Todos os 44 isolados monospóricos patogênicos e foram identificados como A. macrospora e nenhuma infecção causada por A. alternata foi encontrada (Tabela 1). O DNA total foi extraído de acordo com Doyle & Doyle (1990). Para os ensaios de RAPD A amplificação de DNA foi realizada conforme descrito anteriormente, utilizando os primers fornecidos pela Operon Technologies, Inc. (Mehta, 2001; Bibanco et al, 2003). As reações de amplificação foram verificadas através de eletroforese em gel de agarose e visualizados em luz U.V. após coloração com brometo de etídio. Os dados foram analisados considerando a presença e ausência das bandas. A matriz de distância foi construída através do programa UPGMA ("unweighted pair group method with arithmetic mean"), utilizando o coeficiente de Jaccard, com o programa NTSYS-pc, versão 1.8. Os primers REP1/REP2 e ERIC1/ERIC2 (Mehta et al, 2002a, 2002b) foram adquiridos da Life Technologies, e foram utilizados para amplificar o DNA dos isolados, conforme descrito anteriormente (Mehta et al, 2002a). Os isolados de A. macrospora também foram analisados para a região espaçadora ITS de rdna (PCR-RFLP), (Achenback & Patrick, 1997). Os produtos de amplificação foram digeridos utilizando seis enzimas de restrição selecionadas ao acaso (Alu I, Bgl II, Dra I, Eco R1, Hind III, e Pst I). Os produtos de digestão foram separados através de eletroforese em géis de agarose (2%). A digestão do DNA foi realizada seguindo as instruções do fabricante. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados de prospecção demonstram que a principal espécie de Alternaria ocorrendo no Brasil é a A. macrospora, sendo que nenhuma infecção causada por A. alternata foi encontrada (Tabela 1). Segundo análise de RAPD, 75% dos isolados (30 isolados) formaram um grupo a 90% de similaridade. Este grupo é formado pela maioria dos isolados dos estados do Paraná, São Paulo, e Mato Grosso. De uma maneira geral os isolados do Estado de Goiás foram distintos dos demais isolados a 65-80% de similaridade sendo que os isolados Nos. 41, 42, 43 e 44 formaram um grupo separado (Fig. 3). Alguns isolados que mostraram diferença em agressividade na cultivar EPAMIG LIÇA, também mostraram diferença entre si, segundo análise de RAPD (Fig. 1 e Tabela1). Os isolados menos agressívos Nos. 3, e 7, formaram um grupo separado, emquanto que, o isolado não patogênico de A. alternata formou um grupo totalmente distinto dos demais isolados. Resultados bastante semelhantes foram obtidos através de ERIC/REP-PCR (Fig. 4), (Mehta et al, 2002). Análise da região ITS mostrou tamanho de fragmento de 600 pb para todos os isolados (Fig.2). Quando os produtos de amplificação foram digeridos com seis enzimas de restrição, um padrão de bandas semelhante foi obtido para todos os isolados. Considerando a variabilidade genética encontrada entre os isolados de A. macrospora, pode-se concluir que para estudos sobre a medição de grau de resistência das cultivares do algodoeiro, a utilização de mistura dos isolados mais agressivos provenientes das regiões geograficamente diferentes é desejável (Mehta et al, 2003).

3 Tabela 1. Origem dos isolados de Alternaria macrospora, utilizados no presente trabalho. Isolado Código Local/Estado/Cultivar/Ano Patogenicidade* Alternaria alternata (Saprófito de semente)** Londrina/PR/Codetec 401/ Cambará/PR/linha avançada/ Primaveira d Oeste,MT/Coodetec404/ Serra de Petrolina/MT/Disconhecida/ Campo Verde/MT/Desconhecida/ Campinas/SP/IAC 97-86/ Jaú/SP/Desconhecida/ Ituverava/SP/IAC 97-86/ Adamantina/SP/Desconhecida/ Presidente Bernardes/SP/Epamig Liça/ Caiabu/SP/Br 201/ Caiabu/SP/IAC 97-86/ Tatuí/SP/Desconhecida/ Tietê/SP/Desconhecida/ Tietê/SP/Desconhecida/ Holambra/SP/Desconhecida/ Descon(semente)/MT/Ita90/ Descon(semente)/BRS Facual/MT/ Descon(semente)/CD404/MT/ Descon(semente)/Makina/MT/ Rondonôpolis, MT/Popu.segre/ Umarama, PR/IPR 96/ Umarama, PR/IPR 96/ Goioeré, PR/Coodetec 404/ Juranda, PR/Coodetec 404/ Goioeré, PR/Coodetec401/ Campo Mourão, PR/Desc./ Juranda, PR/DeltaOpal/ Goioeré, PR/Descon/ Campo Verde/MT/1067/ Serra da Petrolina, MT/Descon./ Campo Verde, MT/Saturno/ Campo Verde, MT/Maquina/ Itiquira, MT/Maquina/ Itiquira, MT/Fibermax 986/ Panama, GO/Ita90/ Jatai, GO/Descon/ Acreuna, GO/Aroeira/ Acreuna, GO/Aroeira/ Acreuna, GO/Fibermax986/ Rio Verde, GO/Aroeira/ Acreuna, GO/Delta Opal/ Palmeiras de Goiás, GO/Ita90/ *A patogenicidade foi testada na cultivar Epamig-Liça, utilizando uma escala visual de 0-5 (Mehta, 1998); onde 0=sem sintomas; 1=pontuações pequenas <5% da área foliar infectada (AFI); 2= lesões necroticas, pequenas sem clorose 5 á 25% de AFI; 3=lesões necroticas com clorose 26 á 50% de AFI; 4= lesões necroticas com clorose coalescendo, 51 á 75% de AFI; e 5=lesões coalescendo com clorose, AFI>76% e ou morte da planta. ** Isolado saprofítico de A alternata utilizado para comparação.

4 M M pb- 800 pb- 400 pb- 200 pb- Figura 1. Amostra de gel mostrando o padrão de bandas RAPD produzidas pelo primer OPK-16. Linha M=Marcador molecular 100 pb Ladder, Linha 1 a 19 isolados de A. macrospora. Figura 2. Amostra de gel mostrando padrão de bandas da região ITS em 19 isolados de A. macrospora amplificado com par de primer ITS4 / ITS5 e digerido com enzima de restrição Hind III. Linha M=Marcador molecular 100 pb Ladder.. Figura. 3. Dendrograma (Sj) produzida pela análise UPGMA baseado nos dados obtidos com oito RAPD primers utilizando DNA de 44 isolados de A. macrospora Figura 4. Dendrograma (Sj) produzida pela análise UPGMA baseado nos primers ERIC1/ERIC2 e REP1 /REP2 utilizando 44 isolados de A. macrospora

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BIBANCO, K.R.P.; MEHTA, Y.R.; CIA, E.; PIZZINATO, M.A. Identificação de variabilidade genética entre os isolados de Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum do algodoeiro. Trabalho apresentado neste Congresso DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: MEHTA, Y.R., MEHTA, A. & ROSATO, Y.B. ERIC and REP-PCR banding patterns and sequence analysis of the internal transcribed spacer of rdna of Stemphylium solani from cotton. Current Microbiology 44: MEHTA, Y.R.; TEIXEIRA, E. A.; CUNHA, H.F.; ERIVALDO, J.; RUANO, O. Resposta diferencial das cultivares de algodoeiro a Alternaria macrospora. Trabalho apresentado neste Congresso