GUILHERME OSCAR HINING

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1 1 GUILHERME OSCAR HINING EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE AFLATOXINAS POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA CANOAS, 2011

2 2 GUILHERME OSCAR HINING EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE AFLATOXINAS POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Química do Centro Universitário La Salle Unilasalle como exigência parcial para obtenção do grau de Bacharel em Química. Orientação: Profª. Drª. Marisa Tsao CANOAS, 2011

3 3 GUILHERME OSCAR HINING EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE AFLATOXINAS POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA Trabalho de Conclusão aprovado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química pelo Centro Universitário La Salle Unilasalle Aprovado pelo avaliador em 15 de dezembro de AVALIADOR: Profª. Drª. Marisa Tsao Unilasalle

4 4 RESUMO As micotoxinas são metabólitos secundários altamente tóxicos produzidos por algumas cepas de fungos. Dentre as toxinas mais perigosas, encontram-se as aflatoxinas, que representam grande risco a saúde humana e animal sendo potencialmente carcinogênicas. A contaminação por aflatoxinas pode representar prejuízos econômicos e sérios danos à saúde, sendo pertinente, medidas de controles sistemáticos desta toxina por meio de monitoramento e a fiscalização dos alimentos. A química analítica mostra-se aliada neste contexto. Através dos ensaios analíticos é possível a extração da toxina dos alimentos e a sua posterior quantificação pela técnica da cromatografia em camada delgada (CCD). Embora existam outras técnicas para quantificação desta toxina, a CCD é uma técnica bastante usada, principalmente, em países em desenvolvimento por não requisitar grandes aparatos tecnológicos e apresentar resultados analíticos satisfatórios e que foi objeto deste trabalho de conclusão de curso. Foram analisadas 48 amostras, entre elas, amendoim e derivados de milho, que pertencem ao grupo de alimentos de alta suscetibilidade de contaminação por aflatoxinas. Os resultados das análises mostraram que as aflatoxinas continuam a contaminar alimentos para consumo humano, inclusive, com níveis de contaminação superior ao limite máximo permitido pela legislação do país. Palavras-chave: Aflatoxinas. Ensaios analíticos. Cromatografia em camada delgada.

5 5 ABSTRACT Mycotoxins are highly toxic secondary metabolites produced by some strains of fungi. Among the most dangerous toxins, are the aflatoxins, which represent a great risk to human and animal health being potentially carcinogenic. The aflatoxin contamination may represent economic losses and serious damage to health, and relevant control measures of this toxin through systematic monitoring and surveillance of food. The analytical chemistry appears to be allied in this context. Through the analytical tests it is possible to extract the toxin from food and their subsequent quantification by the technique of thin layer chromatography (TLC). Although there are other techniques for quantification of this toxin, the TLC is a technique widely used, especially in developing countries for not ordering large technological devices and present analytical results were satisfactory and that the subject of this course conclusion. We analyzed 48 samples, including, peanuts and corn derivatives, which belong to the high susceptibility of food contamination by aflatoxins. The test results showed that aflatoxins continue to contaminate food for human consumption, even with contamination levels exceed the maximum allowed by law in the country. Key-words: Aflatoxins. Analytical tests. Thin layer chromatography.

6 6 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Estrutura química das aflatoxinas Figura 2 Núcleo furano e cumarina Figura 3 Biotransformação da aflatoxina B Figura 4 Aflatoxina B Figura 5 Carta controle Figura 6 Etapas da extração das aflatoxinas Figura 7 Delimitação da cromatofolha Figura 8 Placa de camada delgada com amostra de castanha-do-pará sob luz UV (comprimento de onda de 366 nm) Figura 9 Delimitação da placa de camada delgada bidimencional Figura 10 Distribuição das regiões de amostragem Figura 11 Distribuição das amostras analizadas Figura 12 Percentual de amostras contaminadas Figura 13 Grupos de aflatoxinas identificados nas amostras contaminadas Figura 14 Panorama geral do estudo realizado Figura 15 Relação entre origem das amostras e contaminação LISTA DE QUADROS Quadro 1 Alimentos e o risco de contaminação por tipo de micotoxina Quadro 2 Absorbância das soluções Quadro 3 Valores de absortividade molar (ε) das aflatoxinas em acetonitrila em 350 nm Quadro 4 Limite máximo tolerado (LMT) das aflatoxinas em alguns alimentos... 40

7 7 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Principais fungos e suas toxinas Tabela 2 Classificação dos alimentos conforme sua atividade de água Tabela 3 Atividade de água para algumas espécies fúngicas Tabela 4 Limite mínimo da umidade relativa do ar Tabela 5 Temperaturas para produção e crescimento das aflatoxinas Tabela 6 Toxicidade de algumas aflatoxinas Tabela 7 Distribuição das amostras Tabela 8 Amostras de outros estados Tabela 9 Tipos de amostras e sua contaminação Tabela 10 Aflatoxinas quantificadas nas amostras contaminadas... 55

8 8 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Afla. Aflatoxina AFB1 ou B 1 Aflatoxina B 1 AFB2 ou B 2 Aflatoxina B 2 AFG1 ou G 1 Aflatoxina G 1 AFG2 ou G 2 Aflatoxina G 2 AM Amostra ANVISA Agência Nacional Vigilância Sanitária AOAC Association of Official Analytical Chemists C Concentração (mol/l) CCD (TLC) Cromatografia em camada delgada DNA Ácido desoxirribonucléico EP Ensaio de proficiência FC Fator de correção FEPPS Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde FR Formulário de registro HPLC High performance liquid chromatography HMF High moisture food INMETRO Instituto Nacional de Metrologia IPB Instituto de Pesquisas Biológicas IMF Intermediate moisture food LACEN Laboratório Central de Saúde Pública LMF Low moisture food LD Limite de detecção LQ Limite de quantificação LMT Limite máximo tolerado MM Massa molecular NBR Norma Brasileira de Regulamentação P Padrão PEMQSA Programa Estadual de Monitoramento e Qualidade Sanitária dos Alimentos RBC Rede Brasileira de Calibrações RS Rio Grande do Sul

9 9 RF RDC SVS TFA UV Fator de retenção Resolução da Diretoria Colegiada Secretaria de Vigilância em saúde Ácido trifluoracético Ultra violeta

10 10 LISTA DE SÍMBOLOS A a w ε Absorbância atividade da água Absortividade molar Absortividade molar média cm centímetro λ comprimento de onda ºC grau centígrado kg quilograma g grama h hora min minuto µg micrograma ml mililitro µl microlitro nm nanômetro ppb partes por bilhão T Temperatura

11 11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Contaminação por aflatoxinas Natureza química das aflatoxinas Fungos Ocorrência e condições de contaminação Medidas preventivas Produção e condições para o crescimento de micotoxinas Substrato Atividade de água (aw) Temperatura Origem da contaminação de alimentos por micotoxinas Descontaminação e inativação de micotoxinas Biotransformação das aflatoxinas Toxicidade Detecção das aflatoxinas Controle de qualidade de ensaios analíticos Ensaio de proficiência Padrões de aflatoxinas Cuidados com padrões de aflatoxinas Determinação da concentração das soluções de trabalho dos padrões Legislaçãosobre micotoxinas Fiscalização PARTE EXPERIMENTAL Metodologia analítica Materiais e equipamentos Reagentes Descrição do método Amostrageme extração Purificação Partição líquido-líquido Concentração e ressuspensão Determinação e quantificação das aflatoxinas... 45

12 Confirmação Cálculo RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 59

13 13 1 INTRODUÇÃO As aflatoxinas são um grupo de furanocumarinas altamente tóxicas produzidas por algumas cepas de fungos, principalmente, Aspergillus Flavus e Aspergillus Parasiticus. Nos anos 80, a Vigilância Sanitária do Distrito Federal detectou a presença de aflatoxinas em amendoins e derivados destinados ao consumo humano. Desde então, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), através de programas como, Programa Estadual de Monitoramento e Qualidade Sanitária dos Alimentos (PEMQSA), monitora e avalia a qualidade dos alimentos comercializados no país no que tange à micotoxinas, especialmente, às aflatoxinas. A principal proposta deste trabalho é apresentar os níveis de contaminação por aflatoxinas em produtos de alta suscetibilidade, como amendoim ederivados e também, derivados de milho, oferecidos ao consumo humano no estado do Rio Grande do Sul. As amostras foram provenientes, na sua maioria, do PEMQSA e analisadas entre os meses de agosto e novembro de 2011 no Laboratório de Micotoxinas vinculado a Seção de Contaminantes pertencente ao Instituto de Pesquisas Biológicas - Laboratório Central de Saúde Pública - IPB-LACEN/RS, usando-se a técnica de extração publicada pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC) e Cromatografia em Camada Delgada (CCD) para quantificação das amostras.

