PAULA ORDONHEZ RIGATO

Transcrição

1 PAULA ORDONHEZ RIGATO Imunogenicidade da vacina de DNA quimérica LAMP-1/p55Gag do HIV-1 no período neonatal e efeito da imunização materna na resposta vacinal da prole de camundongos Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título De Doutor em Ciências (Imunologia). São Paulo 2009

2 PAULA ORDONHEZ RIGATO Imunogenicidade da vacina de DNA quimérica LAMP-1/p55Gag do HIV-1 no período neonatal e efeito da imunização materna na resposta vacinal da prole de camundongos Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título De Doutor em Ciências. Área de Concentração: Imunologia Orientador: Profa. Dra. Maria Notomi Sato São Paulo 2009

3 DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP) Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo reprodução total Ordonhez Rigato, Paula. Imunogenicidade da vacina de DNA quimérica LAMP-1/p55Gag do HIV-1 no período neonatal e efeito da imunização materna na resposta vacinal da prole de camundongos / Paula Ordonhez Rigato. -- São Paulo, Orientador: Maria Notomi Sato. Tese (Doutorado) Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Imunologia. Área de concentração: Imunologia. Linha de pesquisa: Imunorregulação / Imunologia de doenças infecciosas. Versão do título para o inglês: Immunogenicity of LAMP-1/p55Gag of HIV-1 DNA chimeric vaccine on neonatal period and effect of maternal immunization immune response of vaccinated offspring. Descritores: 1. Imunologia 2. Vacinas 3. HIV 4. AIDS 5. Neonatologia 6. DNA I. Sato, Maria Notomi II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação em Imunologia III. Título. ICB/SBIB086/2009

4 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS Candidato(a): Paula Ordonhez Rigato. Título da Tese: Imunogenicidade da vacina de DNA quimérica LAMP- 1/p55Gag do HIV-1 no período neonatal e efeito da imunização materna na resposta vacinal da prole de camundongos. Orientador(a): Maria Notomi Sato. A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão pública realizada a.../.../..., considerou ( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a) Examinador(a): Assinatura:... Nome:... Instituição:... Examinador(a): Assinatura:... Nome:... Instituição:... Examinador(a): Assinatura:... Nome:... Instituição:... Examinador(a): Assinatura:... Nome:... Instituição:... Presidente: Assinatura:... Nome:... Instituição:...

5 Dedico este trabalho a todos que vivem com aids, àqueles que necessitam do tratamento, de uma vacina, compreensão e aceitação. Que este trabalho possa, verdadeiramente, um dia contribuir com vocês: A aids não é mais só uma doença, é uma questão de direito humano. Como eu fiquei preso com uma sentença de prisão perpétua, as pessoas infectadas pelo HIV vivem com uma condenação para a vida toda. Temos os remédios e as formas de livrar as pessoas desta condenção em mãos. Precisamos agir juntos para fazer esta ajuda chegar as pessoas necessitadas. Nelson Mandela Dedico este trabalho também à minha família por todo amor, dedicação, companheirismo e educação.

6 Agradecimentos A Professora Dra. Maria Notomi Sato pela dedicação, orientação, amizade e paciência despendidas nestes quatro anos de trabalho. Uma orientadora que sempre agregou conhecimentos na minha vida profissional e pessoal. Uma profissional exemplar que ajuda na escolha dos caminhos e clareia as nossas decisões, abre portas do mundo e nos ensina, a cada momento, por que vale a pena seguir nesta direção. É um exemplo de orientador que está sempre ali, para o que nós, como alunos e como pessoas, precisarmos... Obrigada pela presença constante em muitas das minhas decisões e em todo curso deste doutorado, mais do que orientadora, é uma pessoa amiga que inspira força para enfrentar todos os desafios! Ao Prof. Dr. Alberto José da Silva Duarte pela confiança, dedicação, orientação e oportunidades que me oferece desde minha chegada ao LIM-56 em 2000, supervisor no aprimoramento, orientador no mestrado e mestre em todos os momentos... Representa para mim, muito mais que um chefe, é exemplo e inspiração de dedicação e de persistência nesta caminhada acadêmica. Apesar de sempre falar que aqui dentro do laboratório é só o profissional que conta, não tem como não nos apegarmos como uma grande família, pois esta é a palavra que está em todos os seus discursos! Aos Profs. Drs. Gil Benard e Jorge Casseb pela dedicação e orientação em outros projetos além do doutorado. Pesquisadores sempre presentes em toda minha caminhada e decisões nesta área maravilhosa da pesquisa. Ao Prof. Dr. Ernesto Marques pela oportunindade de trabalharmos com esta vacina, que para mim representa uma das estratégias para conter a aids. Agradeço pela colaboração e dicas científicas durante as reuniões do projeto. Ao Dr. Milton Maciel Jr pela co-orientação virtual e amizade. Aos amigos/colegas imprencídíveis sem os quais este trabalho não teria sido finalizado: Adriana Letícia Goldoni, Cyro Alves de Brito, Orlando Guerra Piubelli, Ana Elisa Fusaro e Soraya Ogusuku. Agradeço pela ajuda técnica e principalmente pela amizade e momentos especiais. Um agradecimento em especial a Ana Elisa Fusaro que me ensinou e me orientou no manuseio dos animais, ensinando o respeito que devemos ter por estes seres.

7 A Rachel Guedes e Wilma Santos pelo zelo com os animais e o nosso biotério, o trabalho de vocês sempre foi a base para que todo o projeto se desenvolvesse. Às meninas do Laboratório de Virologia e Terapia Experimental do Centro de Pesquisa Aggeu Magalhão da Fiocruz de Recife, Liciana Xavier, Karla Barbosa e Andrea Melo pela ajuda na leitura das placas de ELISpot e pelo treinamento no leitor de ELISpot e pela amizade. Aos amigos do grupo Experimental e LIM-56: Mayce Helena Azor, Francinelson Duarte, Jefferson Russo Victor, Juliana Santos, Isabela Fernandes, Bruno Pacola, Eliana Tanigushi que dividiram conhecimentos e deixaram momentos de convívio, companheirismo e conhecimento. À equipe efetiva de pesquisadores associados ao LIM-56, que incentivam e inspiram a busca por respostas científicas, transmitindo a dedicação, a seriedade e a curiosidade, que se deve ter com a ciência básica e clínica. Às amizades nascidas no laboratório que dividem e comemoram todos os momentos, sejam estes de vitória, de alegria, de conquistas, de queda, de perdas, de dificuldades, de despedidas. Pessoas que pacientemente dividiram seus conhecimentos práticos, teóricos e pessoais: Camila Rodrigues Cacere, Ligia Fukumori, Rosemeire Navickas, Noemia Mie Orii, Rosangela Araújo, Soraya Ogusuku, Bosco Cristiano, Bianca Santos, Vanessa Batista, Liã Barbara Arruda, Fábio Eduardo da Silva, Rosana Alcalde, Viviane Bressani, Adriana de Brito e toda equipe do experimental. Ao pessoal da secretaria e suporte técnico que nos ajudam e apóiam em todos os momentos: Edna Reis, Luiz Abraão, Lucio Martins, Celeste Romano, André Goto e a equipe de informática. E aos que não estão mais no LIM-56, mas que fazem parte da história deste laboratório: Daniel Morales e Olivete Venâncio. Às meninas maravilhosas que zelam pela limpeza do nosso laboratório e pela eficiência dos experimentos com a lavagem dos nossos materiais: Adriana Santos e Silvia Castro; Às observações e sugestões dos professores da banca do exame de qualificação: Prof. Dr. Magnus Ake Gidlund; Prof. Dr. Maurício Rodrigues e Prof. Dr. José Maria Alvarez Mosig. E ao Prof. Luiz Carlos Ferreira pelas oportunidades de colaboração e conselhos científicos.

8 A Profa. Dra. Lourdes Isaak, pela oportunidade de estagiar e aprender um pouco da arte da docência no ensino superior (PAE). Ao CNPq, FAPESP, LIM-56 e Ministério da Saúde pelo auxílio técnico e financeiro. Ao Programa de Cooperação Técnica em HIV/AIDS do Ministério da Saúde do Brasil e ao governo Francês, pela oportunidade do treinamento no Laboratoire d Immunologie Cellulaire do Hôpital Pitié-Salpétrière sob supervisão da Profa. Dra. Brigitte Autran, uma grande pesquisadora na área de imunologia HIV/AIDS e ao Prof. Dr. Ionnis Theodorou, um grande pesquisador na área de imunogenética do HIV/AIDS, pela orientação e oportunidade do treinamento seu laboratório. Agradeço a toda sua equipe pelo treinamento. Agradeço por me receberem tão bem e pelas oportunidades que me abriram para fazer meu pós-doc em seus laboratórios. Este incentivo representa hoje a realização de um dos meus maiores ideais, que é vivenciar profissionalmente a pesquisa numa instituição estrangeira em grupo de excelência científica na área do HIV/AIDS. Em especial agradeço aos meus pais, Euclépia Ordonhez Rigato e Renato Rigato, por todo amor, educação, paciência e ajuda em todos os momentos da minha vida. A estrutura que eu recebo suporta que eu percorra meus caminhos sem dúvida e com total apoio de vocês. Aos meus irmãos, Daniel Rigato e Fernando Rigato, e a praticamente irmã Talitta Galvano Rigato pelo companheirismo e força! Ao meu sobrinho Enrico Galvano Rigato, que renovou a alegria de nossa família. Ao meu nonno Tullio Rigato, minha nonna Maria Zandonaddi Rigato e avó Adelina Ordonhez, todos in memorian, meus queridos, os quais mesmo ausentes fisicamente, inspiram minha caminhada na busca pelas respostas e soluções às doenças que desestruturam famílias e populações (grazie per fare di me parte della historia). Aos meus amigos do Espiritismo que seguem comigo mais esta jornada, e que com ensinamentos, paciência, perserverança e colaboração me situam frente a beleza e misérias do mundo, me ajudando na compreensão das razões e causas de todas diferenças e dores vivenciadas pelos seres humanos. Inspirando a luta por uma convivência melhor e estimulando a caridade a todos em qualquer situação. Os meus carinhosos e sinceros agradecimentos pela amizade essencial daqueles que me acompanham há muito ou pouco tempo, àqueles que me inspiram e me dão força, que de

9 perto ou longe, estão sempre ao meu lado: Camila Rodrigues Cacere, Fernanda Tinelli Marquesini, Roni Lara Moya, Patrícia Montanheiro, Vanessa Lopes, Vanessa Galinari, Agnes Akemi Aoki, Luciane Ordonhez, Rafael Ordonhes, Gabriela Ordonhes... e àqueles que por descuido esqueci de mencionar... Algumas pessoas se tornam essenciais no nosso caminhar e sabem o real e verdadeiro sentido da palavra amizade... A DEUS pela oportunidade de estar vivendo neste momento e nesta situação, pelo livre arbítreo, pelos ensinamentos, pela vida e pela capacidade de compreensão em geral do que acontece no mundo... e por permitir o estudo em seres vivos.. por mais difícil que seja a aceitação por parte da comunidade não-científica e científica. E agradeço por esta paixão que tenho por estudar esta doença que hoje representa uma pandemia. Os meus mais sinceros agradecimentos a todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho. Aqui mais um sonho se encerra e muitos caminhos se abrem. Enquanto um projeto chega ao final, a realização de outro apenas se inicia, com a base teórica e profissional adquirida, nestes 9 anos de LIM-56, entre disciplinas, técnicas, congressos, simpósios e palestras, sigo ao pós-doutorado, dando continuidade aos meus ideais e sonhos. Cada pessoa citada ou que, inconscientemente, deve ter esquecido de citar, contribuiu e ensinou muito a cada passo desta realização. A gratidão será eterna a toda minha família, amigos e equipe/amigos/colegas do Laboratório de Investigação Médica 56 da Faculdade de Medicina da USP e aos professores das disciplinas que reacenderam a chama da curiosidade a cada aula cursada...

