MPB0312 CARACTERIZAÇÃO DA MICROBIOTA DE CITOLOGIAS ESFOLIATIVAS DE UM MUNICÍPIO DO LITORAL NORTE PAULISTA

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1 XVII Encontro de Iniciação Científica XIII Mostra de Pós-graduação VII Seminário de Extensão IV Seminário de Docência Universitária 16 a 2 de outubro de 212 INCLUSÃO VERDE: Ciência, Tecnologia e Inovação para o Desenvolvimento Sustentável MPB312 CARACTERIZAÇÃO DA MICROBIOTA DE CITOLOGIAS ESFOLIATIVAS DE UM MUNICÍPIO DO LITORAL NORTE PAULISTA TATIANE BARBOSA MACHADO ELIANA DE AVELLAR MARIA CECÍLIA BARBOSA DE TOLEDO ANA CRISTINA GOBBO CÉSAR tatypmj@yahoo.com.br ESPEC ANÁLISES CLÍNICAS DOENÇAS INFECCIOSAS UNIVERSIDADE DE TAUBATÉ ORIENTADOR(A) ANA CRISTINA GOBBO CESAR UNIVERSIDADE DE TAUBATÉ

2 CARACTERIZAÇÃO DA MICROBIOTA DE CITOLOGIAS ESFOLIATIVAS DE UM MUNICÍPIO DO LITORAL NORTE PAULISTA 1 Tatiane Barbosa Machado 2 Eliana de Avellar 3 Maria Cecília Barbosa de Toledo 4 Ana Cristina Gobbo César 5 Resumo A microflora vaginal representa um dos mais importantes mecanismos de defesa da função reprodutora, mantendo o meio saudável e impedindo a proliferação de microorganismos estranhos à mesma. O presente estudo teve como objetivo caracterizar a microbiota vaginal no município de Ubatuba, SP. As informações sobre os microorganismos Lactobacilos sp (bacilos de Dodërlein), cocos, bacilos, Gardnerella vaginalis, Candida sp, Trichomonas vaginalis, Actinomices sp, Chlamydia trachomatis e alterações celulares sugestivas da presença do vírus Herpes foram obtidas a partir de exames de Papanicolaou realizados de janeiro de a dezembro de. Foram consideradas apenas as amostras satisfatórias. Para cada ano foram calculados a média e o desvio-padrão de cada variável analisada, aplicando o teste ANOVA one-way p<,1. Para identificar a evolução das alterações ao longo do período avaliado foi realizada a regressão linear (p<,5); ambos os testes estão disponíveis no GraphPad Prisma 5.1. A comparação da incidência dos micro-organismos observados, nos anos avaliados, demonstrou valores significativamente diferentes para Lactobacilos sp, cocos, bacilos, Candida sp, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis e Gardnerella vaginalis apresentando, respectivamente, F=6,56 (p<,1); F=16,5 (p<,1); F=29,52 (p<,1); F=8, (p<,1); F=26,76 (p<,1); F=6,96 (p<,1) e F=15,75 (p<,1). Os resultados da regressão linear demonstraram um decréscimo nos casos de inflamação (r 2 =,83; p=,6), cocos (r 2 =,85; p=,3), bacilos (r 2 =,81; p=,8), Chlamydia trachomatis (r 2 =,82; p=,8), Trichomonas vaginalis (r 2 =,63; p=,12) e Gardnerella vaginalis (r 2 =,44; p=,486) no período estudado. Conclui-se que a presença constante de lactobacilos nos esfregaços avaliados, manteve o ph ácido, impedindo e/ou dificultando o estabelecimento de processos inflamatórios causados por outros micro-organismos. Palavras-chave: Papanicolaou; Microbiota; Citologia; Esfregaço. CHARACTERIZATION MICROBIOTA EXFOLIATIVE CYTOLOGY OF A CITY NORTHERN COAST PAULISTA 1 MPG Mostra de Pós-Graduação 2 Pós-graduanda (especialização lato sensu) em Análises Clínicas UNITAU, tatypmj@yahoo.com.br 3 Médica e proprietária do LABCIT, Ubatuba (SP) 4 IBB-UNITAU, mceciliabt@gmail.com 5 IBB-UNITAU e IFSP-Campus Bragança Paulista, acgobbo@terra.com.br