14 14 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Contaminação por aflatoxinas Os primeiros relatos da presença de micotoxinas ocorreram na Europa e na Ásia provocando epidemias em humanos e animais levando milhares a morte. Na época, suspeitava-se que a origem destes surtos estavam relacionados à dieta alimentar As aflatoxinas foram descobertas em 1960, após mortandade de milhares de perus jovens ocorrido na Inglaterra, os quais, teriam sido alimentados com ração à base de amendoim contaminado proveniente do Brasil e da África. As aves afetadas morriam geralmente dentro de uma semana, sendo seus sintomas, a perda de apetite, diminuição da mobilidade, fraqueza das asas, das pernas. A necropsia sempre revelava lesões necróticas no fígado e congestionamento nos rins. (STEVENS et al., 1960 apud MOLIN; VALENTINI, 1999, p. 1). Segundo a Food Ingredients Brasil (2009) e Jay (2005), a partir da ração que causou a morte dos animais na época, foram isolados Aspergillus flavus e uma toxina produzida por esse fungo, a qual foi designada aflatoxina (toxina do Aspergillus flavus A-Afla toxina). Em 1963, pesquisadores separaram, por cromatografia em papel, as aflatoxinas B e G, assim classificadas por apresentar fluorescência azul (B = blue) everde (G = green) quando observadas sob luz ultravioleta (366 nm), devido ao anel furocumarínico. Posteriormente, um grupo de pesquisadores da Inglaterra isolou por diferenças de mobilidade em cromatografia de camada delgada quatro toxinas: Aflatoxinas B 1, B 2, G 1 e G 2. A partir desta descoberta, as atenções e estudos sobre micotoxinas vem sendo intensificadas. Molin e Valentini (1999) relatam sobre a descoberta das fórmulas estruturais das aflatoxinas B e G, elucidadas em 1963 por Asao et al. (1963) e por Van der Merwe et al. (1963). A fórmula estrutural da aflatoxina B 2 foi determinada simultaneamente por Chang et al. (1963) nos EUA e por Van Dorp et al. (1963) na Bélgica e, posteriormente, na Escócia, foi determinada a estrutura química da AFG 1 por Cheung e Sim (1964).

15 15 Na Figura 1 abaixo, é representado à estrutura química de cada uma das quatro principais aflatoxinas: onde AFB1 representa a aflatoxina B 1, AFB2 a aflatoxina B 2, AFG1 a aflatoxina G 1 e AFG2 representa a aflatoxina G 2. Figura 1 Estrutura química das aflatoxinas Fonte: Freire et al., Natureza química das aflatoxinas Conforme Araujo (2006) apud kwiatkowski e Alves (2007), as aflatoxinas pertencem à classe de compostos químicos denominados furanocumarinas. Possuem um núcleo cumarina associado ao furano e a lactona (Figura 2). As aflatoxinas do grupo B possuem anel ciclopentona e o grupo G, lactonas insaturadas, enquanto grupo M são derivados hidroxilados de B1 e B2. As aflatoxinas são substâncias lipofílicas de baixa massa molecular, onde AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 tem massa molecular de 312, 314, 328, 330 g/mol, respectivamente. As aflatoxinas são cumarinas altamente substituídas com mais de 18 toxinas conhecidas. A aflatoxina B 1 é produzida por todos os fungos produtores de aflatoxinas e tem em AFM 1 como produto hidroxilado da AFB 1. A AFM 1 é encontrada no leite, urina e fezes de animais como um produto metabólico.

16 16 Figura 2 Núcleo furano e cumarina Furano (cumarina) Lactona Fonte: Solomons; Fryhle, Hoje, sabe-se que das micotoxinas, as aflatoxinas B 1, B 2, G 1, G 2 são as mais importantes. Contaminam facilmente grãos e cereais e são altamente tóxicas e facilmente entram na cadeia alimentar, seja humana ou animal. A aflatoxina B 1 é o composto com maior atividade carcinogênica que se conhece, não sendo desprezível sua atividade mutagênica. (GOMPERTZ et al., 2002, p. 424). 2.2 Fungos Os fungos formam filamentos denominados hifas, que em conjunto formam micélios, os quais, são responsáveis pela fixação dos bolores no substrato e posterior reprodução. O micélio, também dá aspecto característico às colônias que forma: Estas colônias podem ter um aspecto cotonoso, ser secas, úmidas, compactas, aveludadas, gelatinosas, com variadas colorações. (FRANCO e LANDGRAF, 2003, p.3). Conforme Antón e Lizaso (2001), os fungos que crescem nos alimentos são conhecidos pelo homem desde a antiguidade. Ele os tem utilizado em seu próprio beneficio, tanto para melhorar alimentos, como para fins terapêuticos (antibióticos). As principais espécies fúngicas produtoras de toxinas pertencem aos gêneros: Alternaria, Aspergillus, Claviceps, Fusarium, Penicillium, Phitomyces, Myrothecium, Stachybotrys e Phoma. (GOMPERTZ et al., 2002, p. 423). Alguns destes gêneros são toxigênicos, deterioradores de alimentos e produtores de micotoxinas. Jay (2005) cita que micotoxinas são metabólitos secundários formados durante a fase exponencial de crescimento dos fungos não tendo significância para o crescimento ou metabolismo do organismo produtor. No entanto, quando aminoácidos, acetatos, piruvatos e outros precursores primários são formados em

17 17 grandes quantidades, a síntese dessas substâncias em micotoxinas pode ser uma maneira natural dos fungos reduzirem tais precursores. Elas são substâncias químicas [...] não são essenciais ao crescimento e ao desenvolvimento dos fungos, o que significa dizer, que mesmo na ausência destas, há crescimento e desenvolvimento fúngico. (MOLIN; VALENTINI, 1999, p. 1). Conforme Sabino et al. (2008), a produção de micotoxinas pelos fungos também necessita que condições ambientais como, temperatura e umidade sejam favoráveis, além disso, necessitam que características bioquímicas nos substratos propiciem a sua produção e crescimento. Freire et al. (2007) cita que as micotoxinas podem entrar na cadeia alimentar humana e animal por meio de contaminação direta ou indireta. A contaminação indireta de alimentos e rações ocorre pela contaminação prévia de fungo toxigênico, bem como, a produção de micotoxinas, e mesmo que o fungo tenha sido eliminado durante o processamento, essas toxinas ainda permanecerão no alimento. A contaminação direta ocorre quando um fungo toxigênico coloniza alimentos com posterior formação de micotoxinas e a ingestão. Entre as principais micotoxinas de interesse na área de alimentos citamos: aflatoxinas, patulina, ocratoxina, zearalenona, tricotecenos, fumosinas. (SABINO et al., 2008, p. 761). A Tabela 1 apresenta as principais toxinas geradas por fungos, seus substratos predominantes e os efeitos sobre a saúde humana e animal.