10 O senhor não daria banho a um leproso nem por um milhão de dólares? Eu também não. Só por amor se pode dar banho a um leproso. Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota. Todas as nossas palavras serão inúteis se não brotarem do fundo do coração. As palavras que não dão luz aumentam a escuridão. É fácil amar os que estão longe. Mas nem sempre é fácil amar os que vivem ao nosso lado. As palavras de amizade e conforto podem ser curtas e sucintas, mas o seu eco é infindável. Temos de ir à procura das pessoas, porque podem ter fome de pão ou de amizade. A falta de amor é a maior de todas as pobrezas. Quem julga as pessoas não tem tempo para amá-las. O importante não é o que se dá, mas o amor com que se dá. Não ame pela beleza, pois um dia ela acaba. Não ame por admiração, pois um dia você se decepciona. Ame apenas, pois o tempo nunca pode acabar com um amor sem explicação. Não devemos permitir que alguém saia da nossa presença sem se sentir melhor e mais feliz. Madre Teresa de Calcutá

11 ... Marco Polo ficou inquieto. Esfregou as duas mãos no rosto. Suspirou, colocou a mão no queixo, apoiou o cotovelo sobre a coxa como um pensador e perguntou: "O que pensavam os filósofos a respeito de Deus?" "Lembre-se do que eu lhe disse: muitos filósofos acreditavam na metafísica. eles não tinham medo de argumentar e discutir a respeito de Deus. A ciência tem medo de debater sobre Ele por receio de pender para uma religião e perder a individualidade. Nós não sabemos quase nada sobre a caixa de segredos da existência. Milhões de livros são uma gota no oceano. Lembre-se, somos uma grande pergunta procurando uma resposta nos poucos anos dessa vida." "Mas filósofos como Marx, Nietzche e Sartre foram ateus." Falcão fitou vagarosamente o amigo e, como se estivesse iluminado, disse:"há dois tipos de Deus: um Deus que criou os homens, e outro que os homens criaram. Para mim, esses filósofos não acreditavam no Deus criado pelos homens. eles foram contra a religiosidade da sua época, que dilacerava os direitos humanos, mas não são ateus puros. Todavia não posso falar por eles." O jovem pensou e inquiriu: "Quem somos nós? O que somos? Para onde vamos?" "Frequentemente, me faço tais perguntas. Quanto mais as faço, mais me perco, e quanto mais me perco, mais procuro me achar. Olhe as pessoas ao seu redor. O que você vê?" (Falcão) "Pessoas de ternos, mulheres bem-vestidas, jovens exibindo seus tênis, adolescentes arrumando o cabelo, enfim, pessoas transitando." (Marco Polo) "A maioria dessas pessoas vive porque respira. Não perguntam mais "quem são?", "o que são?" Estão entorpecidos pelo sistema. O ser humano atual não ouve o grito da sua maior crise. Cala sua angústia porque tem medo de se perder num emaranhado de dúvidas sobre seu próprio ser. No começo do século XX, a ciência prometeu ser o deus do Homo sapiens e responder a essas perguntas. Mas ela nos traiu." (Falcão). "Por que nos traiu?" (Marco Polo) "Primeiro porque não desvendou quem somos, continuamos a ser um enigma, uma gota que por um instante aparece e logo se dissipa no palco da existência. Segundo, porque, apesar do salto na tecnologia, ela não resolveu os problemas humanos fundamentais. A violência, a fome, a discriminação, a intolerância e as misérias psíquicas não foram debeladas. A ciência é um produto do ser humano e não um deus do ser humano. Use-a não seja usado por ela." Augusto Cury

12 Resumo Rigato PO. Imunogenicidade da vacina de DNA quimérica LAMP-1/p55Gag do HIV-1 no período neonatal e efeito da imunização materna na resposta vacinal da prole de camundongos [tese]. São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; A alta incidência de crianças infectadas pelo HIV-1 devido a transmissão materna do vírus salienta a necessidade de estudos que verifiquem a imunogenicidade de vacinas anti-hiv profiláticas e/ou terapêuticas em período preoce de vida. O período neonatal é caracterizado pela imaturidade do sistema imunológico associada à alta predisposição à tolerância e ao efeito inibitório dos anticorpos maternos, sendos as vacinas de DNA uma estratégia para contornar estes efeitos. A vacina de DNA quimérica LAMP/gag, constituída pelo gene gag do HIV-1 ligado ao gene da proteína associada a membrana lisossomal 1 murina (LAMP), direciona o antígeno endógeno aos compartimentos lisossomais/endossomais possibilitando a apresentação via moléculas de classe II do MHC, promovendo a ativação de células T CD4+, evidenciada pelo aumento da resposta imunológica celular e humoral a Gag em camundongos BALB/c adultos e macacos Rhesus. Neste projeto, avaliou-se o potencial imunogênico da vacina LAMP/gag em período precoce de vida em camundongos e o efeito da imunização materna na resposta vacinal da prole. Os resultados, mostram que o DNA quimérico LAMP/gag é imunogênico no período neonatal, considerando a produção de anticorpos anti-gag e a magnitude do número de células produtoras de IFN-γ aos peptídeos da Gag do HIV-1. A imunização iniciada em idade neonatal com a vacina LAMP/gag (1 ou 5µg) induziu a produção de anticorpos IgG anti-gag, sendo a dose de 5µg indutora de isótipos de anticorpos semelhantes à imunização adulta (IgG1> IgG2a> IgG2b). Além de estimular um número superior de células produtoras de IFN-γ para epítopos de classe I e II do MHC comparados aos imunizados com gag. Os neonatos imunizados com baixa dose (1µg) de LAMP/gag e reforçados com gag produziram níveis de isótipos de anticorpos similares ao grupo imunizado com duas doses de 5µg de LAMP/gag, aumentou a porcentagem de células T CD8+ com potencial citotoxico (TNF-α, IFN-γ, granzima) e de células específicas ao epítopo imunodominante de classe I do MHC da Gag. Além disso, a imunização neonatal com LAMP/gag foi capaz de gerar resposta humoral e celular de longa duração observado até os 9 meses de idade. A imunização pré-concepcional com LAMP/gag possibilitou a transferência preferencialmente IgG1 anti-gag às proles pela via transplacentária e pelo leite, os quais perduram até 60 dias na circulação das proles. A vacinação gênica diminuiu algumas citocinas/quimiocinas transferidos à prole e o TGF-β1 no leite materno. A imunização materna com LAMP/gag inibiu a resposta humoral e diminuiu a magnitude de resposta celular aos peptídeos da Gag na prole imunizada em período neonatal, em paralelo à detecção de elevado nível dos anticorpos maternos IgG anti-gag e de células CD4+CD25+FoxP3 na prole. Entretanto, a vacinação materna não interferiu na geração de resposta de memória imunológica. O protocolo de imunização por via intravenosa com LAMP/gag durante a gestação mostrou que há transferência do plasmídeo aos tecidos fetais capaz de primar o sistema imunológico neonatal, gerando SFC de IFN-γ aos peptídeos da Gag, além de primar o sistema imune materno. Os resultados mostram que a vacina de DNA quimérica é imunogênica e necessária para sensibilização de células T e B dos camundongos em período neonatal e na geração de resposta de memória imunológica

13 anti-gag. Além disso, a imunização pré-concepcional materna com LAMP/gag transfere anticorpos e outros fatores para a prole, diminuindo a resposta imune ao LAMP/gag, mas não afeta o desenvolvimento de memória imunológica na prole. A estratégia de imunização por via intravenosa com LAMP/gag durante a gestação evita a transferência de anticorpos inibitórios e é capaz de sensibilizar ambos os sistemas imunológicos, materno e fetal. Palavras-chave: Imunologia; Vacinas; HIV; AIDS; Neonatologia; DNA.

14 Abstract Rigato, PO. Immunogenicity of LAMP-1/p55Gag of HIV-1 DNA chimeric vaccine on neonatal period and effect of maternal immunization immune response of vaccinated offspring [thesis]. São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; The high incidence of HIV-1 infected children due to mother-to-child transmission emphasizes the need of studies about immunogenicity of profilatics and/or therapeuctics HIV vaccines during early stages of life. Neonatal period is characterized by immaturity of immune system associated to the high susceptibility to tolerance and to the inhibitory effects of the maternal antibodies, thus DNA vaccine is a strategy to overcome these effects. The LAMP/gag DNA chimeric vaccine encoding the p55 of gag from HIV with the lisossomal associated membrane protein 1 (LAMP-1) drive the endogen antigen to MIIC compartment, eliciting T CD4+ cell activation, leading to a strong cellular and humoral response in BALB/c adult mice and Rhesus monkeys. In the present work, we evaluated the immunogenic potencial of LAMP/gag DNA vaccine in the early stage of life in mice as well as the effect of the maternal immunization on the offspring vaccination. The results showed that LAMP/gag chimeric vaccine is immunogenic in neonatal period, considering the anti-gag antibody production and the magnitude of HIV-1 Gag peptide IFN-γ producing cells. The LAMP/gag DNA immunization initiated in neonatal period (1 or 5µg) induced the IgG anti-gag antibody response, in which the dose of 5µg elicited antibodies levels similarly to adult immunization (IgG1> IgG2a> IgG2b). In addition, LAMP/gag DNA immunization induced higher number of IFN-γ producing cells to the class I and II epitopes compared to gag immunization. The neonatal immunization with LAMP/gag with the lower dose (1µg) boosted with gag generated anti-gag antibody isotypes similar the group immunized with two doses of 5µg LAMP/gag, augmenting the T CD8+ cell percentage with cytotoxicity potential (expression of TNF-α, IFN-γ, granzyme) and MHC class I epitope specific cells. Furthermore, the neonatal immunization with LAMP/gag was able to elicit marked lasting humoral and cellular response until 9 months old. The LAMP/gag DNA preconceptional immunization transferred mainly anti-gag IgG1 antibodies to offspring by transplacental and breastfeeding routes, detecting until 60 days in the offspring circulation. Genetic mother immunization downmodulated the concentration of some cytokines/chemokines transferred to offspring and the TGF-β1 on the milk. Maternal LAMP/gag immunization inhibited Gag humoral response and diminished magnitude of Gag cellular response on immunized offspring, in paralel to detection of high levels of anti-gag maternal antibody and increase of the percentage of CD4+CD25+FoxP3 in offspring. Nevertheless, maternal immunization with chimeric DNA vaccine did not affect the generation of cellular memory response. Evaluating an intravenous LAMP/gag protocol of immunization during pregnancy it was noticed plasmide transference to fetal tissues which primed the neonatal immune system, generating Gag IFN-γ producing cells and also priming the maternal immune system. These results showed that chimeric DNA vaccine is immunogenic and necessary to prime T and B cell and to develop immunologic memory on mice in neonatal period. Furthermore, the preconceptional immunization transferred antibodies and others immune factors to offspring and diminished the LAMP/gag immunization, whereas did not affecting the

15 immunologic memory development of the offspring. The strategy intravenous immunization during pregnancy avoided antibody transference and primed both maternal/fetal immune systems. Key words: Immunology; Vaccines; HIV; AIDS; Neonatology; DNA.