3 1 INTRODUÇÃO A microflora vaginal representa um dos mais importantes mecanismos de defesa da função reprodutora, mantendo o meio saudável e impedindo a proliferação de microorganismos estranhos à mesma (LINHARES, GIRALDO, BARACAT, ). Contudo, os processos infecciosos na vagina devidos a micro-organismos são muito comuns. As vulvovaginites são, em grande parte, causadas por protozoários, leveduras, bactérias e/ou vírus. A secreção vaginal é uma resposta fisiológica do organismo feminino e quando não existe processo patológico envolvido, apresenta-se de cor clara ou branca, sendo composta de líquidos cervicais, variando na quantidade e no aspecto, dependendo do período do ciclo menstrual (ZIMMERMMANN et al., ). O mecanismo fisiológico de defesa do trato genital feminino mais importante contra as vaginites é a microbiota láctica, caracterizada pela presença de lactobacilos (bacilos de Dodërlein), que constituem um grupo heterogêneo de bactérias encontradas nas secreções cérvicovaginais e, na sua maioria, correspondem a Lactobacillus acidophilus. Os lactobacilos são predominantes no meio vaginal, determinando ph ácido (3,8 a 4,5), o que inibe o crescimento de várias outras bactérias potencialmente nocivas à mucosa vaginal. Além disso, o fluido vaginal tem atividade seletiva antimicrobiana contra espécies bacterianas não residentes (CARVALHO, ; ZIMMERMMANN et al., ). Durante o período reprodutivo, há grande aporte de glicogênio nas células epiteliais da vagina, estimuladas pela presença de estrógenos. Este glicogênio é metabolizado pelos lactobacilos para formação de ácido láctico, o qual inibe o crescimento de outras espécies bacterianas, principalmente patogênicas e constitui o principal mecanismo de defesa local (REDDY et al., ). Dentre as principais causas de processos inflamatórios e/ou infecciosos na vagina estão a vaginose bacteriana, candidíases e tricomoníases, representando cerca de 9% das desordens de origem infecciosa no trato genital feminino (ADAD et al., 21). Estes três micro-organismos apresentam prevalência de 22%, 9% e 2%, respectivamente, em mulheres de 15 a 49 anos de idade atendidas em um programa de saúde da família. A prevalência de vaginites é, em média, de 24%, porém este dado pode variar conforme a população estudada (BARCELOS, ). A vaginose bacteriana é considerada atualmente a infecção vaginal de maior prevalência em mulheres em idade reprodutiva. Essa síndrome polimicrobiana pode ser definida como uma alteração da microbiota vaginal normal caracterizada pela substituição de lactobacilos normalmente predominantes, por uma flora composta principalmente por bactérias anaeróbias estritas e facultativas como a Gardnerella vaginalis, Prevotella sp, Bacteroides sp, Mobiluncus sp e Peptostreptococcus sp (HILLER et al., 1999). A Gardnerella vaginalis é o agente patogênico central desta condição clínica (WANG, 2), com características morfológicas de cocos-bacilos, curtos, Gramvariáveis, pleomórficos, não capsulados, imóveis e anaeróbicos facultativos (OLIVEIRA et al., ). As características clínicas inerentes ao processo fornecem alguns subsídios para o diagnóstico de vaginose bacteriana, caracterizada por corrimento vaginal brancoacinzentado em pequena quantidade; ph > 4,5; desprendimento de aminas aromáticas com odor semelhante a peixe podre ao adicionar duas gotas de KOH 1% ao conteúdo vaginal; presença ao exame bacterioscópico e citopatológico de clue cells

