TOLYLFLUANID COMO BACTERICIDA CONTRA Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum TRANSMITIDA POR SEMENTES DE ALGODOEIRO (*)

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1 TOLYLFLUANID COMO BACTERICIDA CONTRA Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum TRANSMITIDA POR SEMENTES DE ALGODOEIRO (*) Yeshwant Ramchandra Mehta (Iapar / yrmehta@iapar.br), Kelen Bibanco (Iapar), Carla Zandoná (Iapar), Lucilene de Paula Lopes (Iapar), Priscila Fernanda Rocha Alves (Iapar), Marina Moraes Carlos (Iapar), Paulo Aguiar (Fundação MT), Fabiano Sequeiro (Fundação MT), Tatiane Shaila Zambosi (Coodetec). RESUMO - Estudou-se a eficiência de tolylfluanid como bactericida contra X. axonopodis pv. malvacearum (Xam), em experimentos de laboratório e casa-de-vegetação. O tratamento de sementes com tolylfluanid foi realizado utilizando o método de Slurry ou em solução de tolylfluanid (1,20g/L água), por 16h. No Exp. I, foram utilizados vinte e um isolados e o método de discos de papel filtro, embebidos em suspensão de Xam, colocando-os em placas de Petri contendo peptona, sacarose, e agar (PSA), com concentrações variáveis de tolylfluanid. Após sete dias de incubação, os discos foram transferidos durante quatro gerações sucessivas de sete dias cada, em PSA sem tolylfluanid. Durante a tranferência, a Xam não foi recuperada dos discos colocados em concentrações superiores a 54ppm. No Experimento II, sementes não tratadas, produziram em média 30,3 plantas com sintomas da doença, enquanto sementes tratadas em solução de tolylfluanid produziram apenas 0,33 plantas com sintomas aos 30 dias de semeadura. No Experimento III, onze plantas de parcelas com sementes não tratadas mostraram sintomas da doença, enquanto que apenas uma planta nas parcelas com sementes tratadas apresentou sintomas, aos 18 dias de semeadura. Palavras-chave: mancha angular, Gossypium hirsutum TOLYLFLUANID AS A BACTERICID AGAINST SEED TRANSMITTED Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum OF COTTON ABSTRACT - Efficiency of tolylfluanid as a bactericide against X. axonopodis pv. malvacearum (Xam), was studied under laboratory and glasshouse conditions. Seed treatment with tolylfluanid was performed using the Slurry or solution of tolylfluanid (1,20g/L water), during 16h. In Exp. I, 21 isolates of Xam were tested using the filter paper discs imbibed in a suspension of Xam (10 6 cfu/ml) and placed in Petri plates containing peptone-sucrose-agar (PSA) having variable concentrations of tolylfluanid. Seven days after incubation the discs were transferred during four successive generations of seven days each, to plates containing PSA without tolylfluanid. During the process of transfer, Xam was not recovered from the discs placed in plates containing 54ppm or more of tolylfluanid. In Exp. II, untreated seeds produced 33,3 plants as compared to 0,33 plant produced by the treated seeds, 30 days after seeding. In Exp. III, 11 plants produced typical symptoms of the disease as against only one plant in plots with treated seed, 18 days after seeding. Key words: angular leaf spot, Gossypium hirsutum