18 18 Tabela 1 Principais fungos e suas toxinas Principais substratos Principais fungos produtores Principal toxina Efeitos Amendoim, milho. Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus Aflatoxina B1 Hepatotóxica, nefrotóxica, carcinogênica. Trigo, aveia, cevada, milho e arroz. Centeio e grãos em geral. Penicillium citrinum Claviceps purpúrea Citrinina Ergotamina Nefrotóxica para suínos Gangrena de extremidades, convulsões Milho Fusarium verticillioides Fumonisinas Câncer de esôfago Cevada, café, vinho. Aspergillus ochraceus e Aspergillus carbonarius Ocratoxina Hepatotóxica, nefrotóxica, carcinogênica. Frutas e sucos de frutas Penicillium expansum e Penicillium griseofulvum Patulina Toxicidade vagamente estabelecida Milho, cevada, aveia, trigo, centeio. Fusarium sp Myrothecium sp Stachybotrys sp Trichothecium sp Tricotecenos: T2, neosolaniol, fusanona x, nivalenol, deoxivalenol. Hemorragias, vômitos, dermatites. Cereais Fusarium graminearum Zearalenona Baixa toxicidade; síndrome de masculinização e feminização em suínos Fonte: Food Ingredients Brasil, Ocorrência e condições de contaminação Para Kwiatkowski e Alves (2007) e Molin e Valentini (1999) a infecção fúngica nas plantas, seu crescimento e a posterior produção de micotoxinas em alimentos pode ocorrer sob várias condições e, de modo geral, podemos dividir os fungos

19 19 produtores de micotoxinas em dois grupos principais: os fungos de campo ou précolheita, que são aqueles em que a contaminação inicia-se no plantio e vai até depois da safra, e fungos de armazenamento, que atacam após a colheita, durante a silagem. Conforme Molin e Valentini (1999), os fungos de campo são mais toxigênicos, pois tem longo período para se desenvolver nas plantas, considerando-se ainda, que elas ficam sujeitas as intempéries climáticas, como: geadas, granizo, chuva em excesso ou falta, extremos de temperaturas; condições do solo e relevo, como: falta de nutrientes, competição com plantas invasoras, ação de roedores e condições de manejo como: plantio em época errada, atraso na colheita ou fora do tempo. Já os fungos de armazenamento ou pós-colheita ocorrem, principalmente, devido ao manejo inadequado durante e após a colheita, com armazenagem e silagens mal conduzidas, como por exemplo, grãos armazenados com altos teores de umidade, silos mal vedados, fermentação da silagem, ação de roedores e insetos. Os fungos têm grande capacidade de adaptação e podem se desenvolver em quase todas as plantas no campo, tipos de cereais, oleaginosas ou em ingredientes de ração armazenada para consumo posterior. Em quase todas as matérias-primas destinadas a gêneros alimentícios, tais como: arroz, milho, feijão, trigo, cevada, soja, castanha-do-pará, nozes, amendoim, café, sorgo, [...] já foram detectados um ou mais tipos de micotoxinas. (SABINO et al., 2008, p. 761.). No entanto, a presença de fungos não significa contaminação por micotoxinas. Jay (2005) cita que o crescimento de fungos produtores de toxinas, podem sob determinadas circunstâncias, não produzir tais toxinas porque tais toxinas não são essenciais ao crescimento do fungo. Os alimentos que apresentam maior risco de contaminação por aflatoxinas são respectivamente, amendoim e milho, conforme Quadro 1.

20 20 Quadro 1 Alimentos e o risco de contaminação por tipo de micotoxina Alimento Fungo Micotoxina Risco de contaminação Amendoim, amêndoas Aspergillusflavus Aflatoxina alto A. flavus Aflatoxina Milho Fusarium spp Tricotecenos alto Sorgo F. moniliforme Zearalenona Fusarium spp Alternaria spp Tricotecenos Alternariol, metil etil alternariol A. flavus Aflatoxina alto Penicillium spp Ocratoxina, Ac. Ciclopiazônico, tremorgênio, citrinina Trigo Alternaria spp Alternariol, metil etil alternariol Ac. Tenuazônico, moderado Fusarium spp Tricotecenos F. graminearum Deoxinivalenol Cevada P. verrucosum Ocratoxina Farinha Penicillium Várias Cereais matinais à base de milho Fusarium spp Aspergillus flavus Tricotecenos, Fumonisinas Aflatoxinas Cereais matinais à base de trigo Fusarium spp Tricotecenos Moderado Queijo Penicillium Várias Carnes process.salame Penicillium Várias Leite e queijo Resíduos Aflatoxina M Ovos Resíduos Aflatoxinas, ocratoxinas, tricotecenos Maçã Penicillium Patulina Fonte: Adaptado de Taniwaki et al., 2011.

21 21 A razão pela qual a ocorrência de aflatoxinas é alta em amendoim não foi completamente estabelecida. Um dos motivos pode ser atribuído ao fato de que A. Flavus e A. Parasiticus dominarem na micoflora em solos de plantio de amendoim. (MACHINSKI JUNIOR, 2011) Medidas preventivas A prevenção ao crescimento fúngico e produção de micotoxinas é complexa e pode envolver inúmeras condições. A redução da atividade de água, secagem rápida e armazenagem com condições controladas de umidade e temperatura, remoção de unidades danificadas e grãos contaminados, ajuda na prevenção ao crescimento dos fungos. O uso de cultivares resistentes para amendoim e algumas práticas, como calagem, secagem e escolha de tipos de solo que interferem na biossíntese das aflatoxinas. Além disso, cuidar a época de colheita, evitando que o alimento fique mais tempo exposto, aumenta a segurança do alimento e inibe o desenvolvimento dos fungos micotoxigênicos. (VIEGAS et al., 2005, ROSSETO et al., 2003 e FERNADEZ et al., 1997 apud KWIATKOWSKI; ALVES, 2007) 2.3 Produção e condições para o crescimento de micotoxinas Kwiatkowski e Alves (2007) citam que micotoxinas são encontradas mundialmente e que regiões que tenham temperatura e umidade alta são as principais áreas de ocorrência. Neste contexto, o Brasil, devido às condições climáticas favoráveis, dispõe de condições ideais para o desenvolvimento de fungos. O Brasil, devido à prevalência de clima tropical, apresenta condições ideais para o desenvolvimento desses fungos. (KWIATKOWSKI; ALVES, 2007, p. 46). Amaral e Machinski Junior (2006), citam que as aflatoxinas são produzidas por três espécies de Aspergillus: A. flavus, A. parasiticus e A. nomius. A. Flavus produz apenas aflatoxinas do grupo B (aflatoxinas B 1 e B 2 ), enquanto A. Parasiticus e A. Nomius produzem aflatoxinas dos grupos B e G (aflatoxinas B 1, B 2, G 1 e G 2 ). Os fatores mais importantes para produção de micotoxinas são citados: sendo que a temperatura, a umidade e o tipo de substrato são os mais importantes. (MALLOZZI; CORRÊA, 1998 apud GONÇALEZ et al., 2001, p. 15).

22 Substrato Alguns substratos são mais suscetíveis ao desenvolvimento de micotoxinas que outros, principalmente devido ao seu teor de carboidratos. Franco e Landgraf (2003), cita que além de carboidratos, também substratos ricos em proteínas e gorduras favorecem a produção de aflatoxinas. Sementes oleaginosas, como amendoim e castanha do Brasil também são suscetíveis. (TANIWAKI et al., 2011, p.46) Atividade de água (aw) Percebe-se que da discussão anterior, a disponibilidade de água também é fundamental para o crescimento de aflatoxinas. Em geral, a forma mais adequada de quantificá-la é através de atividade de água (a w ), que é a relação entre a pressão de vapor de um determinado material (P) e a pressão de vapor da água pura (P o ), nas mesmas condições. Em termos práticos, a a w de um alimento reflete a quantidade de água livre disponível, isto é, a água não comprometida com ligações químicas, dissolução de solutos, metabolismos, entre outros. A água existente nos alimentos nem sempre se encontra disponível para o fungo porque alguns substratos estão fortemente ligados à água, retendo-a, dificultando sua absorção. (SCUSSEL, 1998; MALLOZZI; CORREA, 1998 apud GONÇALEZ et al., 2001, p. 15). Nem toda a água do grão está igualmente disponível. Alguma água está fortemente adsorvida nos constituintes do grão através de pontes de hidrogênio de alta energia, inicialmente numa monocamada de moléculas e é referida como água ligada. Fora desta camada a água vai se tornando cada vez mais fracamente ligada quanto mais longe estiver dos constituintes do grão. Eventualmente as moléculas de água vão ficando livres de ligações químicas, mas são retidas em microporos, [...]. À medida que os poros enchem, a água que eles contêm torna-se cada vez mais prontamente disponível aos microrganismos até o grão se saturar e a água ficar completamente disponível. (MOLIN; VALENTINI, 1999, p.10). Considerando-se a necessidade da disponibilidade de água livre para o crescimento de microorganismos, sua ausência, torna-se fator limitante para o crescimento e a velocidade de multiplicação desses seres, retardando a contaminação e a deterioração dos alimentos.