16 Sumário 1 Introdução Objetivos Objetivos específicos Material e métodos Animais Plasmídeos Expressão das proteínas LAMP/gag e Gag Protocolo de imunização neonatal Protocolo de imunização adulta e/ou materna Protocolo de imunização intravenosa materna no período gestacional Obtenção de células esplênicas Freqüência de células esplênicas produtoras de IFN-γ (ELISpot) Cultura de células para obtenção de sobrenadantes Determinação da concentração de citocinas pró-inflamatórias por citometria de fluxo Detecção de anticorpos por ELISA Dosagem de TGF Quantificação de células CD8+ antígeno específicas Fenotipagem das células CD Análise de células CD8+ secretoras de IFN-γ, TNF-α:, IL-2, Perforina e Granzima Quantificação de células T CD4+CD25+FoxP Dosagem das citocinas e quimiocinas por microesferas recobertas com anticorpos (multiplexed bead-based immunoassay - xmap TM ) em citômetro de fluxo Coleta dos órgãos de neonato Extração de RNA, obtenção do cdna e reação semi-quantitativa de PCR em tempo real (Real-Time PCR) Análise estatística Resultados Expressão da proteína Gag em células HEK-293 transfectadas com as vacinas gênicas Imunogenicidade neonatal às vacinas de DNA Produção de anticorpos às vacinas de DNA Resposta celular neonatal às vacinas de DNA Perfil da resposta de IFN-γ aos peptídeos da Gag do HIV-1 após imunização neonatal Produção de citocinas ao peptídeo imunodominante de classe I do MHC em neonatos e adultos imunizados com as vacinas de DNA Resposta de células com potencial citotóxico após imunização neonatal com as vacinas de DNA Memória imunológica após imunização neonatal com as vacinas de DNA Resposta humoral e celular Efeito da imunização materna na prole não imunizada Transferência de anticorpos maternos e permanência no soro da prole Presença de citocinas e quimiocinas em fluídos de mães imunizadas com as vacinas de DNA... 85

17 4.4.3 Efeito da imunização gênica na porcentagem de células T CD4+CD25+FoxP3+ dos neonatos aos sete dias de idade Efeito da imunização materna na resposta vacinal da prole Efeito da imunização materna na produção de IgG anti-gag na prole imunizada Efeito da imunização materna com LAMP/gag na resposta celular da prole imunizada no período neonatal Efeito da imunização materna com LAMP/gag na produção de IFN-γ da prole imunizada após seis meses de idade Imunogenicidade materno-fetal das vacinas de DNA por via intravenosa Detecção de RNAm de gag nos tecidos da prole de mães imunizadas com as vacinas de DNA por via intravenosa (iv) Efeito da imunização materna via intravenosa com as vacinas de DNA durante a gestação na resposta imune celular e humoral da prole Discussão Conclusões Referências Anexos Anexo A Células formadoras de spot (SFC) de IFN-γ de camundongos neonatos imunizados com 1µg das vacinas de DNA Anexo B Células formadoras de spot (SFC) de IFN-γ de camundongos neonatos imunizados com 5µg das vacinas de DNA Anexo C Células formadoras de spot (SFC) de IFN-γ de camundongos adultos imunizados com 50µg das vacinas de DNA Anexo D Resposta de células produtoras de IFN-γ (SFC/0.5x10 6 esplenócitos) 9 meses após imunização neonatal Anexo E Resposta de células produtoras de IFN-γ (SFC/0.5x10 6 esplenócitos) 6 meses após imunização neonatal

18 Introdução

19 1 Introdução Há mais de vinte e seis anos foram descritos os primeiros casos de síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) e posteriormente, o vírus da imunodeficiência humana (HIV) foi identificado e denominado o agente causador desta síndrome. Desde então, a aids se tornou uma pandemia que hoje atinge 33 milhões de pessoas (United Nations Programme on HIV/AIDS - UNAIDS, 2008). Estima-se que a cada dia mais de 7397 pessoas se infectam com o HIV e mais de 5479 morrem de causas relacionadas à aids principalmente devido à falta de acesso aos serviços de prevenção e tratamento (UNAIDS, 2008). A aids é a doença infecciosa que mais desafia a saúde pública, e está associada a mais de 25 milhões de mortes em adultos (homens e mulheres) o que acarretou no aumento de crianças órfãs e na queda do desenvolvimento econômico em alguns países (UNAIDS, 2008). Em 2008, globalmente mais de dois milhões de mortes foram devidas à aids, sendo que destas, 76% ocorreram no Sub-Sahara Africano, a região mais afetada no mundo. O que alarma as autoridades mundiais é a feminização e infantilização da doença, sendo que o contingente de mulheres e crianças infectadas pelo HIV aumentou vertiginosamente durante na última década. Segundo a Organização Mundial da Saúde um número crescente de indivíduos com idade inferior a 15 anos vive com HIV/aids (UNAIDS, 2008). No Brasil, estima-se um número superior a infectados pelo HIV (Ministério da Saúde, 2008). Desde 1980 até junho de 2008 confirmou-se casos de aids notificados ao Ministério da Saúde, sendo que são indivíduos menores de cinco anos de idade e menores de 12 anos. Segundo a UNAIDS (2008), uma porcentagem alta de pessoas infectadas pelo HIV-1 ignora este fato, em todo o globo. A transmissão do HIV da mãe para a criança (TMC) é um tópico que merece atenção e representa um agravante na saúde pública mundial. A TMC contribui com cerca de 90% dos casos de infecção pelo HIV em crianças que ocorrem a cada ano (Center of Disease Control - CDC, 2006). Sem intervenção terapêutica, há um risco de 15-30% da mãe infectada transmitir o HIV para o filho durante a gravidez e parto, além do risco de 10-20% de transmissão pela amamentação. No Brasil de 2000 a junho de 2008, foram indentificados gestantes infectadas, sendo a TMC responsável por casos de infecção pelo HIV em crianças (84,5%), o que representa 2,3% do 18

20 número total de indivíduos infectados (Ministério da Saúde - MS, 2008). Apesar do número de crianças infectadas ser significante, o Brasil realizou um dos grandes avanço no que diz respeito à diminuição de casos de TMC (MS, 2005). Entretanto este tipo de transmissão é ainda agravante em regiões da África e Ásia. No sub-saara africano, onde mais de 40% das gestantes são infectadas pelo HIV, a pandemia HIV/aids promove efeitos devastadores na sobrevida da criança (CDC, 2006). Nesta região africana, 90% das infecções em indivíduos menores de 15 anos ocorrem por TMC (UNAIDS, 2006). Uma alternativa para diminuição da TMC no mundo é a intervenção com a terapia antiretroviral altamente potente (Highly Active AntiRetroviral Treatment HAART), entretanto mais de 70% de indivíduos infectados pelo HIV globalmente não tem acesso à medicação (UNAIDS, 2008). Durante estes 27 anos de epidemia, a aids continua desafiando os esforços para contê-la (UNAIDS, 2008). Nos últimos anos, houve um aumento do número de países que sustenta o acesso universal ao tratamento antiretroviral e serviços para previnir a transmissão materno infantil do HIV (UNAIDS, 2008). Ainda assim, existe uma necessidade crescente e emergencial para intensificar a prevenção da infecção pelo HIV-1, pois segundo as autoridades em saúde pública, hoje, para cada duas pessoas que começam a receber terapia antiretroviral, outras cinco se infectam (UNAIDS, 2008). A prevenção da transmissão vertical do HIV da mãe para filho é um ponto crucial na diminuição da mortalidade infantil. A transmissão perinatal é a principal via de infecção pelo HIV na população infantil, sendo que na ausência de procedimento profilático (administração de HAART) a estimativa da ocorrência da infecção é de 25,5%, sendo que destes, 65% dos casos ocorrem no trabalho de parto (MS, 2005). Com a profilaxia antiretroviral, a TMC foi reduzida para menos que 1% em alguns países (Mandelbrot et al., 2001). Entretanto, foram reportados efeitos colaterais após a exposição fetal e neonatal em crianças não infectadas, incluindo alterações hematológicas e imunológicas (Pacheco et al., 2006, Bunders et al., 2005, Feiterna- Sperling et al., 2007). Desta forma, uma alternativa para contornar estes efeitos é o estudo e desenvolvimento de vacinas contra a infecção pelo HIV, que, quando administradas na mãe possam transferir fatores de proteção ao recém-nascido, ou ainda, transferir a vacina ao feto promovendo desenvolvimento de resposta anti-viral que perdure até a idade adulta. Este fato salienta a necessidade de estudos em modelos experimentais para obter novas formulações de vacinas e fornecer subsídios de monitoramento dos parâmetros da resposta imunológica, sejam celulares ou humorais. 19

21 Desta forma, torna-se necessário o estudo experimental para avaliar a imunogenicidade em fase precoce de vida, que leve a geração de resposta de memória imunológica que perdure até a fase adulta. O HIV é da família Retroviridae, caracterizada por possuir duas fitas simples de ácido ribonucléico (RNA) que são transcritas pela ação da transcriptase reversa (RT) viral em ácido desoxirribonucléico (DNA) de fita dupla, que, por sua vez, é integrada ao genoma celular pela ação da integrase viral (Turners e Summers, 1999). Este microrganismo pertence à subfamília dos Lentivirinae, que possui morfologia singular do vírion com core cilíndrico e cônico e a característica de promover infecções lentas e latentes (Turners e Summers, 1999). O genoma do HIV é constituído por três genes estruturais (env, gag, pol) e três acessórios (nef, vpr e vif) e três adicionais (rev, tat e vpu). A estrutura do HIV-1 consiste de glicoproteínas de superfície codificadas pelo env (envelope viral), responsáveis pela entrada do vírus na célula hospedeira; de proteínas do core, constituído pela matriz (p24), capsídeo (p17) e nucleocapsídeo (p7) codificadas pelo gag, responsáveis pela estruturação do vírion imaturo contendo os outros componentes virais e ancoramento na membrana celular; de três enzimas (transcriptase reversa, a qual transcreve o RNA viral em DNA; integrase, responsável por integrar o DNA pró-viral ao genoma da células hospedeira e a protease responsável pela clivagem e maturação das sequências peptídicas virais) codificadas pelo pol (polimerase). Além das proteínas acessórias e adicionais: Nef codificada pelo nef (negative factor) responsável por aumentar a replicação viral e diminuir a expressão de CD4 e moléculas de classe I, Rev que transporta o RNA do núcleo para o citoplasma; Tat que inibe a terminação prematura da transcrição gênica; Vif que é o fator de infectividade viral; Vpr direciona os complexos de integração ao núcleo e induz a diferenciação celular; Vpu que degrada o CD4 e promove a liberação de novas partículas virais (Turners e Summers, 1999; HIV Sequence Compendium, 2008). O HIV infecta as células que expressam concomitantemente a molécula CD4+ (Dalgleish et al., 1984) e os receptores de quimiocinas, CCR5 (Alkhatib et al., 1996) ou CXCR4 (Feng et al., 1996), como por exemplo, os linfócitos T CD4+, macrófagos, células dendríticas, entre outras células (Garzino-Demo e Gallo, 2003). O vírus tem a característica de replicar-se melhor em células ativadas e, assim, os ciclos repetitivos de infecção e ativação celular levam à destruição de novas células, principalmente de células T CD4+, resultando na imunossupressão característica da síndrome (Rowland- Jones, 2003). Sem a intervensão terapêutica, esta depleção de céulas T CD4+ ocasiona 20

22 imunodepressão severa e o aparecimento de sintomas constitucionais, doença neurológica e permissividade a microrganismos oportunistas e/ou neoplasias (Rowland- Jones, 2003). A infecção pelo HIV-1 em adultos pode reduzir a viremia plasmática durante a infecção aguda, concomitante ao aparecimento de uma vigorosa resposta citotóxica específica. Entretanto, na infecção pediátrica derivada da transmissão vertical há evidências de rápida progressão da doença em conseqüência da imaturidade imunológica dos conceptos (Goulder et al., 2001). No que diz respeito ao desenvolvimento de vacinas contra o HIV-1 há dois enfoques principais, estudos direcionados às vacinas profiláticas a serem administradas na população não infectada pelo HIV-1 e as vacinas terapêuticas a serem usadas na imunoterapia em indivíduos infectados pelo HIV-1 objetivando a melhora da resposta imune ao vírus, visando regressão e/ou estabilização da doença (Estcourt, McMichael e Hanke, 2004). Neste contexto, a utilização de vacinas de DNA representa uma estratégia que evita o risco das vacinas com microrganismos vivos ou atenuados, além de ser capaz de estabelecer potente resposta citotóxica e humoral em modelos murinos, podendo ser utilizada na profilaxia ou na terapia. Além disso, são potencialmente indutoras de resposta Th1, essencial na geração de resposta de linfócitos T CD8+ citotóxicos (CTL), e da produção de anticorpos em camundongos e humanos (Arrode et al., 2007; Martin et al., 2007; Graham et al., 2006; Zhang et al., 2002). A vacinação com DNA contendo genes do vírus influenza (Bot et al., 1998; Ulmer et al., 1998), vírus do sarampo e vírus Sendai (Martinez et al., 1997), vírus da leucemia murina (Sarzotti et al., 1996), vírus da hepatite C (Youn et al., 2003), HIV (Asakura et al., 1999) mostrou-se eficaz em estabelecer a resposta imune antiviral em alguns modelos animais como os roedores. Em humanos, as vacinas de DNA não são tão eficazes, quando administradas como naked DNA pelas vias intramuscular ou intradérmica, entretanto têm mostrado resultados promissores quando combinadas com outras formas de vacina, como os vetores virais (Lu, Wang e Grimes-Serrano, 2008). As vacinas de DNA são vetores de expressão (plasmídeo) que utilizam sinais de transcrição e as organelas das células eucarióticas transfectadas para expressão in situ do antígeno (Estcourt, McMichael e Hanke, 2004). As vacinas de DNA funcionam como sistemas de entrega do antígeno que são capazes de promover produção in vivo do antígeno vacinal por várias semanas (Boyle e Robinson, 2000). Estas vacinas codificam 21