4 (VARGAS e MANFREDINI, ). Os mecanismos de transmissão da vaginose bacteriana ainda não estão claros. Algumas evidências sugerem a infecção do trato urinário como resultado da colonização vaginal por organismos retais, porém fatores extrínsecos como a alta freqüência de coitos, a utilização do dispositivo intrauterino (DIU), espermicidas, antibióticos de largo espectro e o hábito de usar duchas vaginais têm sido associados ao aumento desta infecção (SANTOS et al., ; GIRALDO et al., ; TANAKA et al., ; OLIVEIRA et al., ; RIBEIRO et al., ). Não é considerada uma doença sexualmente transmissível, uma vez que o tratamento do parceiro não diminui a frequência ou o intervalo das recorrências, mas acomete as mulheres com maior número de parceiros sexuais, sendo rara nas sexualmente inativas (PORTO, 2). A sua estimativa de freqüência varia de 1% a 3%, com ocorrência em jovens com dois ou mais parceiros sexuais nos últimos 3 dias (TANAKA et al., ). Para a mulher é incômodo o fluxo patológico que pode prejudicar sua vida sexual e poderá associar-se a trabalho de parto prematuro, quando identificado em gestantes (GIRALDO, ; McDONALD, BROCK, LEHURST, PARSONS, ; ZIMMERMMANN et al., ; SCHWEBKE, ). A candidíase é o segundo tipo mais comum de vulvovaginite. É uma infecção causada por uma levedura blastoforada (incluindo a Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei e Candida tropicalis) frequentemente encontrada ao nível da vulva, da vagina e mais raramente do colo (VARGAS e MANFREDINI, ). Estimase que 75% das mulheres em idade reprodutiva já tiveram algum episódio de infecção por Candida sp, 4% a 45% destas tiveram recorrência e 1% a 2% apresentaram complicações (BATTAGLIA et al., ). A Candida albicans está presente como microbiota vaginal normal em 15% a 2% das mulhres adultas saudáveis e em 3% a 4% das grávidas (STEBEN, 2). Nos Estados Unidos, a incidência de vaginite micótica dobrou entre 1989 e 199, coincidindo com aumento de 8% no uso de antimicóticos no mesmo período (EYLER, PIERSON, REED, 1996). Vários fatores podem estar relacionados à infecção por Candida sp (GIRALDO et al., ), pois a transmissão não é exclusivamente sexual. O tratamento com antibióticos e corticosteróides, diabetes mellitus, gestação e imunossupressão são alguns dos fatores de risco para o estabelecimento desta vulvovaginite. Outros fatores apontados na literatura são o uso de anticoncepcionais orais, dispositivo intra-uterino (DIU), sexo oral, alta ingestão de carboidratos e estresse (EHRSTRÖM et al., ), uso de roupas íntimas sintéticas e justas e obesidade (VARGAS e MANFREDINI, ). Os sinais e sintomas mais comuns da candidíase são prurido, ardor, presença de um corrimento esbranquiçado, vulva e vagina edemaciadas e hiperemiadas. Os esfregaços exibem as duas formas assumidas pelos fungos, os esporos e os filamentos. O tratamento consiste de antimicóticos, entretanto, deve-se tentar tratar as causas da candidíase para evitar as recidivas (BRASIL MANUAL DE DST, ). A tricomoníase é uma infecção causada pelo protozoário flagelado Trichomonas vaginalis. Sua principal forma de transmissão é a sexual. O risco de transmissão por ato é de 6% a 8%. Pode permanecer assintomática no homem e, na mulher, principalmente após a menopausa. Na mulher, pode acometer a vulva, a vagina e a cérvice uterina, causando cervicovaginite, caracterizada por corrimento abundante, amarelado ou amarelo esverdeado, bolhoso; prurido e/ou irritação vulvar; dor pélvica; sintomas urinários como disúria e polaciúria; hiperemia da mucosa, com placas avermelhadas; teste de Schiller com aspecto tigroide. O achado deste protozoário em uma citologia oncológica de rotina impõe o tratamento da mulher e também do seu