23 Na Tabela 2, é apresentada a classificados os alimentos quanto aos limites de atividade de água (a w ) presente em sua composição: 23 Tabela 2 Classificação dos alimentos conforme sua atividade de água (a w ) Classificação do Alimento Atividade de água (a w ) alta umidade ou High Moisture Food HMF intermediária ou Intermediate Moisture Food IMF baixa umidade ou Low Moisture Food LMF a w > 0,90 a w entre 0,89 e 0,60 a w < 0,60 Fonte:Landgraf e Franco, Conforme Gonçalez et al. (2001) o Aspergillus flavus requer uma atividade de água mínima entre 0,78 e 0,80 para o crescimento e 0,83 a 0,87 para produção de toxina. Para Franco e Landgraf (2003) os alimentos com atividade de água entre 0,80 e 0,85, a deterioração ocorre dentro de uma a duas semanas, causada por uma grande variedade de fungos. Com a w igual 0,75 a deterioração é retardada e a 0,70 ou inferior, pode não ocorrer. Citam ainda, o conceito água de alarme (alarm water) como parâmetro para estimar a estabilidade de alimentos desidratados durante o armazenamento. Está relacionado à quantidade de água que não deve ser excedida e assim, evitar o crescimento de fungos. Marthe Calanog (1976) apud Jay (2005), relata que em a w 0,94 a temperatura ótima para produção de aflatoxina B 1 é de 24º C. A Tabela 3, mostra a atividade de água (a w ) mínima e atividade de água (a w ) ótima para crescimento e produção de aflatoxinas.

24 24 Tabela 3 Atividade de água (a w ) para algumas espécies fúngicas Espécie Fúngica a w mínima a w ótima Processo A. flavus 0,80 0,98 Crescimento A. flavus 0,82 0,95-0,99 Produção A. parasiticus 0,80-0,83 0,99 Crescimento A. parasiticus 0,86-0,87 0,95 Produção Fonte: Adaptado de Pitt & Hocking, 2009, apud Taniwaki et al., De acordo com Taniwaki et al. (2011, p. 46), a maioria dos fungos requer umidade relativa acima de 80% e um mínimo de a w para crescer. Os limites mínimos de umidade para crescimento de A. flavus e produção de aflatoxinas em diferentes alimentos estão relacionados na Tabela 4. Tabela 4 Limite mínimo da umidade relativa do ar para crescimento de aflatoxinas Umidade (%) Alimento Fonte: Taniwaki et al., Trigo, milho e sorgo 16,5 Arroz não beneficiado 17,5 Arroz beneficiado Soja 9 10 Amendoim Temperatura A temperatura é outro fator importante para o crescimento dos fungos, a produção de micotoxinas e conseqüentemente, a contaminação de alimentos por estas toxinas. Sua variação influencia e caracteriza os mínimos e máximos de crescimento fúngico, em conjunto com outros fatores, como substrato e a w. De uma forma geral, a temperatura ótima para produção de toxinas encontra-se entre o mínimo e o máximo da temperatura de crescimento.

25 25 Segundo a Food Ingredients Brasil (2009, p. 37), A temperatura ótima para o crescimento de micotoxinas esta determinado entre 24 C e 28 C. Christensen (1971) apud Jay (2005) relata que sob condições ideais de crescimento algumas aflatoxinas podem ser detectadas em 24 horas ou dentro de 4 a 10 dias. Tabela 5 Temperaturas para produção e crescimento das aflatoxinas Espécie Fúngica T. mínima ( C) T. ótima ( C) T. máxima ( C) Processo A. flavus crescimento A. flavus produção A. parasiticus crescimento A. parasiticus produção Fonte: Adaptado de Pitt & Hocking, 2009 apud Taniwaki et al., Origem da contaminação de alimentos por micotoxinas Para Sabino et al. (2008) cita que devido aos graves problemas que as micotoxinas podem acarretar, muitos países tem estabelecido medidas para o seu controle nos alimentos destinados ao consumo humano e também animal. Programas de monitoramento dos níveis de contaminação de alimentos por micotoxinas são essenciais para estabelecer prioridades em ações de vigilância sanitária. (CALDAS et al., 2002, p. 320.). Considerando que o Brasil é um grande produtor e exportador de grãos e carne, problemas decorrentes da contaminação por micotoxinas resultariam, além dos problemas de relacionados à saúde pública, em sérios prejuízos econômicos. Cada vez maior o número de países que importam e exportam, [...] leva a novos desafios para a indústria alimentícia e para os órgãos reguladores responsáveis pelo cumprimento das normas relativas à inocuidade dos alimentos comercializados e a proteção dos consumidores. (SABINO et al., 2008, p. 761.). Conforme Molin e Valentini (1999), a contaminação de silagens, cereais e rações pode gerar danos à saúde animal, como: diminuição da produtividade, problemas na reprodução,

26 26 retardado no ganho de peso para animais confinados, pré-disposição a doenças e a morte dos animais. Preocupados com a saúde pública, governantes mantêm políticas de monitoramento destas toxinas, como por exemplo, o Programa Estadual de Monitoramento e Qualidade Sanitária dos Alimentos (PEMQSA), que desde 2003, através da parceria entre estado, municípios e a vigilância sanitária, disponibiliza material humano e recursos financeiros para a obtenção de amostragens, a realização das análises e laudos técnicos e, a manutenção contínua da fiscalização de alimentos. Neste contexto, o Laboratório Central de Saúde Pública LACEN/RS, instituição vinculada a Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde FEPPS, através do seu Laboratório de Micotoxinas, realiza o monitoramento dos níveis de aflatoxinas em alimentos consumidos no Rio Grande do Sul. Utilizando metodologias analíticas adequadas, pesquisa e fiscaliza a presença, principalmente, das aflatoxinas B 1, B 2, G 1, G 2 em alimentos, como: milho e derivados, amendoim e derivados, trigo e derivados, arroz, castanhas e nozes comercializados no estado Descontaminação e inativação de micotoxinas Não são conhecidos métodos de descontaminação aplicados a produtos destinados à alimentação capazes de garantir 100 % da qualidade do alimento. Por isso, a prevenção ainda é o melhor método para controlar micotoxinas em alimentos. Conforme Sekiyama (2006), deve-se atentar que os testes que demonstraram ser eficazes in vitro, não apresentaram, necessariamente, a mesma efetividade ao serem realizados in vivo. Resultados, muitas vezes satisfatórios na eliminação das contaminações causadas pelos fungos, porém, podem interferir na qualidade dos alimentos e suas propriedades organolépticas. Perda de nutrientes, descaracterização da aparência, odores e, em outros, a presença residual de produtos químicos podem deixar o alimento impróprio para o consumo, tanto na forma de ração animal quanto para alimentação humana. Por exemplo, o calor usado no processamento dos alimentos não é eficiente para neutralizar a ação das aflatoxinas. Franco e Landgraf (2003) citam que amendoim contaminado quando torrado pode reduzir AFB 1 em 70% e AFB 2 em 45%. Prado e Oliveira (1996), fizeram a torração do amendoim com forno de microondas e