23 os genes de uma porção antigênica de um microrganismo, normalmente sob controle de um promotor viral (Estcourt, McMichael e Hanke, 2004; Hobson et al., 2003). Algumas vacinas que obtiveram sucesso em controlar a infecção in vivo contêm o antígeno e componentes adjuvantes que estimulam a resposta imune inata (Medzhitov, 2007; Rulendran e Ahmed, 2006). No caso das vacinas de DNA o elemento adjuvante e os mecanismos intra e extracelulares de sinalização que geram as respostas de células T e B ainda não são conhecidos (Ishii et al., 2008). Pensava-se que os adjuvantes dos plasmídeos seriam os motivos CpGs (citosina-fosfo-guanina) não metilados que sinalizariam via TLR-9 (Tudor et al., 2005). Entretanto, foi demonstrado que camundongos deficientes para TLR-9 ou MyD-88 geram similar resposta humoral e celular ao antígeno vacinal que os animais controles (Ishii et al., 2008). Recentemente, foi descrita que a ação adjuvante e a imunogenicidade de vacinas de DNA são dependente da proteína quinase TANK 1 (TBK1) (Ishii et al., 2008). A sinalização via TBK1 pela vacina de DNA é essencial para resposta de IFN tipo I e requerida para indução de células T e B antígeno-específicas. Na imunização com as vacinas gênicas ocorre a transfecção nas células e posteriormente a tradução da proteína, seguida da sua secreção ou processamento intracelular antigênico. Os antígenos sintetizados endogenamente são degradados no citoplasma por proteases no proteassoma e os peptídeos gerados são transportados através do retículo endoplasmático (RE) pelos transportadores associados ao processamento do antígeno (TAP), depois são associados a moléculas de classe I do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC major histocompatibility complex) e transportados à superfície celular através do complexo de Golgi para apresentação às células T CD8+ ou via moléculas de classe II para as células T auxiliadoras (T helper Th ou T CD4+), por apresentação cruzada (Howarth e Elliot, 2004; Stevenson, 2004). As proteínas derivadas da vacina gênica podem também ser secretadas, endocitadas e posteriormente degradadas no endossoma por proteases. Em paralelo, as moléculas de classe II do MHC que são sintetizadas no RE ligam-se na cadeia invariável que bloqueia a união com proteínas recém sintetizadas no lúmen e direciona para os endossomas acidificados contendo os peptídeos antigênicos, neste local a cadeia invariável é clivada e ocorre a ligação dos peptídeos antigênicos às moléculas de classe II do MHC que migram para a superfície celular e são apresentas para as células T CD4+. As vacinas antivirais consideradas eficientes são aquelas capazes de estimular as células T CD8+ e CD4+, por apresentação de antígeno por todas as células através das 22

24 moléculas de classe I e II do MHC, respectivamente, pelas APCs (Bennett et al., 1997), além de induzirem produção de anticorpos. A ativação de células T CD4+ por apresentação de antígenos através de moléculas de classe II do MHC é vital para a função de vacinas genéticas, como demonstrado em camundongos deficientes para moléculas de classe II do MHC ou depletados de células T CD4+ (Chan et al., 2001; Maecker et al. 1998). Os linfócitos T auxiliares são cruciais para o desenvolvimento de uma resposta imune celular eficiente e persistente. Sendo estes linfócitos T CD4+ essenciais para expansão clonal de células B antígeno específicas, mudança de classe de anticorpos e geração de células T de memória. Várias construções de vacinas de DNA para potencializar a imunogenicidade foram documentadas e, entre elas, as que possibilitam a apresentação do antígeno endógeno através de moléculas de classe II do MHC. Neste sentido, foram realizados estudos de vacinas quiméricas de DNA que codificam proteínas de microrganismos patogênicos conjugadas à proteína associada à membrana lisossomal 1 (LAMP-1 - lysosome-associated membrane protein 1), capazes de direcionar o tráfego de antígeno endógeno para os compartimentos de classe II do MHC (Chen et al., 2000; Rowell et al., 1995; Ruff et al., 1997). Alguns estudos foram realizados com vacinas quiméricas de DNA, constituídas pelo gene que codifica a LAMP-1, que direciona o tráfego do antígeno para os compartimentos de classe II do MHC, conjugado aos genes de microrganismos como do Plasmodium sp (Dobaño et al., 2007); vírus da dengue (Lu et al., 2003), do vírus do papiloma humano (Peng et al., 2005; Chen et al., 2000; Wu et al., 1995) e do HIV-1 (Rowell et al., 1995; Ruff et al., 1997; Marques et al., 2003; De Arruda et al., 2004; Chikhlikar et al., 2004; De Arruda et al., 2006; Chikhlikar et al., 2006). As moléculas LAMP são proteínas transmembrânicas tipo I que contém 24 domínios de aminoácidos transmembrânicos e 11 domínios de aminoácidos citoplasmáticos com seqüências carboxiterminais YQTI, necessários para levar algumas proteínas recombinantes através do compartimento vesicular aos lisossomos (Guarnieri et al., 1993). A proteína LAMP-1 entra em compartimentos vesiculares especializados denominados MIIC, sítios associados com a formação do complexo peptídeo:molécula de classe II do MHC. Em estudos de microscopia eletrônica foi observada a colocalização da LAMP com as moléculas de classe II do MHC (Ruff et al., 1997). Este compartimento endocítico MIIC está envolvido com o transporte do peptídeo antigênico 23

25 associado às moléculas de classe II do MHC para a superfície celular das APC (Ruff et al., 1997; Kleijmeer et al., 1995). No caso do HIV-1, o direcionamento do antígeno sintetizado endogenamente pelo tráfego da LAMP-1 às moléculas de classe II do MHC aumentou a resposta de células T CD4+ e a imunidade humoral em camundongos imunizados com a vacina quimérica de DNA que codifica a gp160 do HIV conjugada à LAMP-1 (Ruff et al., 1997). Contudo, vacinas que contém a gp160 do HIV-1 precisam ser constituídas por diversos genes do envelope que cubram toda heterogeneidade desta região viral, sendo este um obstáculo no uso das glicoproteínas do envelope do HIV-1 em construção de vacinas eficazes que impeçam a infecção por este vírus. A resposta imune contra proteínas do envelope do HIV é relativamente menos eficiente em reduzir as populações virais que infectam os indivíduos (Walker, 2007). A busca por uma vacina efetiva contra o HIV foi direcionada a produtos que geram resposta imunológica às proteínas do envelope viral, entretanto este direcionamento pode favorecer o crescimento do vírus (Walker, 2007). Atualmente, muitos estudos têm abordado a resposta de células T CD4+ e CD8+ aos peptídeos da Gag do HIV, considerando que a intensa resposta a Gag está associada com proteção (Betts et al., 2005; Price et al., 2009) e com o controle da viremia durante a infecção (Rolland et al., 2008; Huang et al., 2008; Serwanga et al., 2009). Outros fatores corroboram com a seleção da proteína Gag na composição da vacina como por exemplo, a característica de ser um gene relativamente conservado entre as diversas classes e subclasses do HIV-1, além do fato de promover ampla resposta cruzada anti- Gag entre pacientes infectados por subclasses diferentes de HIV-1 (Bertoletti et al., 1997; Norris et al., 2004). Recentemente foi demonstrado que a Gag é o primeiro antígeno a ser exposto na membrana das células infectadas (Sacha et al., 2007). Propõese então, que vacinas que induzam respostas contra proteínas conservadas do HIV, como a Gag, expressas precocemente antes do ciclo replicativo do vírus terminar, sejam ideais, pois as células T CD8+ reconheceriam as células infectadas antes dos novos vírus serem liberados (Sacha et al., 2007), ressalta-se que o ciclo replicativo do HIV ocorre em torno de 24 horas (Kim et al., 1989). Desta forma, Marques et al. (2003) desenvolveram a vacina quimérica de DNA denominada LAMP/gag, que contém a seqüência gênica que codifica a proteína de 55 kda do gag do HIV-1 (p55gag) inserida entre os segmentos que codificam o domínio luminal e o citoplasmático/transmembrânico da LAMP-1 murina. A transfecção de 24

26 células de linhagem com o plasmídeo LAMP/gag promove co-localização da Gag com as moléculas de classe II do MHC (Marques et al., 2003). A imunização de camundongos adultos BALB/c com a vacina LAMP/gag foi capaz de induzir potente resposta celular CD4+, CD8+, produção de anticorpos e estabelecer resposta de memória de longa duração em camundongos imunizados com esta vacina em relação aos animais que receberam apenas o p55-gag nativo (Marques et al., 2003, Chikhlikar et al., 2004, De Arruda et al., 2004). Foi demonstrado que a depleção de células CD4+ estimuladas com p55gag de camundongos adultos imunizados com LAMP/gag diminui a produção de IFN-γ (Marques et al., 2003). De Arruda et al. (2006) demonstraram que a vacina LAMP/gag promove aumento na diversidade de epítopos que são reconhecidos pelas células T de camundongos imunizados com a vacina quimérica provavelmente devido ao direcionamento distinto que as proteínas LAMP/gag e Gag seguem no interior das células transfectadas (De Arruda et al., 2006). Ainda, foi observado que a vacina de DNA LAMP/gag aumenta o número de epítopos reconhecidos por células B por um provável aumento na produção da proteína que é produzida e/ou pela alteração da conformação da proteína Gag quando quimerizada com a LAMP-1 (De Arruda et al., 2006). Chikhlikar et al. (2006) imunizaram macacos Rhesus com a vacina LAMP/gag (contendo o gene LAMP humano) e detectaram resposta de células T e B aos peptídeos da Gag. O fato desta vacina quimérica apresentar importante imunogenicidade em camundongos adultos e macacos chama a atenção para evoluir o estudo desta vacina em fase precoce de vida e posteriormente verificar sua capacidade de promover resposta de longa duração. A construção estratégica da vacina de DNA quimérica com a LAMP-1 e o gene gag do HIV poderá contribuir para a indução de resposta imune nos neonatos, possibilitando um adequado processamento antigênico pelas APCs e desenvolvimento de resposta adaptativa mediada pelas células Th e CTL. Os neonatos são mais suceptíveis a vários agentes infecciosos devido a imaturidade imunológica e pela ausência de experiência antigênica. As infecções virais ou bacterianas no trato respiratório e/ou intestinal representam um problema de saúde pública nos países em desenvolvimento (Siegrist, 2007). Dentre os agentes infecciosos relacionados com a morbidade e mortalidade neonatal/infantil vale citar os Streptococcus do grupo B, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, vírus da herpes simples (HSV), citomegalovirus (CMV), virus Esptein-Barr (EBV), varicella-zoster, 25