5 parceiro sexual, já que se trata de uma DST (MACIEL et al., ; BOWDEN e GARNETT, ; BATISTA, ; MICHEL, ). Outros micro-organismos podem ser identificados nos esfregaços cérvicovaginais tais como Actinomices sp e Chlamydia trachomatis, além de alterações celulares sugestivas da presença do vírus Herpes e do Papiloma Vírus Humano (HPV). A técnica de Papanicolaou é usada comumente como teste de triagem para detectar lesões pré-neoplásicas do colo uterino. O sucesso das triagens citológicas para câncer cervical tem feito desta técnica um procedimento de rotina (PINHO e FRANÇA- JUNIOR, ). Em relação ao diagnóstico da vaginite bacteriana, a validade do método de Papanicolaou é controversa e estimula a realização de estudos comparativos com o intuito de definir o seu grau de confiabilidade (HASENACK et al., ). Como uma análise preliminar dos dados coletados, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o microbiota, identificado por meio do exame preventivo de Papanicolaou realizado durante o período de a, no município de Ubatuba, SP. 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Caracterização da amostra As informações sobre os micro-organismos Lactobacilos sp (bacilos de Dodërlein), cocos, bacilos, Gardnerella vaginalis, Candida sp, Trichomonas vaginalis, Actinomices sp, Chlamydia trachomatis, e alterações celulares sugestivas da presença do vírus Herpes foram obtidas a partir de laudos dos exames de Papanicolaou realizados durante o período de janeiro de a dezembro de, cujas as lâminas foram processadas e analisadas no Laboratório de Anatomia Patológica e Citopatologia - LABCIT, localizado no município de Ubatuba, SP. Dos exames de Papanicolau realizados, aproximadamente amostras (43,7%) foram consideradas com qualidade satisfatória, segundo os critérios do sistema de Bethesda (GOMPEL & KOSS, 1997). A idade média das pacientes foi de 34,33±12,9 com idade mínima de 1 anos e máxima de 84 anos. Não foi realizado exame clínico e nem abordagem das pacientes, por tratar-se de um estudo retrospectivo. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da UNITAU, com protocolo n 186/ Método de análise Foram consideradas apenas as amostras satisfatórias, aquelas em que o esfregaço contém células em quantidade representativa, bem distribuídas, fixadas e coradas, de tal modo que sua visualização permita uma conclusão diagnóstica. As amostras foram avaliadas independente da idade e etnia das pacientes. Para cada ano foram calculados a média e o desvio-padrão para o diagnóstico de esfregaço satisfatório, presença de inflamação e dos micro-organismos Lactobacilos sp (bacilos de Dodërlein), cocos, bacilos, Gardnerella vaginalis, Trichomonas vaginalis, Candida sp, Actinomices sp, Chlamydia trachomatis e alterações celulares sugestivas da presença do vírus Herpes aplicando o teste ANOVA one-way p<,1. Para identificar a evolução das alterações estudadas ao longo do período avaliado foi realizada a regressão linear (p<,5); ambos os testes estão disponíveis no software GraphPad Prisma 5.1.

6 3 RESULTADOS As variações detectadas nas diferentes variáveis analisadas, para todos os anos avaliados, podem ser observadas na tabela 1. Tabela 1 Valores de média e desvio-padrão observados em esfregaços satisfatórios, esfregaços com processo inflamatório e de esfregaços com a presença de diferentes micro-organismos observados nas citologias esfoliativas realizadas durante o período de a, no município de Ubatuba, SP. s Diagnósticos Satisfatório 167.± 146.9± 198.2± 239.4± 273.5± 232.3± 196.3± 196.5± ± Inflamação 238.3± ± ± ± ± ± ± ± ± Lactobacilos sp 195.7± ± ± ± ± ± ± ± ± Cocos 64.67± ± ± ± ± ± ± ± ± 1.35 Bacilos 58.83± ± ± ± ± ± ± ± ± 7.34 Candida sp 2.41± ±.88.5±.67.25±.45.41±.9.41±.79.41±.51.41±.66.±. Actinomices sp.±..8±.28.8±.28.16±.38.16±.38.±..±..±..16±.38 Chlamydia trachomatis 36.67± ± ± ± ± ± ± ± ± 7.77 Trichomonas vaginalis.83± ± ±.67.8±.28.33±.49.8±.28.±..±..8±.28 Sug.Vírus Herpes.±..8±.28.±..16±.38.25±.45.8±.28.±..±..±. Gardnerella vaginalis 42.67± ± ± ± ± ± ± ± ± 6.61 A comparação da incidência dos diferentes micro-organismos observados nos exames de citologia esfoliativa, durante os anos avaliados, demonstrou valores significativamente diferentes para Lactobacilos sp (bacilos de Dodërlein), cocos, bacilos, Candida sp, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis e Gardnerella vaginalis apresentando, respectivamente, F=6,56 (p<,1); F=16,5 (p<,1);