27 27 observaram que em potência máxima de 0,8 kw, por 6 minutos foi capaz de destruir de 41,52 a 69,56% do total de aflatoxinas presentes em uma amostra previamente contaminada. O emprego de calor e hidróxido de sódio mostrou-se eficiente na inativação das aflatoxinas quando aplicado sobre grãos de milho armazenados. Segundo Camou- Arriola e Prince (1989) apud Jay (2005), milho naturalmente contaminado com 1600 ppm de aflatoxina quando tratado com de NaOH a 3% e a 100 ºC por 4 minutos, e posteriormente processado e frito resultou na destruição de 99% da aflatoxina. Labuza (1983) apud Jay (2005) relatou que AFB1 e AFB2 foram reduzidas em sementes milho pela ação do bissulfito de sódio, o qual, tem ação antimicrobiana comparável à do ácido propiônico. Franco e Landgraf (2003) consideram que a circulação de amônia sobre grãos de milho durante o armazenamento pode inativar aflatoxinas, porém, altera a coloração dos grãos. Sekiyama et al. (2006) cita que o uso de adsorventes como carvão ativado, colestiramina, aluminossilicato de cálcio e sódio hidratado, glucomanano, entre na outros, podem ser eficientes quando administrados junto com ração animal, porém o inconveniente desse método é o fato de ocorrer também, a adsorção de nutrientes do alimento. Segundo Molin e Valentini (1999), programas propondo melhoramento genético iniciados ainda na década de 80, principalmente na cultura do milho, mostrou existir suficiente variabilidade genética que permite a seleção de plantas tolerantes a fungos. Desde então, várias linhagens de sementes modificadas geneticamente vêm surgindo apresentando genótipos resistentes devido a diferenças nos perfis protéicos. Asis et al., (2005) apud Kwiatkowski e Alves (2007) relatou que pesquisadores da Universidade Nacional de Córdoba na Argentina, constataram que podem ser desenvolvidos genótipos de amendoim com moderada resistência a contaminação por Aspergillus SP 2.5 Biotransformação das aflatoxinas Após a ingestão, a aflatoxina B 1 é biotransformada por enzimas, dando origem a um produto reativo, o 8-9-epóxido, que pode se ligar tanto ao DNA quanto à

28 28 albumina sérica formando adutos de aflatoxina-n 7 -guanina e aflatoxina-n 7 -lisina, respectivamente, sendo que as ligações covalentes dos adutos no DNA um passo crítico na hepatocarcinogênese das aflatoxinas. (Kwiatkowski e Alves, 2007). Na Figura 3 é apresentada à estrutura química da B 1 e dos possíveis produtos ((a), (b), (c), (d), (e)) após biotransformação desta toxina, por meio de: a) ataque redutivo ou hidratação da dupla ligação do éter vinílico; b) abertura da estrutura bi-furanóide; c) fissão hidrolítica da lactona cumarínica; d) redução da ciclopentana; e) hidroxilação. Figura 3 Biotransformação da aflatoxina B 1 Fonte: Sabino, A aflatoxina B 1 pode formar um derivado, a toxina M 1, substituindo o ligante hidreto por um grupamento hidroxila. A aflatoxina B 2, também pode formar um derivado, neste caso, a toxina M 2, substituindo-se o ligante hidreto por um grupamento hidroxila, conforme representa a figura 4:

29 29 Figura 4 Aflatoxina B 2 Fonte: Sabino, Toxicidade A toxicidade das micotoxinas esta relacionadacom os níveis da toxina ingerida. Para Gompertz et al. (2002), os tipos básicos de toxicidade podem ser verificados: aguda, crônica mutagênica e teratogênica. Efeitos agudos podem deteriorar as funções hepáticas e renais, fatal em alguns casos. Já entre os efeitos crônicos esta a indução ao câncer de fígado. Segundo Franco e Landgraf (2003), além da atividade aguda em diversos animais, pequenas quantidades são suficientes para causar danos hepáticos e hemorragias no trato gastrointestinal e na cavidade peritoneal. Freire et al. (2007, p.13), As aflatoxinas têm propriedades oncogênicas e imunosupressivas, induzindo infecções em pessoas contaminadas com essas substâncias. Cita que a toxina por possuir capacidade de se ligarem ao DNA das células afetam a síntese protéica contribuindo para formação de aplasia tímica, que é a ausência congênita do timo e das paratireóides o que causa queda na imunidade celular conhecida como síndrome de Di George. Machinski Junior (2011) relatou que as aflatoxinas são moléculas lipofílicas de baixo peso molecular podendo ser facilmente absorvidas no intestino delgado, principalmente na região do duodeno, seguindo posteriormente para o fígado por meio de suplemento sangüíneo, onde são concentradas devido à alta permeabilidade da membrana hepática a essa toxina e ao processo de biotransformação das células hepáticas.

30 30 Tabela 6 Toxicidade da algumas aflatoxinas Aflatoxina LD 50 mg/kg peso vivo M1 (alguns animais principalmente vacas) 0,320 B1 0,364 G1 0,784 M2 (em alguns animais, principalmente vacas) 1,228 Fonte: Adaptado de Antón;Lizaso, M2 1,696 G2 3,450 Doll e Peto (1981) apud Caldas et al. (2002) estimou que 35% dos casos de câncer humano estejam diretamente relacionados à dieta e à presença de aflatoxinas em alimentos um fator importante para produção de câncer hepático. Gompertz et al. (2002), relatou que à aflatoxina B 1 é o composto com maior atividade carcinogênica conhecida, não sendo desprezível sua atividade mutagênica. Machinski Junior (2011) relata que a Organização Mundial da Saúde recomenda um controle sistemático dos níveis de aflatoxinas na dieta de populações de regiões tropicais e subtropicais por terem alta prevalência de aflatoxinas nos alimentos e rações dessas regiões. 2.7 Detecção das aflatoxinas Machinski Junior (2011) cita que os níveis de aflatoxina nos produtos contaminados por micotoxinas só podem ser observados pelo emprego de metodologia analítica adequada, pois, somente assim, a fiscalização, o controle da qualidade, as pesquisas e estudos epidemiológicos, estudo da produção e do metabolismo dos fungos toxigênicos, entre outros, são possíveis de serem observados e servem para justificar a finalidade das análises. É bastante difícil detectar a presença de aflatoxinas em grãos uma vez que a contaminação é extremamente heterogênea. Conforme Sabino (2008), em um lote de grãos, apenas 0,5% podem estar contaminados e alguns deles, contaminados

31 31 com altos teores de aflatoxinas. Neste contexto, o erro devido a amostragem pode ser grande. Grãos de amendoim podem conter até ng/g de aflatoxinas e grãos de milho até ng/g. Estes extremos de concentração de aflatoxinas em unidades individuais do produto explicam a grande variabilidade nos resultados de um lote em particular e a extensão do erro na amostragem. Gonçalez et al. (2001), também, Amaral e Machinski Junior (2006), citam vários métodos que podem ser utilizados para detecção e/ou quantificação de micotoxinas. Entre eles, estão os métodos cromatográficos: cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e cromatografia gasosa (CG), além dos Métodos de Imunoensaios de Injeção sequencial (SIIA), imunoenzimático (ELISA) ou com uso de Biossensores de Imunoafinidade. Dentre os métodos adotados, o de cromatografia em camada delgada ainda é muito empregada na análise e quantificação de aflatoxinas, por ser uma técnica de referência para a maioria dos laboratórios brasileiros, não necessitar de equipamentos onerosos e ser confiável. (AMARAL; MACHINSKI JUNIOR, 2006). 2.8 Controle de qualidade de ensaios analíticos O controle e a manutenção da qualidade nos ensaios analíticos merecem cuidados especiais, principalmente, por interferir na confiabilidade analítica com que este laboratório trabalha. Ações práticas sugerem algumas medidas, dentre elas, a calibração do equipamento e da vidraria e a participação do laboratório em ensaios de proficiência. (ALBANO; RAYA-RODRIGUEZ, 2009) Calibrações de vidrarias e equipamentos A calibração das vidrarias e de equipamentos eletrônicos utilizados nos métodos analíticos são componentes fundamentais na qualidade final dos resultados expressos por eles. Esses instrumentos sofrem desgastes ao longo do tempo aumentando o risco de variação dos resultados podendo comprometer a qualidade das mesmas. As calibrações se fazem necessárias periodicamente a fim de que estes equipamentos sejam revalidados e possam operar dentro da confiabilidade analítica.