27 virus sincicial respiratório (RSV) e o HIV-1(Marchant et al., 2001; Goulder et al., 2001). Este período precoce de vida geralmente é caracterizado pelas diferenças qualitativas e quantitativas em relação ao sistema imunológico do adulto, o que reflete na alta susceptibilidade neonatal aos agentes infecciosos (Siegrist, 2007; Adkins, Leclerc e Marshall-Clarke, 2004). Esta imaturidade imunológica relativa, caracterizada por um período de hipogamaglobulinemia transitória pode gerar uma limitação na eficácia de vacinas em induzir resposta imune protetora, como observado em neonatos e crianças e também em várias espécies de animais, incluindo os camundongos (Nahmias e Kourtis, 1997; Siegrist, 2001). No período neonatal, há elevada predisposição à tolerância, um efeito indesejável nos testes de vacinas. Além disso, em período precoce de vida há ausência de memória, somada à inabilidade na apresentação antigênica, da qualidade funcional das células T helper, da resposta T citotóxica e da produção de anticorpos (Siegrist, 2007; Adkins, Leclerc e Marshall-Clarke, 2004). Estas características salientam a necessidade de utilização de vacinas que possibilitem adequada apresentação de antígeno via classe II do MHC para as células Th para favorecer o desenvolvimento da resposta adaptativa. Muitas particularidades imunológicas são observadas no perído neonatal, como a diminuição da reserva de fatores da medula óssea, acarretando na redução da aderência e quimiotaxia celular, baixa atividade enzimática e menor número de células em relação à medula óssea adulta (Kovarik e Siegrist, 1998; Adkins, Bu e Guevara, 1999). Ainda na fase neonatal existe a falta de um microambiente anatômico apropriado para a interação entre as DCs e as células T e B, caracterizado por separação indefinida entre os linfáticos periarteriolar, as zonas marginais, os folículos de células B e centros germinais. Estas caracterísiticas podem gerar diferenças fenotípicas e funcionais das células B, que refletem na baixa produção de anticorpos, contribuindo para uma resposta humoral neonatal mais tardia, de menor intensidade e duração (Adkins, Leclerc e Marshall-Clarke, 2004; Pihlgren et al., 2001). A falha na expressão de moléculas acessórias em APCs e nas células T também é um dos fatores que contribui para a disfunção imunológica neonatal (Lu, Calamai e Unanue, 1979; Durandy et al., 1995; Min et al., 2001; Simpson, Woods e Muller, 2003). As DCs de camundongos neonatos expressam um número menor de moléculas de classe 26

28 II do MHC (Major Histocompatibility Complex Complexo Principal de Histocompatibilidade), CD40, CD80 e CD86, desta maneira a interação com o CD28 nas células T é ineficiente (Marshall-Clarke, Tasker e Parkhouse, 2000; Muthukkumar, Goldstein e Stein, 2000; Simpson, Woods e Muller, 2003). Além disso, as células apresentadoras de antígenos de neonatos são imaturas quanto à função, e estão em número reduzido em relação aos adultos promovendo inabilidade no desenvolvimento das respostas imunes contra patógenos. Porém, quando as áreas esplênicas se tornam organizadas, o número de APCs atingem valores similares aos adultos (Stockinger, 1996; Marshall-Clarke, Tasker e Parkhouse, 2000; Adkins, Leclerc e Marshall-Clarke, 2004). Apesar do número reduzido de DCs, as células CD11c+ de camundongos BALB/c de 7 dias de idade estimuladas com LPS são capazes de processar e apresentar o antígeno às células T, in vitro, e induzir resposta CTL in vivo (Dadaglio et al., 2002). Por outro lado, DCs humanas de cordão estimuladas com LPS não apresentam fenótipo completamente maduro na indução da produção de IFN-γ pelas células T CD4+ (Langrish et al., 2002). No baço neonatal de camundongos, a maioria dos linfócitos B apresenta fenótipo imaturo IgM+IgDlow/- (Marshall-Clarke, Tasker e Parkhouse, 2000). A ausência da expressão de IgD de superfície associada com a interação inapropriada entre as células, altera a sinalização e a ativação de linfócitos B, diminuindo a produção de anticorpos (Adkins, 1999; Bot e Bona, 2002). A resposta humoral em neonatos e em crianças é lenta, de curta duração e apresenta afinidade diminuída. Além disso, as células B expressam baixos níveis de CD40, que juntamente com a baixa expressão de CD40L nas células T, contribui para a síntese diminuída de anticorpos IgG, IgA e IgE (Bot e Bona, 2002; Adkins, Leclerc e Marshall-Clarke, 2004; Pihlgren et al., 2001). Os neonatos apresentam deficiência na produção de anticorpos aos antígenos T independentes tipo II, como os polissacarídeos da cápsula bacteriana (Adkins, Leclerc e Marshall-Clarke, 2004; Siegrist, 2007), consequentemente são mais suceptíveis a infecções por Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae. Em adultos, a expressão de TACI (transmembrane activator and calciummodulator and cyclophilin ligand interactor), uma molécula da família de receptores de TNF, é fundamental na resposta humoral contra vacinas composta por polissacarídeos (Kanswal et al., 2008). A expressão de TACI está dramaticamente reduzida em neonatos murinos comparados aos adultos, além dos seus ligantes BARR ou APRIL não 27

29 induzirem anticorpos IgA, IgG e IgM pelos linfócitos neste período inicial de vida (Kanswal et al., 2008). Outra característica do período neonatal é a deficiência relativa na indução de proliferação das células plasmáticas da medula óssea que colabora com a baixa indução de anticorpos na idade neonatal e com o rápido declínio na produção de anticorpos às vacinas (Pihlgren et al., 2001). Outra característica das células estromais da medula óssea neonatal é o fato destas não proporcionarem sinais que promovam a sobrevivência e diferenciação de plasmablastos em células de longa duração (Pihlgren et al., 2006). Quando o compartimento de células B neonatal é estimulado de maneira apropriada, com o uso de imunógenos potentes, como proteínas complexas ou vetores virais, que ativam adequadamente as APCs, há indução de anticorpos de avidez semelhante aos adultos (Schallert et al., 2002, Kovarik et al., 2001). Outro fator que influencia a susceptibilidade neonatal às infecções é a ausência de memória imunológica, que pode ser compensada pela rapidez com que as células T e B entram em ciclo celular após ativação (Adkins et al., 2003) permitindo a rápida mobilização dos mecanismos efetores contra uma ampla gama de patógenos que são apresentandos pela primeira vez ao sistema imune neonatal. É bem documentado que a gestação está associada com mudanças da resposta imune periférica (Faas et al., 2005) e as citocinas/quimiocinas/fatores de crescimento estão envolvidos em vários processos como implantação do embrião, desenvolvimento da placenta, desenvolvimento do embrião e parto, desta forma oscilando quanto a sua concentração dependendo do período analisado e influenciando o desenvolvimento da resposta imune no recém-nascido (Bowen et al., 2002). Na gestação, as citocinas Th2 produzidas na interface materno/fetal eram relacionadas com o sucesso da gravidez, em contraste às citocinas Th1 (Wegmann, 1993). Entretanto, as citocinas Th1, como o IFN-γ, TNF-α e IL-1, são críticas para o processo de implantação do embrião no útero (Mitchell, Trautman e Dudley, 1993). Ainda, a IL-18 mostrou estar em concentração superior na decídua e na placenta de modelos de gestação não abortivos (Chaouat et al., 2002). Imediatamente após a implantação do feto, as células NK secretoras de IL-18 povoam o útero (Chaouat et al., 2002). As células NK uterinas são fontes de IFN-γ no início da gravidez e são necessárias para o remodelamento vascular uterino e para ocorrência da implantação do embrião e gravidez ocorrer, estas células se expandem na presença de IL-15 e são ativadas por sinais dependentes de células T (Anne Croy et al., 2006). A IL-4 e IL-10 estimulam a liberação de prostaglandinas por alguns tecidos 28

30 gestacionais e oscilam durante o processo gestacional (Bowen et al., 2002). O GM-CSF e o G-CSF estão relacionados com o desenvolvimento/crescimento do embrião (Contramaestre et al., 2008) e estimulam a produção da gonadotrofina coriônica (Bowen et al., 2002). A IL-7 está associada com a diminuição da linfopoiese de células B durante a gestação (Bosco et al., 2006). Já a quimiocina IP-10 (interferon-inducible protein 10 ou CXCL10) é induzida por estímulos pró-inflamatorios como por infecções virais e produtos microbianos, além de estar aumentada em gestantes com pré-eclampsia (Gotsch et al., 2007). De fato, o sucesso da gestação está relacionado com o balanço entre as citocinas Th1/Th2. Supõe-se que a vacinação gênica pré-concepção possa alterar os níveis das citocinas/quimiocinas e outros fatores durante a gestação, por induzir ativação de fatores pró-inflamatórios pela TBK1 mimetizando uma infecção por vírus de DNA. As quimiocinas MIP-1α, MIP-1β e RANTES são induzidas no processo inflamatório gerado durante a infecção viral e são importantes na inibição da infecção pelo HIV-1 (Cocchi et al., 1995). Estas quimiocinas são ligantes naturais do CCR5, que é um coreceptor utilizado junto a molécula CD4, para o HIV-1 entrar nas células. A MCP-1 é a quimiocina ligante de CCR2, outro co-receptor utilizado pelo HIV-1, desta forma é mais um neutralizante natural da infecção (Berger, Murphy e Faber, 1999). A imunidade caracterizada durante a gestação exerce impacto fundamental na indução da resposta imune no neonato (Morein et al., 2002; Morein et al., 2007). Fisiologicamente em camundongos neonatos, existe uma polarização de produção de citocinas do padrão Th2, com secreção de altos níveis de IL-4 e baixos de IFN-γ em relação aos adultos (Barrios et al., 1996; Kovarik e Siegrist, 1998; Adkins, 1999; Adkins, Leclerc e Marshall-Clarke, 2004; Siegrist, 2007). Esta polarização se relaciona com a secreção diminuída de IL-12 pelas APCs neonatais (Lee et al., 1996). Em modelos experimentais e em humanos, a presença de IL-4 durante a sensibilização antigência inibe a expressão da cadeia β2 da IL-12 (IL-12β2) em linfócitos virgens, direcionando a secreção de citocinas do padrão Th2 e inibindo o desenvolvimento da resposta Th1 (Adkins, Bu e Guevara, 2001). Após reestimulação com o mesmo antígeno o camundongo neonato desenvolve uma resposta Th2 (Adkins, Du, 1998). Depois da ativação, uma pequena população de as células T CD4+ de neonatos que não entra em ciclo celular produz IL-4 e IL-13 (Rose et al., 2007). Estas células apresentam-se em estágio hipometilado na região genética regulatória de expressão de citocinas Th2, o que facilita a rápida e a alta expressão de IL-4 e IL-13. Em contraste, 29

31 em camundongos adultos a transição para o padrão Th2 demora vários dias e envolve processos diferentes, como a proliferação celular e demetilação do DNA (Rose et al., 2007). Foi demonstrado em modelo de transferência de células DO11.10 em camundongos, que linfócitos Th1 de neonatos, por apresentarem uma alta expressão do receptor IL-13R1, são susceptíveis a apoptose induzida por IL-4 (Li et al., 2004). Além disso, as células T CD4+ apresentam níveis reduzidos de STAT4 e regulação epigenética do promotor de IFN-γ prevenindo sua diferenciação em Th1 (Adkins, 2007). Outro achado que corrobora com a polarização da resposta Th2 em neonatos relacionase com a maturação tardia de um subgrupo de DCs que produz IL-12, permitindo a expressão aumentada da IL-13Rα1 e sua associação com a IL-4Rα1 (Lee et al., 2008). Aos seis dias de vida os neonatos apresentam acúmulo de DCs CD8a+CD4- produtoras de IL-12 no baço. A IL-12 promove regulação negativa do IL-13Rα1 na célula Th1, diminuindo a sua apoptose e restaurando a produção de IFN-γ após re-estimulação antigênica (Lee et al., 2008). Estratégias que consigam balancear as respostas Th1/Th2 podem facilitar o desenvolvimento de vacinas contras infecções (Siegrist, 2001). O direcionamento para o padrão Th2 na resposta imune neonatal pode ser um dos fatores que influencia a geração de resposta CTL nesta fase de vida. Entretanto, em circunstâncias específicas, células T CD8+ de humanos e camundongos conseguem desenvolver uma resposta citotóxica madura paralelamente ao desenvolvimento de resposta Th1 (Adkins, Leclerc e Marshall-Clarke, 2004). A imunização de camundongos neonatos com vírus da leucemia murina promoveu maior expansão de células T CD8+ produtoras de IFN-γ comparada à imunização de camundongos adultos (Fadel, Ozaki e Sarzotti, 2002). A função efetora de células CD8+ de memória in vivo após priming neonatal foi equivalente à gerada após priming de adultos (Fadel et al., 2006). Ainda no período neonatal, foi demonstrado que aos sete dias de idade ocorre supressão da resposta efetora à infecção pelo HSV mediada pelas células T regulatórias (T regs) (Fernandes et al., 2008). A depleção das células T regs nos neonatos antes da infecção por HSV aumentou a resposta citotóxica de células T CD8+ in vivo detectada pela expressão de granzima e IFN-γ (Fernandes et al., 2008). As células (T regs) suprimem as células T auto-reativas evitando o desenvolvimento de doenças autoimunes e limitam a amplificação da resposta a antígenos como de microrganismos, limitando a imunopatologia (Sakaguchi et al., 2005; Suffia et al., 2006). De fato, em 30