2 INTRODUÇÃO De uma maneira geral, os patovares de Xanthomonas transmitidos pelas sementes são difíceis de erradicar, sendo que seu controle basicamente depende do uso de sementes livres da bactéria (MEHTA e BASSOI, 1993). Recentemente, Mehta et al (no prelo) desenvolveram um meio semi-seletivo para detectar a presença de X. axonopodis pv. malvacearum (Xam) nas sementes do algodoeiro naturalmente infectadas, e reportaram que a semente é internamente infectada e provavelmente é a fonte principal da infecção primária da mancha angular. Ao desenvolver o meio semi-seletivo, o efeito tóxico de tolylfluanid a Xam foi verificado quando sua concentração no meio era maior ou igual a 54 ppm. O objetivo do presente trabalho foi verificar a eficiência de tolylfluanid na erradicação de Xam transmitida pelas sementes do algodoeiro. MATERIAL E MÉTODOS Sementes. Sementes de quatro cultivares de algodoeiro (Coodetec 406, Makina, ITA 90 e Saturno) provenientes dos campos infestados com a mancha angular em 2001 e 2003, foram coletadas do estado de Mato Grosso, seu nível de infecção foi determinado utilizando o meio semi-seletivo (MEHTA et al, 2005), e foram armazenadas a 5 o C para futuros estudos. Tratamento de semente: O tratamento com tolylfluanid foi realizado com método de Slurry (1,20g/Kg de semente) ou colocando-as em solução de tolylfluanid (1,20g/L água) por 16h. Um número igual de sementes também foram colocadas em água por 16h e foram utilizadas como sementes não tratadas. Experimentos: Experimento I: foi realizado para verificar se o tolylfluanid possui ação bacteriostática ou bactericida, utilizando três isolados de Xam e o método de disco de papel filtro (MEHTA e BASSOI 1993), embebido em suspensão de Xam (10 6 ufc/ml), e colocados em placas de Petri contendo peptona-sacarose-agar (PSA), com concentração variável de tolylfluanid. Após cada geração de sete dias de incubação, os discos foram transferidos sucessivamente, invertidos ou não, em novas placas contendo PSA sem tolylfluanid. Experimento II: 7200 sementes tratadas e não tratadas das quatro cultivares foram semeadas em três repetições (2400 sementes por repetição) em bandejas de plástico com terra esterilizada (100 sementes por bandeja), em casa de vegetação. As plantas foram arrancadas e examinadas individualmente 30 dias após a semeadura para verificar os sintomas da mancha angular. Experimento III: a eficiência da solução de tolylfluanid foi testada em parcelas de terra de 4m 2 cada, ao lado da casa de vegetação, separadas pelo menos por 500m de cultivo de algodão, simulando assim as condições de canteiros. O delineamento experimental foi de parcelas pareadas (tratadas e não tratadas) (FAO, 1971). Para este fim, 2400 sementes tratadas e não tratadas de três cultivares (ITA 90, Saturno e Coodetec 406) foram semeadas em seis repetições (400 sementes por parcela). As médias de plantas com sintomas da doença por tratamento foram comparadas entre si (teste de Tukey). Durante o período de experimento as temperaturas em casa de vegetação variaram entre 20,4 o C e 36,6 o C (média de 27 o C), e a umidade relativa do ar entre 23,5% e 89,6% (média de 61,5%). Nas condições de canteiros as temperaturas oscilaram entre 18,8 e 29,9 o C (média de 23,88 o C), e umidade relativa do ar entre 57,5% e 74,0% (média de 70,8%).

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO As sementes naturalmente infectadas dos três lotes produziram em média de 4 a 33 colônias de Xam. As sementes da cv. Coodetec 406 eram livres de bactéria (Tab. 2). A ação de tolylfluanid como bactericida contra Xam a 54 ppm foi confirmada através do experimento I, pois a bactéria não foi recuperada dos discos, invertidos ou não, durante quatro gerações sucessivas (Tab. 1). No experimento II, os primeiros sintomas da doença foram verificados na cv. ITA 90 aos 18 dias após o plantio. No caso da cv. ITA 90 tratada com tolylfluanid em forma de "Slurry" um total de cinco plantas com a doença foram observadas, enquanto que, quando tratada com solução de tolylfluanid apenas uma planta apresentou sintomas leves aos 30 dias do plantio. Provavelmente esta última infecção era secundária e foi transmitida por insetos (Tab. 3). Neste experimento, as sementes não tratadas produziram em média 33,3 plantas doentes (Tab. 2). No experimento III, as primeiras plantas com sintomas típicos da mancha angular também foram verificadas aos 18 dias após o plantio apenas na cv. ITA 90, sendo que um total de 11 plantas nas parcelas com sementes não tratadas mostraram sintomas da doença, enquanto que apenas uma planta nas parcelas com sementes tratadas mostrou leves sintomas. As parcelas com sementes tratadas mostraram estatisticamente menor número de plantas infectadas 30 a 40 dias de plantio, (Tab. 4). Devido a suspeita de infecção secundária, a partir de 40 dias após o plantio, nenhuma observação foi realizada. As sementes das cvs. Saturno, Makina e Coodetec 406 eram livres de bactéria ou apresentaram baixo nível de infecção e, portanto, não demonstraram nenhuma planta doente. Os resultados claramente demonstram a alta eficiência de tolylfluanid como bactericida contra Xam na concentração de 54 ppm ou mais. Tais resultados sem dúvida servirão como base para futuros trabalhos de campo, para determinar a dose mínima de tolylfluanid, utilizando-se um maior tamanho de parcela, e uma distância maior entra as parcelas. O tolylfluanid é comercializado como fungicida Euparen M 500 PM, para tratamento de sementes (150g/100Kg de sementes) de algodão, feijão e milho e controla alguns patógenos fúngicos transmitidos pelas sementes (BAYER, 2003; GOULART e FERRAZ, 2001). A dosagem de tolylfluanid utilizada no presente trabalho (1,20g/Kg) foi inferior a recomendada. Aliado ao uso de cultivares resistentes e sementes sadias, o tratamento das sementes com tolylfluanid ajudará a controlar a mancha angular do algodoeiro. Este é o primeiro relato de um bactericida para erradicar a infecção de Xam nas sementes do algodoeiro.