32 32 A calibração pode ser interna e externa. Calibrações internas são procedimentos que fazem parte dos controles internos do laboratório e são registrados em Formulário de Registro (FR) específicos. As calibrações externas são realizadas por empresas especialmente contratadas para este fim. Para laboratórios acreditados é necessário que a empresa contratada tenha credenciamento por órgão certificado, por exemplo, a Rede Brasileira de Metrologia (RBC) Ensaio de proficiência Uma das formas de avaliar a qualidade dos ensaios analíticos realizados pelo laboratório é através da participação nos ensaios de proficiência (ALBANO; RAYA- RODRIGUES, 2009). Nestes, um laboratório provedor envia amostras previamente contaminadas e quantificadas aos participantes do programa e estes realizam as análises determinando e quantificando os níveis de toxinas encontrados de acordo com a metodologia adotada em cada laboratório, que tem por objetivo obter resultados satisfatórios em relação ao valor alvo estipulado e dentro do intervalo de confiança estabelecido pelo laboratório provedor da comparação. As metodologias empregadas para avaliação dos resultados dos ensaios de proficiência são, normalmente, o Gráfico de Youden ou Z-score. Segundo Albano e Raya-Rodriguez (2009), a metodologia de Youden parte da análise de duas soluções de igual natureza e concentrações próximas, obtendo-se pares de resultados (x,y) que são então trabalhados estatisticamente e representados por um gráfico com a identificação do laboratório participante. A avaliação leva em conta a posição de cada par de resultados em relação ao ponto de intersecção da média de X e da média de Y e em qual quadrante se posiciona. Duas linhas médias dividem o gráfico em quatro quadrantes e em situação ideal ocorre distribuição igualitária em todos eles. Os pontos situados no 1º e no 3º quadrante representam tendência de resultados baixos ou altos para ambas as soluções, caracterizando erros sistemáticos. Pontos no 2º e 4º quadrante indicam a ocorrência de erros aleatórios, refletindo disparidade no desempenho do laboratório. Na metodologia Z-score, os resultados das amostras X e Y são analisados separadamente e calcula-se o Z-score pela Equação 1: Z= (a b) / s (1)

33 33 Onde: a = valor obtido no ensaio do laboratório b = estimativa do valor real s = desvio padrão O desempenho de cada laboratório participante do programa é avaliado a partir da estimativa do valor real através de consenso e da análise estatística dos resultados enviados por todos os participantes. A análise do Z-score segue a seguinte relação: Satisfatório: quando IzI 2 Questionável: quando 2 <IzI< 3 Insatisfatório: quando IzI Padrões de aflatoxinas As soluções dos padrões de aflatoxinas, utilizados tanto nos programas de ensaios de proficiência quanto na validação de sua metodologia, normalmente, têm sua apresentação na forma concentrada, necessitando que sejam diluídos para atender a faixa de trabalho. É importante observar que estes padrões, sempre que possível, não sejam adquiridos na forma de cristais, pois, oferece maior risco a saúde durante seu manejo por se dispersarem facilmente na área do laboratório. A concentração das soluções de trabalho dos padrões de aflatoxina é primordial para a correta quantificação. A necessidade de obtenção de valores inequívocos para as soluções de trabalho dos padrões começa pela adoção de medidas seguras, desde sua aquisição através de fornecedores credenciados, cuidados na conservação e durante a sua manipulação. O uso de vidrarias e equipamentos calibrados, o uso de solventes de boa qualidade nas diluições e adequado manejo técnico, também são importantes neste processo, onde as soluções de trabalho servem de referência e delas dependem todas as quantificações de amostras, como por exemplo, na técnica de cromatografia em camada delgada.

34 Cuidados com padrões de aflatoxinas Os cuidados com padrões iniciam-se pela identificação e escolha do bom fornecedor, idôneo e que possa atender aos requisitos da qualidade, preço e prazo de entrega. Ao chegarem ao laboratório, devem ter suas condições de integridade analisadas, como: embalagem, rótulo, aparência da solução, e as informações contidas no certificado de análise conferidas, para somente então, proceder à entrada do material registrando-o em livro de registro próprio. O certificado de análise, trás informações importantes, dentre elas, a concentração, a pureza, validade e orientações de manejo, contribuindo para qualidade e rastreabilidade do produto. A conservação dos padrões no laboratório deve ser feita estocando-os em freezer com temperaturas iguais ou inferiores a -20 C, acondicionados após fracionamento e diluição, em frasco âmbar, vedado e ao abrigo da luz, para evitar sua degradação. O freezer deve ser exclusivo não sendo estocados outros materiais além de padrões primários e soluções de trabalho dos padrões. O acesso deve ser restrito e controlado, por exemplo, através de fechadura codificada. O controle da temperatura do freezer deve ser feito diariamente, sendo registrado em Formulário de Registro (FR) específico, observando-se faixa de tolerância, cabendo ação corretiva ao sinal de problemas que possam por em risco a conservação dos padrões. A manipulação dos padrões e das soluções de trabalho requerem cuidados, não só na sua preservação, mas também, no manejo feito pelo laboratorista, visto serem substâncias potencialmente cancerígenas. Devem ser retirados do freezer uma hora antes de seu uso e mantidos na capela de exaustão em temperatura ambiente. É imprescindível o uso de luvas e máscara contra vapores tóxicos durante sua manipulação. Após o uso, a descontaminação dos equipamentos e da vidraria é feita com solução de hipoclorito de sódio, a lavagem e, por fim, passagem de acetona P.A. nas mesmas. Antes de iniciar a descontaminação os frascos contendo padrões de aflatoxinas devem ser devolvidos ao freezer para evitar que estes sofram inativação dos componentes.

35 Determinação da concentração das soluções de trabalho dos padrões A concentração das soluções de trabalho do padrão de aflatoxinas pode ser feita por medição em triplicata, com uso do espectrofotômetro. Neste equipamento, faz-se incidir um feixe luminoso de comprimento de onda selecionado através de uma solução do branco (cubeta 1) e outro feixe sobre a solução do padrão em aferição (cubeta 2). A partir da diferença entre a leitura da absorbância do branco e da solução do padrão é feito o cálculo para determinar a concentração da solução de trabalho deste padrão, aplicando-se a lei de Lambert-Beer, conforme Equação 2: A = ε.b.c (2) Inicialmente, o equipamento passa por uma rápida calibração, da qual, é obtido o fator de correção (FC) do equipamento. O FC representa o desvio do equipamento, é obtido através de medições seriadas de uma solução de dicromato de potássio de diferentes concentrações em um determinado comprimento de onda. O branco é feito com solução de ácido sulfúrico (H 2 SO 4 ) 0,009 mol/l, com o qual, o equipamento é zerado. As soluções de dicromato de potássio são preparadas em três concentrações diferentes. As soluções A, B e C, são diluídas com ácido sulfúrico até possuem, respectivamente, 0,265 mol/l, 0,133 mol/l e 0,066 mol/l. A leitura em triplicata das absorbâncias para as soluções A, B e C, e o posterior cálculo da média das absorbâncias foi aplicado na Equação 3 abaixo, da qual, obteve-se a absortividade molar nas três concentrações. ε = [A x 1000] / C (3) Onde: ε é absortividade molar; A é absorbância; C é concentração da solução em mol/l.