32 neonatos murinos infectados por rotavirus ocorre expansão de células Treg que interfere na sobrevida de células T e B (Kim et al., 2008). Em humanos a depleção de células Tregs no cordão umbelical aumenta a função efetora de células T em crianças expostas à malária (Brustoski et al., 2006). Da mesma maneira, a depleção de células Treg em crianças expostas ao HIV-1 e não infectados revelou intensa resposta de células T comparada a infantis não expostos ao vírus (Legrand et al., 2006). Além disso, o acúmulo de células Treg em órgãos linfóides associa-se com a progressão da infecção pelo HIV-1 para aids, contribuindo com a inabiliadde do sistema imune no controle da replicação viral (Nilsson et al., 2006). A necessidade do amadurecimento e melhora da magnitude da resposta adaptativa neonatal salienta a importância dos anticorpos maternos (AcMats) na proteção contra as infecções durante este período, mas estes AcMats podem interferir na vacinação infantil. A vacinação materna se mostra eficaz em conferir proteção a várias doenças infecciosas através da transferência passiva de anticorpos, prevenindo ou atenuando o risco de infecção à criança (Siegrist et al., 1998). Os anticorpos maternos exercem função crucial na prevenção de algumas doenças no período neonatal até que o esquema de vacinação infantil seja completado (Rigato et al., 2009). Entretanto, os anticorpos maternos podem interferir na eficiência da imunização das crianças, como observado nas condições de altos níveis de anticorpos maternos que são capazes de inibir as vacinas compostas por vírus atenuados (Siegrist, 1998). Um dos mecanismos mais prováveis de influência dos AcMats na resposta do neonato é a neutralização do antígeno vacinal devido à formação de imunocomplexos ou pela ação inibitória decorrente da interação do imunocomplexo de antigeno-anticorpo ao receptor FcγRIIB expresso nas células B (Siegrist, 2003). Uma estratégia para escapar do efeito inibitório dos AcMats na vacinação neonatal é a utilização de vacinas de DNA, considerando que a produção intracelular das proteínas vacinais impediria a ação destes anticorpos, visto que parte da proteína produzida após transfecção celular permanece no interior da célula. A imunização com a vacina de DNA que codifica a proteína do HSV ou com o vírus inativado em camundongos de um dia de idade induz eficaz resposta imune humoral e celular (Manickan et al., 1997). Contudo, somente os neonatos de mães imunizadas que foram imunizados com a vacina de DNA foram capazes de desenvolver resposta imune efetiva. Estas evidências indicam que as vacinas de DNA, em contraste com outras formas de vacinação, parecem ser capazes de induzir imunidade mesmo em 31

33 presença de anticorpos maternos neutralizantes. Sedegah et al. (2003) demonstraram que camundongos imunizados com vacina de DNA contra malária, nascidos de mães imunizadas com a mesma vacina foram protegidos e desenvolveram eficiente resposta de células T. A imunização materna com plasmídeo contendo genes do HIV-1 com posterior reforço com peptídeos é capaz de aumentar a amplitude da resposta imune humoral na prole imunizada com DNA (Brave A et al., 2008). Os anticorpos maternos gerados após infecção não alteram o desenvolvimento de resposta imune às vacinas de DNA e a proteção neonatal contra desafio utilizando vírus da coriomeningite linfocítica ou HSV em modelo murino (Hasset, Zhang e Whitton, 1997). A vacinação materna com DNA gera anticorpos neutralizantes que são transferidos para a prole de camundongos protegendo-os contra o desafio letal com vírus influenza (Zhang et al., 2005; Chen et al., 2007). Os anticorpos maternos são mais eficientes na neutralização do vírus do que os anticorpos produzidos pelos neonatos após imunização com DNA, provavelmente este fato se relacione com o fato da vacina não ser processada e traduzida em proteína estruturalmente complexa que promova a maturação de afinidade dos anticorpos no período neonatal. A relação entre o sistema imune materno/fetal e materno/neonatal durante a gravidez e amamentação é assunto de intensa investigação e relevância para entendimento da indução de imunogenicidade às vacinas no período neonatal (Rigato et al., 2009). Alguns mecanismos são propostos em relação aos fatores imunológicos maternos que possam influenciar a imunização da prole como: a neutralização do antígeno vacinal pelos anticorpos maternos; as interações idiotípicas entre os anticorpos maternos e os receptores de células B e/ou T nos neonatos, que podem regular a proliferação clonal das células e a transferência materna de citocinas/quimiocinas e, fatores tróficos que podem controlar a expansão clonal de células T e B do neonato (Rigato et al., 2009). Uma outra abordagem na tentativa de imunizar a mãe, durante a gravidez, visando sensibilizar o sistema imune fetal in utero foi documentada. A imunização materna de camundongos, por via intravenosa primou o sistema imune fetal (Xin et al., 2002; Okuda et al., 2001). A injeção de vacina de DNA via intravenosa em camundongos gestantes, nove dias após o coito transfere a vacina de DNA ao feto, gera resposta de células T e produção de anticorpos, protegendo o recém-nato após desafio com vírus influenza (Okuda et al., 2002). Enquanto que a vacina de DNA contendo 32

34 gene do envelope firal do HIV-1 administrada em camundongos na semana final da gestação gerou resposta celular e humoral quando a prole recebeu uma dose da mesma vacina (Xin et al., 2001). A compreensão dos mecanismos efetores envolvidos na vacinação neonatal com a vacina LAMP/gag, aspecto ainda pouco conhecido, oferece a oportunidade de melhorar a magnitude da resposta do neonato e na geração de resposta imune de longa duração que poderá refletir na prevenção da doença até a fase adulta. Desta forma, as vacinas LAMP-1/p55Gag, p55gag e LAMP-1 foram investigadas quanto a imunogenicidade em modelo experimental neonatal e para avaliar a influência da imunização materna, seja na pré-concepção ou durante a gestação, na resposta à vacinação da prole. Os achados experimentais sobre indução de imunidade utilizando vacina de DNA anti-hiv em modelo experimental neonatal, com a abordagem maternofetal, poderão fornecer subsídios aplicáveis à vacinação que beneficiarão gestantes e crianças até a fase adulta. 33

35 Objetivos

36 2 Objetivos A proposta do projeto foi avaliar a imunogenicidade da vacina de DNA quimérica contendo a seqüência que codifica a p55gag do HIV-1 ligada à seqüência que codifica a proteína associada à membrana lisossomal 1 (LAMP-1) em camundongos BALB/c no período neonatal. A partir do estabelecimento dos protocolos de imunização neonatal, avaliar a duração da resposta e a influência da imunização materna préconcepção e durante a gestação na resposta vacinal da prole. 35

37 2.1 Objetivos específicos 1. Avaliar a imunogenicidade das vacinas gênicas (LAMP/gag, gag e LAMP) iniciando a imunização em período neonatal em camundongos pela produção de anticorpos anti-gag, número de células produtoras de IFN-γ de aos pools de peptídeos da Gag, produção de citocinas ao peptídeo imunodominante da Gag restrito ao reconhecimento por moléculas de classe I do MHC, potencial citotóxico de células T CD8+ e a resposta de memória imunológica após imunização neonatal; 2. Avaliar o efeito da imunização materna com as vacinas gênicas, antes da concepção, na transferência de citocinas e anticorpos anti-gag pela via transplacentária e pela amamentação à prole e na resposta humoral e celular da prole vacinada em período neonatal; 3. Avaliar se a imunização intravenosa com as vacinas gênicas durante a gestação é capaz de induzir a expressão do RNAm de Gag nos tecidos da prole e sensibilizar a prole de camundongos. 36

38 Material e Métodos

39 3 Material e métodos 3.1 Animais Camundongos isogênicos BALB/c, fêmeas e machos, de aproximadamente 6-8 semanas de idade, mantidos em condições livre de patógenos específicos (SPF specific pathogen free) foram adquiridos do Biotério do Centro Multidisciplinar para a Investigação Biológica (CEMIB) da Universidade de Campinas (UNICAMP). As proles, de ambos os sexos, obtidas dos acasalamentos foram utilizadas em idade variável. 3.2 Plasmídeos O plasmídeo utilizado foi o pitr que é um vetor de expressão de proteínas de mamíferos que contém a região promotora do citomegalovírus (CMV) e regiões terminais invertidas (ITR) do vírus adeno-associado (AAV) que flanqueam os elementos de expressão (Marques et al., 2003). O plasmídeo denominado gag (p55gag) foi construído através da clonagem da seqüência da proteína de 55 Kd do gene gag da cepa HXB2 do HIV-1 (nucleotídeos 1 ao 1503 de acordo com GenBank KO3455; HIV sequence Database, 1997, Los Alamos National Laboratory Theoretical Biology and Biophysics, Los Alamos, NM) no vetor pitr. O plasmídeo quimera LAMP/gag foi construído através da inserção da seqüência p55gag entre o domínio luminal e a porção citoplasmática e transmembrânica da LAMP-1 (Marques et al., 2003), vide Figura 1. As seqüências da LAMP-1 (GenBank JO3881) também foram clonadas e inseridas no pitr (De Arruda et al., 2004). Os plasmídeos foram obtidos através da transformação da cepa DH5α de Escherichia coli (Invitrogen, Calsbad, CA) e purificados de acordo com recomendações do fabricante das colunas livre de endotoxina (Qiagen Inc., Valencia, CA). Os plasmídeos foram gentilmente cedidos pelo Dr. Ernesto Marques Jr do 38

40 Departamento de Farmacologia e Ciências Moleculares da Escola de Medicina da Universidade Johns Hopkins, Baltimore, Maryland, EUA. Plasmídeo p55gag ITR p55-gag ITR ITR DL p55-gag DTM/Cit ITR Plasmídeo Lamp1/p55gag ITR DL DTM/Cit ITR Plasmídeo Lamp Figura 1 Representação esquemática dos plasmídeos a serem utilizados neste estudo. Os vetores de plasmídeo contêm regiões terminais invertidas de repetição (ITR inverted terminal repeats) do vírus adenoassociado flanqueando os elementos de expressão. A caixa cinza representa a região de início de leitura (ORF open reading frame) do domínio luminal da proteína associada à membrana lisossomal 1 (LAMP-1), a caixa cinza listrada representa as ORFs do domínio transmembrânico (TM) e citoplasmático (cit) da LAMP-1. A caixa preta representa a ORF da proteína de 55 Kd codificada pelo gene gag do HIV-1 (p55gag) (Marques et al., 2003). 3.3 Expressão das proteínas LAMP/gag e Gag As células HEK-293 foram transfectadas com os plasmídeos pitr-lamp/gag, pitr-gag e pitr-lamp com o reagente de transfecção Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen, CA, EUA). Resumidamente, células da linhagem HEK-293 (células renais humanas transformadas com DNA adenovirus 5) foram distribuídas (1x10 6 células/poço) em placas de 6 orifícios (Nunc, Roskilde, Denmark) e incubadas por 24 horas a 37 ºC e 5% CO 2. Após confluência de 90% das culturas, as células foram lavadas com meio RPMI e incubadas com o reagente Lipofectamine TM 2000 e com 4 µg de DNA por 48 horas a 37 ºC e 5% CO 2. Posteriormente, as células foram incubadas a 4 ºC por 15 minutos com tampão de lise e inibidor de protease (Calbiochem Corporation, CA, EUA) e a concentração protéica do pellet celular determinada pelo método de Bradford. O controle negativo utilizado foi célula HEK-293 não transfectada. A identificação das proteínas das células transfectadas com os plasmídeos foi realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida e imunotransferência. As amostras e padrão de 39