7 F=29,52 (p<,1); F=8, (p<,1); F=26,76 (p<,1); F=6,96 (p<,1) e F=15,75 (p<,1). Os valores obtidos para Actinomices sp e para as alterações celulares sugestivas da presença do vírus Herpes, não apresentaram valores significativos (Figura 1). Figura 1 O crescimento médio, desvio-padrão e valores máximos e mínimos dos esfregaços satisfatórios, esfregaços com inflamação e diagnóstico de Lactobacilos sp (bacilos de Dodërlein), bacilos, cocos, Candida sp, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis e Gardnerella vaginalis, durante o período de a, no município de Ubatuba, SP.

8 Satisfatório Inflamação Lactobacilos sp Bacilos Cocos Candida sp Chlamydia trachomatis 2 Trichomonas vaginalis Gardnerella vaginalis

9 Os resultados da regressão linear demonstraram que ocorreu um decréscimo nos casos de inflamação (r 2 =,83; p=,6), cocos (r 2 =,85; p=,3), bacilos (r 2 =,81; p=,8), Chlamydia trachomatis (r 2 =,82; p=,8), Trichomonas vaginalis (r 2 =,63; p=,12) e Gardnerella vaginalis (r 2 =,44; p=,486) nos esfregaços avaliados no período estudado. 4 DISCUSSÃO O equilíbrio do ecossistema vaginal é mantido por complexas interações entre a flora vaginal dita normal, os produtos do metabolismo microbiano, o estado hormonal e a resposta imune do hospedeiro (GIRALDO et al., ). No trato genital feminino, a flora normal da vagina é grandemente influenciada pelos hormônios sexuais como o estrógeno. O aumento nos níveis desse hormônio influenciam o acúmulo de glicogênio nas células que revestem a vagina, colaborando com a acidificação do ph cérvicovaginal. Alterações no ph do trato genital feminino podem levar a inflamação da vagina (TORTORA et al., ). Estes processos inflamatórios podem ser acompanhados por processos infecciosos causados por agentes microbiológicos (RIBEIRO et al., ). No período de a foi possível identificar um declínio nos casos de inflamação cérvico-vaginal causadas por cocos, bacilos, Gardnerela vaginalis, Trichomonas vaginalis e Chlamydia trachomatis. Este resultado é reforçado pela presença constante de lactobacilos, também denominados bacilos de Dodërlein, os micro-organismos responsáveis pela manutenção da acidez do ph cérvico-vaginal. Nos trabalhos desenvolvidos por Lara et al. (1999) e Ribeiro et al. (), as prevalências totais de infecções por Gardnerella vaginalis, Candida sp e Trichomonas vaginalis foram 14,1%, 6,9% e 1,1%, respectivamente. Especificamente no caso de vaginose bacteriana causada por Gardnerella vaginalis, vários autores têm identificado uma prevalência variável de,7% (SILVA FILHO, ) a 48,4% (GUERREIRO et al., 1986), com maioria dos estudos com índices acima de 2% (SALAZAR MORALES et al., 1997; TOLOI, FRANCESCHINI, 1997; ADAD et al., 21; DI BARTOLOMEO et al., 22). De acordo com Vargas e Manfredini (), a infecção por Gardnerella vaginalis foi a mais prevalente entre as pacientes de todas as faixas etárias estudadas, entretanto os autores constataram que a infecção diminuiu progressivamente com o avanço da idade das mulheres. Os valores observados foi 13% para este microorganismo, semelhante ao trabalho realizado no município de Presidente Dutra, estado do Maranhão, onde foi encontrado 13,75% (SILVA et al., ). Estes últimos autores, também identificaram prevalências de 7,74% e 5,31% para Candida sp e Trichomonas vaginalis, respectivamente. Na pesquisa realizada no Parque Indígena do Xingu/Brasil para rastrear o câncer de colo uterino foi encontrado percentuais de 14%, 13% e 1% para os micro-organismos G. vaginalis, T. vaginalis e Candida sp (TABORDA, 2). O fungo Candida sp pode vir a proliferar, quando ocorre a diminuição dos lactobacilos de Dodërlein e alteração de ph vaginal, favorecendo o aparecimento de vulvo-vaginite sendo também importante na etiologia da vaginose bacteriana (SANTOS et al., ). 5 CONCLUSÃO Conclui-se que a manutenção dos níveis de lactobacilos de Dodërlein nos esfregaços avaliados por este estudo, são os responsáveis por manter o ph ácido, de