36 36 Solução Quadro 2 Absorbância das soluções Concentração de K 2 Cr 2 O 7 (mol/l) Absorbância (média) esperada A 0,265 0,84 B 0,133 0,41 0,42 C 0,066 0,21 Fonte: Procedimento Operacional Padronizado, IPB-LACEN/RS, Com os valores da absortividade ε A (absortividade da solução A), ε B (absortividade da solução B) e ε C (absortividade da solução C) foi calculado a absortividade molar média, através da Equação4, ilustrada abaixo: = [ε A + ε B + ε C ] / 3 (4) O fator de correção do espectrofotômetro (FC) foi calculado aplicando-se a Equação 5 abaixo: FC = 3160 / (5) O valor de FC esperado na calibração do espectrofotômetro deve estar dentro da faixa situada entre 0,95 e 1,05 para ser considerado calibrado. Nos casos em que FC se encontrar fora da faixa o procedimento deve ser repetido e, caso persistirem os erros, o equipamento deve ser caracterizado como descalibrado e não apto para determinação da concentração das soluções de trabalho dos padrões. Após calculado valor do FC do espectrofotômetro e estando o mesmo dentro da faixa válida, pode-se então iniciar a quantificação das soluções de trabalho. No Laboratório de Micotoxinas do IPB-LACEN/RS, adotou-se concentrações situadas: 0,8 a 1,0 µg/ml para AFB1, AFG1 e 0,2 a 0,5 µg/ml para AFB2 e AFG2. Para obtenção das faixas acima descritas, o padrão puro pode ser diluído em acetonitrila HPLC até atender a faixa estipulada. A confirmação da concentração é feita através da leitura em triplicata de cada um dos padrões de aflatoxina no espectrofotômetro com aplicação da Equação 5 abaixo: [C] µg/ml = A x FC x MM x 1000 / ε (5)

37 37 Onde: [C] = Concentração em µg/ml; A = Absorbância; FC = Fator de correção do espectrofotômetro; MM = Massa molecular da micotoxina; ε = Absortividade molar da micotoxina. Quadro 3 Valores de absortividade molar (ε) das flatoxinas em Micotoxinas acetonitrila em 350 nm Absortividade molar (cm -1.mol -1.L) Massa molecular (g/mol) Aflatoxina B Aflatoxina B Aflatoxina G Aflatoxina G Fonte: Adaptado do Procedimento Operacional Padronizado, IPB-LACEN/RS, O controle e a verificação da concentração das soluções de trabalho pode ser feito mediante medição trimestral das concentrações através do espectrofotômetro, como descrito acima. Os dados são transcritos para um formulário de registro e geram uma Carta Controle. A carta controle serve para acompanhar o desempenho das soluções de trabalho dos padrões ao longo do tempo. Um dos principais parâmetros observados no processo é a absortividade molar (ε). A análise crítica da carta controle, objetiva principalmente, identificar queda na qualidade dos padrões devido a manipulação constante, degradação ao longo do tempo, contaminação, inativação, entre outros processos que prejudiquem a qualidade das soluções de referência. A Figura 5, mostra o gráfico gerado por uma carta controle:

38 38 Figura 5 Carta Controle Carta de Controle ε Dias Fonte: do Procedimento Operacional Padronizado, IPB-LACEN/RS, Legislaçãosobre micotoxinas No Brasil, a Resolução da Diretoria Colegiada, RDC n. 7, de 18 de Fevereiro de 2011, dispõe sobre os Limites Máximos Tolerados (LMT) para micotoxinas em alimentos, que são apresentados no Quadro 4:

39 Quadro 4 Limite máximo tolerado (LMT) das aflatoxinas para alguns alimentos 39 Micotoxina Aflatoxina B1 - B2 - G1 - G2 Aflatoxina B1 - B2 - G1 - G2 Aflatoxina B1 - B2 - G1 - G2 Alimento - Alimentos À base de cereais para alimentação infantil (lactentes, crianças na primeira infância) - Cereais e produtos de cereais, inclui cevada malteada. - Feijão - Produtos de cacau e chocolate - Castanhas, inclui nozes, pistachios, avelã e amêndoas; - Frutas desidratadas e secas; - Castanha-do-Brasil sem casca para consumo direto; - Amêndoas de cacau; - Castanha-do-Brasil sem casca para processamento posterior; - Castanha-do-Brasil com casca para consumo direto; - Especiarias: pimenta, canela, nozmoscada, gengibre, outros - Amendoim com casca, sem casca, cru, torrado, em pasta ou manteiga; - Milho, milho em grãos (partido, inteiro, amassado, moído), farinhas ou sêmolas de milho. Limite Máximo Tolerado (µg/kg) 1,0 5,0 10,0 15,0 20,0 Fonte: Adaptado da Resolução de Diretoria Colegiada, Fiscalização Os principais órgãos fiscalizadores de micotoxinas no Brasil referenciam o Ministério da Agricultura através da Secretaria de Defesa Agropecuária, o Ministério da Saúde pela Divisão de Alimentos, DETEN/SVS, e a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).

40 40 3 PARTE EXPERIMENTAL Muitas pesquisas foram realizadas após a descoberta, na década de 60, e ainda são realizadas, seja para identificar os níveis de contaminação ou desenvolver métodos de análise mais precisos, rápidos e viáveis em termos de custos e menor impacto ambiental. 3.1 Metodologia analítica Este Trabalho de Conclusão de Curso foi desenvolvido no Laboratório de Micotoxinas que adotou o método de extração e quantificação das aflatoxinas seguindo a Official Methods of Analysis (2005), 18 th Ed. AOAC Association of Official Analytical Chemists, Chapter 49, Method , , , por se tratar de uma metodologia analítica oficial, de fácil execução, não envolvendo grandes equipamentos, oferecendo resultados analíticos confiáveis. 3.2 Materiais e equipamentos Espectrofotômetro UV/VIS Jasco-7800; Cubetas de quartzo (percurso óptico de 1cm); Gabinete de visualização ou Cromatovisor Camag; Capela de exaustão química Quimis; Balança semi-analítica Ohaus-Scout; Liquidificador industrial Turbo A; Ultra-som Unique-1600; Estufa Biopar S22; Refrigerador Prosdócimo; Freezer Consul; Cilindro de gás nitrogênio White Martins, pureza 99,5%; Banho Maria Biopar, (50 C); Béquer de 50, 100, 250 e 600 ml; Balão volumétrico de 1000 ml; Proveta volumétrica de 50, 250 e 500 ml; Bastão de vidro;

41 41 Funil de vidro; Papel filtro Whatman, nº 4; Funil de separação de 500 ml; Microseringa de 10 µl; Micropipetador de 200 e 500 µl; Cuba cromatográfica com tampa (1000 ml); Pipeta volumétrica de 5 e 10 ml; Pipeta graduada de 0,2 ml; Espátula de metal; Cromatofolha 20x20 cm com sílica gel 60G sem indicador fluorescente; Tubos de ensaio; Suporte para tubo de ensaio; Frasco de vidro para amostra. 3.3 Reagentes Metanol p.a., marca Vetec; Clorofórmio grau HPLC, marca Vetec; Celite 545 p.a., marca Merck; Cloreto de potássio p.a., marca Vetec; Sulfato de cobre anidro p.a., marca Vetec; Sulfato de Amônio p.a. marca Dinâmica; Éter Etílico p.a., marca Dinâmica; Solução aquosa de H 2 SO 4 ; Ácido Trifloroacético p.a. (TFA), marca Vetec; Tolueno p.a., marca nuclear; Acetonitrila p.a., marca J. T. Backer; Ácido Acético Glacial p.a., marca Vetec; Hipoclorito de Sódio 5% p.a., marca Vetec; Acetona p.a., marca Vetec; Hexano p.a., marca J. T. Backer.

42 Descrição do método As aflatoxinas foram extraídas das amostras com solução de metanol/cloreto de potássio a 4%, passando posteriormente por uma etapa de limpeza com uso de agentes clarificantes como, solução de sulfato de cobre a 10%, para matrizes de amendoim e derivados, nozes ou, solução de sulfato de amônio a 30%, para matrizes como cereais e grãos. A extração de gordura para amostras de amendoim e derivados foi feito com hexano em funil de separação. A separação das aflatoxinas em solução é feita com clorofórmio por partição líquido-líquido da qual uma alíquota é secada com gás Nitrogênio (N 2 ) e ressuspensa com mistura de tolueno:acetonitrila (98:2mL) com posterior aplicação na cromatofolha. A quantificação das aflatoxinas foi realizada com auxílio de luz ultravioleta em 366 nm, através da observação da intensidade das manchas da amostra comparando-as com as do padrão. O fluxograma a seguir, representado na figura 6, mostra as etapas do processo de extração das aflatoxinas até a etapa de Cromatografia em Camada Delgada (CCD).