41 peso molecular (10 à 220kDa; Invitrogen) foram submetidas à eletroforese gel de poliacrilamida a 10% e transferidos para membranas de polivinilidene fluoride (PVDF, Immobilon Millipore, Bedford, MA, EUA). As membranas foram bloqueadas por 2 horas com PBS contendo 5% de leite desnatado em pó (Molico, Nestlé, SP, Brasil). Após lavagem com PBS 0,05% Tween, foi acrescentado o anticorpo monoclonal de camundongo IgG anti-gag ou anticorpo monoclonal de rato anti-lamp (cedido por Dr. Ernesto Marques, Johns Hopkins, Baltimore, MD) e incubado por 2 horas a temperatura ambiente. Após lavagens, anticorpos anti-camundongo ou anti-rato conjugado a peroxidase (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove, PA) foram incubados por 1 hora à temperatura ambiente. Posteriormente, a membrana foi revelada com substrato quimioluminescente SuperSignal (Pierce, Rockford, IL, EUA), exposta em filme de raio-x em cassete e revelado em processador (X-OMAT 450RA Processor, Kodak, Fotodyne, Hartland, WI, EUA). As bandas de peso molecular referentes às proteínas Gag (55Kd), LAMP/gag (220Kd) foram avaliadas. 3.4 Protocolo de imunização neonatal A imunização dos camundongos foi realizada com 1µg ou 5µg de DNA plasmideal que contém as seqüências gênicas LAMP/gag; gag nativa ou Lamp. Os camundongos neonatos receberam a primeira dose aos sete dias de idade pela via subcutânea (sc) com os plasmídeos em 20 µl de salina estéril e a segunda dose no 25º dia após imunização (dai) pela via intradérmica (id). Os animais foram sangrados pelo plexo retro-orbital no 20º ou 35º dai, o soro estocado a -70 C e os respectivos baços foram coletados no 35º dia de idade para execução dos ensaios funcionais. Para avaliar a resposta de memória imunológica, alguns grupos após imunização neonatal, foram sangrados a cada 30 dias e reforçados por via id com 25µg da vacina aos 260 dias de idade (di) e avaliados após 10 dias. 40

42 Grupo de Imunização Neonatal (proveniente de mãe não imunizada) A) Grupo LAMP/gag+LAMP/gag (LG+LG): proles submetidas à imunização neonatal com 1 ou 5µg de LAMP/gag aos sete dias de idade e no 25º dia de idade; B) Grupo gag+gag (G+G): proles submetidas à imunização neonatal com 1 ou 5µg de p55gag nativo aos sete dias de idade e no 25º dia de idade; C) Grupo LAMP/gag+gag (LG+G): proles submetidas à imunização neonatal com 1µg de Lamp /gag aos sete dias de idade e com 1µg de gag no 25º dia de idade; D) Grupo gag+ Lamp /gag (G+LG): proles submetidas à imunização neonatal com 1µg de gag aos sete dias de idade e com 1µg de LAMP/gag no 25º dia de idade; E) Grupo Lamp + Lamp (L+L): proles submetidas à imunização neonatal com Lamp aos sete dias de idade e no 25º de idade. Alguns grupos adicionais foram imunizados com as vacinas LAMP/gag e gag apenas no 25º de idade. 41

43 Protocolo de Imunização neonatal x gestação/ nascimento 1-5 µg(sc) análise 1-5 µg(id) análise dias de idade (di) análise: coleta de sangue e/ou de baço para os ensaios sc: subcutânea / id: intradérmica Protocolo de Imunização neonatal e análise de memória aos 6 meses de idade x gestação/ 1-5 µg(sc) 1-5 µg(id) 25 µg(id) Análise nascimento análise: coleta de sangue e/ou de baço para os ensaios sc: subcutânea / id: intradérmica Protocolo de Imunização neonatal e análise de memória aos 9 meses de idade x gestação/ 1-5µg(sc) 1-5µg(id) nascimento di análise: coleta de sangue e/ou de baço para os ensaios sc: subcutânea / id: intradérmica 25 µg(id) Análise 42

44 3.5 Protocolo de imunização adulta e/ou materna Camundongos BALB/c fêmeas de 8-10 semanas foram imunizados de acordo com o protocolo de imunização descrito por De Arruda e colaboradores (2004). As fêmeas receberam pela via id 50 µg de plasmídeo (plasmídeo LAMP/gag; gag ou Lamp) em 50 µl de solução salina estéril e após 20 dias, foram submetidas a um reforço pela mesma via com 50 µg do respectivo plasmídeo, e analisadas 10 dias após o reforço (protocolo de imunização na idade adulta). Outros grupos de fêmeas foram acasalados no 21º dia após a imunização com camundongos machos BALB/c não imunizados e permaneceram com o macho por um período de 13 dias (imunização materna). Grupo de Imunização Adulta/Materna A) Grupo LAMP/gag+ LAMP/gag (LG+LG): fêmeas imunizadas e reforçadas com 50 µg de LAMP/gag foram acasaladas no 21º dia após imunização ou analisadas após 30 dias da imunização; B) Grupo gag+gag (G+G): fêmeas imunizadas e reforçadas com 50 µg de gag, acasaladas ou analisadas conforme item A; C) Grupo controle Lamp+Lamp (L+L): fêmeas imunizadas e reforçadas com 50 µg de Lamp, acasaladas ou analisadas conforme item A. 43

45 Grupo de Imunização Neonatal (proveniente de mãe imunizada) D) Grupo LAMP/gag+LAMP/gag (LG+LG): proles de mães imunizadas com LAMP/gag foram submetidas à imunização neonatal com 1 ou 5 µg de LAMP/gag aos sete dias de idade e aos 25 dias de idade; E) Grupo gag+gag (G+G): proles de mães imunizadas com gag foram submetidas à imunização neonatal com 1 ou 5 µg de p55gag nativo aos sete dias de idade e aos 25 dias; F) Grupo gag+gag (G+G): proles de mães imunizadas com LAMP/gag foram submetidas à imunização neonatal com 1 ou 5 µg de p55gag nativo aos sete dias de idade e aos 25 dias; G) Grupo Lamp + Lamp (L+L): proles submetidas à imunização neonatal com Lamp aos sete dias de idade e aos 25 dias. 44

46 Protocolo de Imunização Adulta/Materna (via id) 50 µg(id) 50 µg(id) Análise análise: coleta de sangue e/ou de baço para os ensaios Protocolo de Imunização Materna (via id) 50 µg(id) 50 µg(id) cesárea * x gestação prole(f1) amamentação (5 dias) dai nascimento 0 5 di (coleta do leite) x : acasalamento com BALB/c macho não imunizado daí: dia após a imunização cesárea*: na gestação a termo (21 dias de gestação ) foi coletado o soro fetal, líquido amniótico, soro materno prole (F1): coleta de leite materno do estômago de neonato de 5 dias de idade (di) Protocolo de Imunização Materna para análise de transferência de anticorpo para prole 50 µg(id) 50 µg(id) x gestação prole(f1) dai nascimento di análise: sangria x : acasalamento com BALB/c macho não imunizado dai: dias após a imunização prole (F1) não imunizada: coleta de sangue aos 30, 60, 90 e 120 dias de idade (di) 45

47 Protocolo de Imunização Materna e de Imunização neonatal 50 µg(id) 50 µg(id) 1 ou 5 µg(sub) 1 ou 5 µg(id) análise x gestação prole(f1) dai nascimento di x : acasalamento com BALB/c macho não imunizado dai: dias após a imunização prole (F1) imunizadas: análise aos 35 dias de idade (di) (sangria e coleta de baço), alguns camundongos imunizados na idade neonatal foram deixados para analisar resposta de memória imunológica e foram sangrados no 60º di. análise: coleta de sangue e de baço para os ensaios Protocolo de Imunização Materna e Imunização neonatal para análise de resposta de memória aos 6 meses de idade 50 µg(id) 50 µg (id) 5 µg(sub) 5 µg(id) 25 µg análise x gestação prole(f1) dai nascimento di x : acasalamento com BALB/c macho não imunizado dai: dias após a imunização prole (F1) imunizadas: análise aos 180 dias de idade (di) (sangria e coleta de baço). análise: coleta de sangue e de baço para os ensaios 46

48 3.6 Protocolo de imunização intravenosa materna no período gestacional Camundongos BALB/c fêmeas de 8-10 semanas foram acasalados e imunizados intravenosamente pelo plexo retro-orbital na terceira semana do período gestacional com 100µg de plasmídeo (LAMP/gag; gag ou LAMP) em 300 µl de salina estéril. Proles de 1 dia de idade foram sacrificadas para coleta de tecidos fetais (baço, timo, coração, pulmão, fígado) para análise da presença do RNA mensageiro do DNA vacinal. Outras fêmeas permaneceram com a prole pelo período de 35 dias. Algumas proles foram imunizadas com 5 µg aos 7 dias de idade e analisadas aos 35 dias de idade. Protocolo de Imunização Materna por via iv 100 µg(iv) x gestação nascimento 1 dia de idade (coleta dos órgãos fetais) dias de gestação Protocolo de Imunização Materna via iv e Imunização neonatal 100 µg(iv) 5 µg(sc) análise x gestação nascimento dias de gestação 7 35 dias de idade x : acasalamento com BALB/c macho não imunizado prole (F1) imunizadas: análise aos 35 dias de idade (di) (sangria e coleta de baço), análise: coleta de sangue e de baço para os ensaios 47

49 3.7 Obtenção de células esplênicas O baço dos camundongos foi obtido assepticamente e macerado em peneiras de nylon de 0,40µm (Cell strainer, BD&Pharmingen, San Diego, CA, EUA) sob uma placa de petri contendo meio de cultura RPMI A suspensão de células mononucleares foi obtida por centrifugação em gradiente de Ficoll-Hypaque, densidade de A suspensão de células foi lavada por duas vezes em meio de cultura RPMI 1640 e a concentração celular obtida em contador automático (Cell Dyn 1400, Abbott) e ajustada de acordo com o ensaio a ser realizado. A viabilidade celular foi observada com auxílio do corante Azul de Tripan. 3.8 Freqüência de células esplênicas produtoras de IFN-γ (ELISpot) Para avaliação de células esplênicas secretoras de IFN-γ por ELISpot, foi utilizado o kit (BD&Pharmingen, San Diego, CA, EUA), como descrito por De Arruda e colaboradores (2004). Microplacas de 96 poços com suporte de membrana de nitrocelulose (Millipore, Bedford, MA, EUA), foram previamente incubadas com 5 µg/ml de anticorpos anti- IFN-γ (clone RA-6A2) durante 18 à 20 horas à 4 ºC. Posteriormente, as placas foram lavadas com tampão PBS, bloqueadas com PBS contendo 10% de soro fetal bovino (SFB, Hyclone III, Lotan CT, EUA) durante 2 horas a temperatura ambiente. As placas foram lavadas novamente e células esplênicas (0.5x10 6 céls/orifício) em meio RPMI 1640 suplementado (RPMI-S) com 1% de SFB foram distribuídas nos poços e incubadas na presença ou não de 10 µg/ml de 25 conjuntos (pools) de peptídeos de 15 aminoácidos (com sobreposição de 11 resíduos) representantes da proteína gag do subtipo B do HIV-1, [HIV-1 Consensus Subtype B Gag (15-mer) Peptides - Complete Set/NIH AIDS Research and Reference Reagent Program] ou com 1µg/mL de anticorpo anti-cd3 NA/Le (BD&Pharmingen, San Diego, CA, EUA) durante 18 hrs à 37 ºC e 5% de CO 2. Lavagens com PBS-Tween 0,1% foram procedidas e posteriormente as microplacas foram incubadas com 2µg/mL de anticorpo monoclonal biotinilado anti-mouse-ifn-γ (PharMingen, San Diego, CA) durante 2 48