4 Tabela 1. Recuperação de Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Xam) dos discos de papel filtro colocados no meio Peptona-sacarose-agar (PSA) contendo diferentes concentrações de tolylfluanid por sete dias em 24º C. Código do isolado de Xam Crescimento de colônias de Xam em PSA com diferentes centrações (ppm) de Tolylfluanid *** ** *** ** *** ** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** 0 0 ***=abundante; **=médio; 0=zero de crescimento, sete dias após a incubação a 24 o C. Tabela 2. Nível de infecção natural de sementes das quatro cultivares do algodoeiro com Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Xam) determinadas através de meio semiseletivo.. Lote de semente Número médio de colônias de Xam recuperadas 8-12 dias após a incubação de sementes em meio semi-seletivo* Não tratada Tratada 1. ITA 90 33,00 (0,47%) 0,00 2. Saturno 4,00 (0,13%) 0,00 3. Coodetec 406 0,00 0,00 4. Makina 4,00 (0,13%) 0,00 * Sementes foram desinfectadas com álcool e hipoclorito de sódio sementes foram colocadas em placa de Petri contendo meio semi-seletivo em três repetições (2400 sementes por repetição). As placas foram examinadas periodicamente entre 8-12 dias e as colônias típicas de Xam foram isoladas. A identificação das colônias de Xam foi confirmada através de teste de gram, aspectos morfológicos e teste de patogenicidade em casa de vegetação (MEHTA et al, no prelo).

5 Tabela 3. Efeito do tratamento de sementes de quatro cultivares do algodoeiro com tolylfluanid na transmissão de Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum em casa de vegetação. Lote de semente Número médio de plantas com sintomas típicos da mancha angular 30 dias após a semeadura com sementes tratadas e não tratadas* Não tratada Tratada Tratada com "Slurry" 1. ITA 90 30,30 0,33 1,20 2. Saturno 0,00 0,00-3. Coodetec 406 0,00 0,00-4. Makina 0,00 0,00 - * Sementes externamente desinfectadas com álcool e hipoclorito de sódio, tratadas ou não, através de emersão em solução de tolylfluanid (1,20g/L água), por 16h. - Apenas sementes da cv. ITA 90 foram também tratadas com Slurry, utilizando-se a mesma dosagem de tolylfluanid (1,20g/100kg) sementes tratadas ou não foram semeadas em bandejas de plástico (100 sementes/bandeja) em três repetições (2400 sementes por repetição). As plantas foram examinadas periodicamente até 30 dias para os sintomas típicos da Xam. A bactéria foi isolada dos sintomas e sua identidade foi confirmada como sendo Xam. Tabela 4. Efeito do tratamento de sementes da cultivar ITA 90 do algodoeiro com tolylfluanid (1,20g/100kg) na transmissão da mancha angular causada por X. axonopodis pv. malvacearum em condições de canteiros. Tratamento de semente** Número médio de plantas com sintomas típicos da mancha angular * Dias após a semeadura Não tratadas 1,83 aa 13,00 aa 100,33 ab 146,3 ac 2. Tratadas 0,17 ba 4,67 ba 20,00 ba 95,3 bb * Duas mil e quatrocentas sementes tratadas e não tratadas foram semeadas em seis repetições (400 sementes em canteiro de 4m 2 por repetição). ** Tratamento de semente realizado através de imersão em solução de tolylfluanid com concentração de 1200ppm por 16h. Os dados são médias de seis repetições por tratamento. Números com mesmas letras não diferem entre si (Tukey p= 0,05). Comparação entre os tratamentos indicado por letras minúsculas e entre os dias após a semeadura por letras maiúsculas. CONCLUSÃO Tolylfluanid é altamente eficiente como bactericida para a erradicação de Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum transmitida por sementes de algodoeiro. (*) Apoio financeiro do FACUAL.

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BAYER. Crop Science para a agricultura moderna. Correio Agrícola - A revista da Bayer, n. 2, p FAO - FOOD AND AGRICULTURAL ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS. Crop loss assessment methods. Rome: FAO, p. (FAO manual on the evaluation and prevention of lossess by pests, diseases and weeds) GOULART, A. C. P.; FERRAZ, D. M. Efeito do tratamento de sementes de algodão com fungicidas no controle do tombamento de plântulas causado por Rhizoctonia solani. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ALGODÃO, 3, 2001, Campo Grande. Anais. Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Dourados: Embrapa, p MEHTA, Y. R.; BASSOI, M. C. Guazatine Plus as a seed treatment bactericide to eradicate Xanthomonas campestris pv. undulosa from wheat seeds. Seed Science and Technology, v. 21, p MEHTA, Y.R.; BOMFETI, C.; BOLOGNINI, V. A semi-selective agar medium to identify the presence of Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum in naturally infected cotton seed. Fitopatologia Brasileira (No Prelo).