43 43 Figura 6 Etapas da extração das aflatoxinas 50 g da amostra 150 ml Filtrado ml Metanol + 30 ml KCl 4% liquidificador por 5 min filtrar ml CuSO 4 ou (NH 4 ) 2 SO cm 3 celite agitar e filtrar 150 ml Filtrado Funil de Separação ml H 2 O + 10 ml clorofórmio agitação por 3 min Funil de separação + 10 ml clorofórmio 10 ml fase orgânica (Recolhe extrato l) 10 ml fase orgânica (+ extrato ll) Recolhe Concentra até secura Ressuspende em tolueno:acetonitrila CCD Fonte: Autoria própria, 2011.

44 Amostrageme extração A amostragem é iniciada através da trituração de aproximadamente 2 kg de amostras de amendoim, milho, castanha-do-pará ou arroz, em liquidificador de aço inox. Homogeneizou-se o produto obtido e procedeu-se o quarteamento. Após, pesou-se 50g da amostra para um béquer de 250 ml e realizou-se a extração. Nesta etapa, o objetivo foi separar o analito de interesse da matriz. Para favorecer o contato entre o substrato sólido e o solvente, triturou-se em liquidificador industrial a amostra preparada no procedimento anterior com 270 ml de metanol e 30 ml de solução aquosa de Cloreto de potássio a 4 %. Agitou-se por cinco minutos em velocidade baixa e após, filtrou-se à amostra em papel filtro Whatman número quatro através de funil simples recolhendo-se os primeiros 150 ml em uma proveta graduada Purificação Essa etapa foi realizada devido a freqüente presença de contaminantes, por exemplo, glicose e corantes, na amostra. Para tanto, procedeu-se da seguinte forma: transferiu-se o filtrado para um béquer de 600 ml, adicionou-se 150 ml de agente clarificante, neste caso, uma solução aquosa de sulfato de cobre (CuSO 4 10%) para amostras de amendoim e derivados, castanhas e 50 cm³ de celite 545. Para amostras de milho e arroz, adicionou-se 150 ml de sulfato de amônio ((NH 4 ) 2 SO 4 a 30%). Homogeneizou-se a mistura com bastão de vidro e fez-se a filtração em papel filtro Whatman Nº 4, através de funil simples e recolhendo-se, novamente, os primeiros 150 ml em proveta Partição líquido-líquido Transferiu-se o filtrado para um funil de separação de 1000 ml. Para amostras gordurosas, como amendoim e derivados, adicionou-se 40 ml de hexano para extração da gordura, a qual, pode interferir na visualização dos pontos na etapa de quantificação. Agitou-se manualmente por 3 minutos e após a separação das fases, desprezou-se a fase orgânica retornando a amostra para o funil de separação.

45 45 Adicionou-se 150 ml de água ultra pura e 10 ml de clorofórmio grau HPLC. Agitou-se durante cinco minutos, cuidando para a amostra não emulsionar. Os gases desprendidos devido à agitação do funil foram liberados várias vezes durante o procedimento. Após a agitação, deixou-se em repouso por 10 minutos para a separação das fases. Foi retirada a fração inferior da solução do funil (fase orgânica). Esta foi então armazenada em um béquer de 50 ml, identificado como Extrato I. Adicionou-se uma segunda alíquota de 10 ml de clorofórmio e procedeu-se uma segunda extração, como descrito acima, recolhendo a fração e juntando-a com a primeira (Extrato II) Concentração e ressuspensão Retirou-se uma alíquota de 10 ml do Extrato II com auxílio de uma pipeta volumétrica, transferindo para um tubo de ensaio graduado de 15 ml. Concentrouse a amostra em banho maria na temperatura de 50 C até secura sob corrente de gás nitrogênio. Redissolveu-se o extrato com 200 µl de solução de tolueno:acetonitrila (98:2mL) para amostras de amendoim e derivados e arroz. Para os cereais e derivados a redissolução é feita com 500 µl da solução tolueno:acetonitrila (98:2mL). Agita-se por aproximadamente 1 minutos, para garantir a completa solubilização do extrato Determinação e quantificação das aflatoxinas A determinação e quantificação das aflatoxinas por cromatografia em camada Delgada foi feito através da comparação visual da amostra ressuspensa com os padrões, ambos aplicados na mesma cromatofolha de sílica gel 60G sem indicador de fluorescência. Inicialmente, ativou-se a cromatofolha com aquecimento em estufa a 110 ºC por 30 min. Delimitou-se a migração das frentes pelos solventes na cromatofolha. As delimitações da cromatofolha foram feitas a lápis, onde AM é o ponto de aplicação da amostra e P, ponto para aplicação do padrão, como mostra a Figura 7:

46 46 Figura 7 Delimitações da cromatofolha Fonte: Instrução de Trabalho, IPB-LACEN/RS, Os padrões foram retirados do freezer e deixados à temperatura ambiente em capela de exaustão por 1h e, quando ambientados foram aplicados na cromatofolha, conforme delimitações mostradas acima. Aplicou-se 5 µl dos padrões B 1, B 2, G 1 e G 2 com o auxílio de microseringa na cromatofolha. Em seguida, na mesma cromatofolha, aplicou-se 5 µl de cada uma das amostras extraídas. Esta placa serviu como primeira verificação da contaminação por aflatoxinas. Na cuba cromatográfica foi feita a eluição das amostras e dos padrões. Foi utilizado como solvente de eluição (corridas) uma mistura de clorofórmio p.a, éteretílico p.a, e ácido acético glacial p.a (85mL:15mL:5mL), preparados diretamente na cuba. Papel filtro foi colocado para forrar o interior da cuba. O papel filtro fica embebido na solução e tem a função de melhorar a saturação do ambiente interno. A cuba deve permanecer em repouso nestas condições, por cerca de uma hora, antes de se colocar a cromatofolha e dar início à eluição. Após a aplicação dos volumes descritos a cima na cromatofolha, foi colocada na cuba em posição vertical onde, a parte inferior fica em contato com a solução eluente. A corrida cromatográfica dura em torno de 30 a 40 minutos, conforme demarcação na parte superior da placa e supervisão do analista. Após, a cromatofolha é retirada da cuba e colocada em capela de exaustão para evaporação dos solventes, por cerca de 10 minutos.

47 47 A placa foi então avaliada sob luz ultravioleta no comprimento de onda de 366 nm, em gabinete de visualização. Para amostras contaminadas com aflatoxinas foi realizada a quantificação. Por isso, foi necessário preparar uma nova placa com mais pontos de padrão e da amostra, neste caso, preparou-se uma nova cromatofolha de sílica gel e os volumes injetados foram: 2 µl, 5 µl, 7 µl, 10 µl, da amostra contaminada e 1 µl, 2 µl, 5 µl, 7 µl, apenas dos padrões a serem usados na quantificação. Através da Figura 8, observa-se que a fluorescência azul representa a aflatoxina B 1 e B 2, e a fluorescência verde, as aflatoxinas G 1 e G 2, do padrão na placa de camada delgada submetida a luz ultra-violeta. Figura 8 Placa de camada delgada com amostra de castanha-do-pará sob luz UV (comprimento de onda de 366 nm) B 1 B 2 A G 1 G 2 Fonte: Autoria própria, Na placa da Figura 8, foi aplicado uma amostra de castanha-do-pará na parte central da cromatofolha. Os dois pontos luminosos à esquerda são respectivamente os padrões de aflatoxina B1 e B2 e tem coloração azul. À direita, temos os pontos G1 e G2 do padrão de aflatoxina, de coloração verde. Observou-se, nesta análise, à ausência de contaminação por aflatoxinas na amostra.