10 forma a impedir e/ou dificultar o estabelecimento de processos inflamatórios causados por agentes microbiológicos. REFERÊNCIAS ADAD, S.J.; LIMA, R.V.; SAVAN, Z.T.; SILVA, M.L.G.; SOUZA, M.A.H. SALDANHA, J.C.; FALCO, V.L.; CUNHA, A.H.; MURTA, E.F.C. Frequency of Trichomonas vaginalis, Candida sp and Gardnerella vaginalis in cervical-vaginal smears in four different decades. São Paulo Med. J. Revista Paulista de Medicina, v.119, n.6, p. 2-25, 21. BARCELOS, M.R.B. Infecções genitais em mulheres atendidas em Unidade Básica de Saúde: prevalência e fatores de risco. Rev Bras Ginecol Obstet, v.3, p ,. BATISTA, L.A. Trichomoniasis. Rev Panam Infectol, v.7, p ,. BATTAGLIA, F.; MARIANI, L.; ANGLANA, F.; MILLITE, V.; QUATTRINI, M.; PLOTTI, F.; TOMAO, F.; PLOTTI, G. Vuvovaginal candidiasis: a terapeutic appoach. Minerva Ginecol, v.52, n.2, p ,. BOWDEN & GARNETT. Epidemiologia do câncer uterino. Prevalência de infecção do Papilomavírus. Rev Saúde, v.17, p.18-23,. BRASIL. Ministério da Saúde. Manual de DST Infecção pelo papilomavírus humano. Brasília,. Disponível em: Acesso em: 1 jun 212. BROLAZO, E.M.; SIMÕES, J.A.; NADER, M.E.F.; TOMÁS, M.S.J.; GREGORACCI, G.B.; MARCONI, C. Prevalência e caracterização de espéciesde lactobacilos vaginais em mulheres em idade reprodutiva sem vulvovaginites. Rev Bras Ginecol Obstet, v.31, n.4, p ,. CARVALHO, M.G.D. Presença de 2% ou mais de clue cells como um critério diagnóstico de vaginose bacteriana em esfregaços de Papanicolaou. Campinas, SP,. Disponível em: Acesso em: 15 jul 212. DI BARTOLOMEO, S.; FERMEPIN, M.R.; SAUKA, D.H.; TORRES, R.A. Prevalence of associated microrganisms in genital disharge. Rev Saúde Pública, v.36, n.5, p , 22. EHRSTRÖM, S.M.; KORNFELD, D.A.N.; RYLANDER, E. Signs of chronic stress in women with recurrent candida vulvovaginitis. Am J Obst Gynecol, v. 193, p ,. EYLER, A.E.; PIERSON, C.; REED, B.D. Improved diagnosis of candida vulvovaginitis using Diamond s media modified. J. Women s Health, v.5, p , GALLE, L. C.; GIANINNI, M. J. S. M. Prevalência e susceptibilidade de leveduras vaginais. J Bras Patol Med Lab, v.4, n.4, p ,.

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