50 horas a temperatura ambiente. Uma nova série de lavagens em PBS-Tween 0,1% foi realizada seguida de uma incubação por 1 hora à 37º C com avidina-hrp (Pharmingen) diluída 1:100. As placas foram lavadas com PBS-Tween 0,1%, incubadas por minutos à 37 ºC com o substrato AEC (Calbiochem, San Diego, EUA), em seguida foram lavadas com água destilada e, uma vez secas, os spots foram quantificados em contador automático C.T.L. (Cellular Technology, OH, EUA) e referidos como número de células formadoras de spot (Spot foming cell SFC) por 0,5x10 6 células. Os dados foram avaliados pelo número de células formadoras de spot /0.5x10 6 obtidas por cada estímulo subtraída do número de SFC sem estímulo, contados no contador automático CTL ImmunoSpot S4 Analyzer utilizando o software ImmunoSpot 3.2 (C.T.L., Cleaveland, OH, EUA). Foi considerado positivo quando o número de SFC foi superior ou igual a 10 SFCx0.5x10 6 células. Peptídeos da Gag do HIV-1 consenso subtipo B (15aa) - os pools de peptídeos foram organizados conforme seguem: 1 aa 1-31; 2 aa 21-51; 3 aa 41-67; 4 aa 61-91; 5 aa ; 6 aa ; 7 aa ; ; 9 aa ; 10 aa ; 11 aa ; 12 aa ; 13 aa ; 14 aa ; 15 aa ; 16 aa ; 17 aa ; 18 aa ; 19 aa ; 20 aa ; ; 21 aa ; 22 aa ; 23 aa ; 24 aa ; 25 aa (aa: aminoácidos) 3.9 Cultura de células para obtenção de sobrenadantes A suspensão de células esplênicas (4x10 6 células/ml) em meio RPMI contendo 10% de SFB foi distribuída em 100 µl/poço de microplacas de 96 orifícios e incubadas com 100 µl de meio RPMI-10% SFB ou 10 µg/ml de epitopo do gene gag AMQMLKETINNAAEE restrito a classe I do MHC (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, EUA) ou com anticorpo monoclonal de hamster anti-cd3 de camundongo (1 µg/ml, PharMingen) a 37 ºC e 5% de CO 2. Os sobrenadantes das culturas foram coletados após incubações de 72 horas, centrifugados a 1000rpm por 5 49

51 minutos a 10 ºC, aliquotados e congelados a 70 ºC para posterior dosagem das citocinas Determinação da concentração de citocinas pró-inflamatórias por citometria de fluxo A dosagem de citocinas de IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ, TNF-α e IL-12p70 no sobrenadante de culturas de esplenócitos foi realizada por citometria de fluxo utilizando o Kit Mouse Inflamation Kit Cytometric Bead Array (CBA, BD Pharmingen, CA, EUA). As amostras de sobrenadantes e a curva de concentração padrão foram incubadas com microesferas de captura recobertas com anticorpos específicos para as respectivas citocinas e com o anticorpo de detecção marcado com ficoeritrina (PE). Após as incubações, foi acrescentado 1mL da solução de lavagem e centrifugado por 10 minutos a 1100 rpm. Retirou-se o sobrenadante e com 300 µl da solução de lavagem ressuspendeu-se as amostras para as aquisições no citômetro de fluxo. As aquisições das amostras foram realizadas no citômetro BD FACS Calibur (BD&Bioscience) e os resultados foram gerados em formato gráfico e tabular utilizando BD CBA Analysis Software (BD&Bioscience). O limite de detecção fornecido pelo fabricante é de 5 pg/ml (IL-6), 17.5 pg/ml (IL-10), 52.7 pg/ml (MCP-1), 2.5 pg/ml (IFN-γ), 7.3 pg/ml (TNF-α) e 10.7 pg/ml (IL-12p70) Detecção de anticorpos por ELISA Anticorpos anti-gag foram detectados por ensaio imunoenzimático (ELISA) modificado de Marques e colaboradores (2003). Os orifícios de microplacas MaxiSorp de 96 poços (Greiner, Alemanha) foram sensibilizados com 5 µg/ml do lisado de HIV (ABI, Rockville, MD, EUA) em tampão carbonato-bicarbonato 0,1 M (ph 9.5) por 18 horas à 4 ºC. A solução foi retirada e as microplacas lavadas por seis vezes em PBS. As microplacas foram bloqueadas com PBS- 0.5% de gelatina (Oetker, São Paulo, Brasil), por 1 hora à 37 ºC. Em seguida, as placas foram lavadas por três vezes com PBS e 50

52 incubadas com diluições seriadas do soro em PBS contendo 0.25% de gelatina (IgG a partir de: 1:100; IgG1,IgG2a, IgG2b, IgG3: a partir de 1:50) por 18 hrs à 4 ºC. Após esta etapa, foram lavadas novamente em PBS-T contendo 0.1% de Tween 20 (PBS-T) e incubadas com anticorpo biotinilado anti-γ, anti-γ1, anti-γ2a, anti-γ2b e anti-γ3 (SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, EUA) por 1 hora à 37 ºC. Em seguida, depois de novas lavagens, foi adicionado às placas estreptoavidina peroxidase (Sigma- Aldrich, St Louis, MO, EUA) e incubada por 30 minutos à 37 ºC. Posteriormente, a atividade enzimática foi detectada pela adição de 100 µl de tetrametilbenzidina (TMB, Calbiochem, Darmstadt, Germany) aproximadamente de minutos à temperatura ambiente. A reação foi neutralizada pela adição de ácido sulfúrico 1M. A leitura foi realizada a 450 nm em leitor de microplaca de Elisa (Molecular Devices, CA, EUA) Dosagem de TGF-β1 A determinação de TGF-β1 no leite materno foi realizada por ELISA seguindo as recomendações do fabricante (Promega Corporation, Madison, WI, EUA). Os orifícios das microplacas de 96 poços (Costar) foram sensibilizados com anticorpo monoclonal anti-tgf-β1 na diluição 1:100 em tampão carbonato-bicarbonato 0,1 M (ph 9,5) e incubadas a 4º C por um período de 20 horas. As microplacas foram decantadas e bloqueadas com uma solução de bloqueio (Promega, Kit TGF-β) na diluição 1:5 por 35 minutos à temperatura ambiente. Após este procedimento, diluições das amostras e da respectiva citocina recombinante foram incubadas por 1 hora e 30 minutos à temperatura ambiente sob agitação constante. Ao término deste período, as placas foram lavadas com tampão Tris-HCl/NaCl/0,05%-Tween 20 (ph 7,6) e o anticorpo secundário anti-tgf-β1 na diluição 1:10 foi adicionado e incubado por 2 horas à temperatura ambiente sob agitação constante. Após novas lavagens foi adicionado anti-tgf-β1/hrp e as placas foram incubadas por 2 horas à temperatura ambiente sob agitação constante. A reação foi desenvolvida com a adição de TMB e bloqueada com ácido fosfórico 1,0 M. A leitura foi realizada a 450 nm em leitor de microplaca de ELISA (Biorad, EUA). As concentrações foram obtidas pela interpolação 51

53 dos valores de densidade óptica (DO) das amostras na curva padrão. O limite de detecção de TGF-β1 foi de 32 pg/ml Quantificação de células CD8+ antígeno específicas Animais imunizados no período neonatal receberam uma injeção contendo 20 µg/ml do peptídeo da Gag restrito ao MHC de classe I AMQMLKETI em 50 µl de adjuvante (Titermax gold, TiterMax, EUA) por via intraperitoneal (ip). Cinco dias após a segunda injeção ip, as células do baço foram coletadas e incubadas com pentâmero H-2K d /AMQMLKETI conjugado à PE e com anti-cd8 conjugado à FITC (ProImmune, USA) por 30 minutos. Após lavagens, as células foram analisadas por citometria de fluxo ( eventos no citômetro Coulter Epics XL) e o resultado expresso por porcentagem de células CD8+pentâmero Fenotipagem das células CD8+ Para determinação da população de memória efetora as células esplênicas foram incubadas com o peptídeo 10 µg/ml do peptídeo imunodominante restrito a classe I (AMQMLKETI) por 4 dias com adição de 5 U/mL de IL-2 murina recombinante (BD&Pharmingen), 5 ng/ml de IL-15 murina recombinante (Peprotech, New Jersey, EUA) e 2ng/mL de IL-7 murina recombinante (Peprotech). Anticorpos monoclonais anti-cd8, anti-cd44, anti-cd127, anti-cd69 conjugados a FITC, PE ou PC5 foram utilizados com seus respectivos controles isotípicos (BD&PharMingen). Células (5,0 x 10 5 ) foram incubadas com anticorpos anti-cd16/32 (Fc block) por 5 minutos a 4 o C e posteriormente por 30 minutos a 4 ºC com os anticorpos monoclonais marcados diluídos em PBS contendo 1,0% SAB e 0,1% de azida sódica. O número relativo de cada população foi adquirido utilizando eventos em aparelho de citometria de fluxo (Coulter- Epics XL). 52

54 3.15 Análise de células CD8+ secretoras de IFN-γ, TNF-α:, IL-2, Perforina e Granzima Para determinação intracelular de citocinas as células esplênicas foram incubadas com o peptídeo AMQMLKETI (10 µg/ml) e Brefeldina A (10 µg/ml, Sigma) em meio RPMI-S por 14 hrs a 37 ºC e 5% de CO 2. Após a incubação, as células foram coletadas e lavadas com solução PBS contendo 0,1% de azida sódica. Posteriormente, as células foram marcadas com anticorpos monoclonais anti-cd8 conjugado a PC5 ou anti-cd8 PC5 e anti-lamp-1 FITC por 30 minutos a 4 ºC. Em seguida, as células foram lavadas com PBS-SAB e fixadas com PBS contendo 4% de formaldeído (Merck). Após mais uma lavagem, as células foram permeabilizadas com PBS-SAB (Sigma) contendo 0,5% de saponina (Sigma) e anticorpos monoclonais anti- TNF-α FITC e anti-ifn-γ PE ou anti-ifn-γ PE e anti-il-2 FITC, ou com anti-perforina PE ou anti-granzima PE ou anticorpos isotípicos (PharMingen) por 40 minutos/escuro/4 ºC. As células foram lavadas e ressuspendidas em PBS-SAB. Foram utilizados anticorpos conjugados ao isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE) ou ficoeritrina-cianina 5.1 (PC5) com seus respectivos controles isotípicos (PharMingen). Foram adquiridos eventos por amostra em citômetro de fluxo (Coulter- Epics XL). Os resultados foram expresssos pela porcentagem de células CD8+ que coexpressam IFN-γ/TNF-α ou IFN-γ/IL-2. E quanto a porcentagem de células CD8+ que co-expressam LAMP+/Perforina ou Granzima Quantificação de células T CD4+CD25+FoxP3+ Esplenócitos (1x10 6 ) foram incubados com os anticorpos monoclonais anti- CD4 conjugado a PerCP (Pharmingen), anti-cd25 conjuntado ao PE (Pharmingen), ou com seus respectivos controles isotípicos, por 30 minutos a 4ºC. Posteriormente, as células foram fixadas com paraformaldeído 4% por 10 minutos a 4 o C e lavadas com tampão PBS 1% SAB. Posteriormente, as células foram incubadas com anti-foxp3- FITC (e-bioscience) em tampão PBS/0,5%Saponina (Sigma) por 30 minutos a 4 o C. 53

55 Após nova lavagem, as células foram ressuspendidas em solução isotônica e a porcentagem da população CD25+FOXp3+ no baço foi determinada após aquisição de eventos dentro da região de células T CD4+ por citometria de fluxo (BD FACSCalibur, Cell Quest PRO) Dosagem das citocinas e quimiocinas por microesferas recobertas com anticorpos (multiplexed bead-based immunoassay - xmap TM ) em citômetro de fluxo Microesferas de captura recobertas com anticorpos monoclonais para as citocinas e quimiocinas: IL-4, IL-7, IL-10, IL-15, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α, IP- 10, MCP-1, MIP-1α e RANTES foram incubadas com as amostras biológicas de acordo com as especificações do fabricante. O método Lincoplex foi realizado pela empresa Genese, São Paulo. Brevemente, microplacas de 96 poços com membrana de filtro (Millipore, Bedford, MA, EUA) foram bloqueadas por 10 minutos com SFB. As amostras e padrões utilizados foram incubados com a mistura das beads por uma hora a temperatura ambiente sob agitação. Após série de lavagens a placa foi incubada com estreptoavidina conjugada a ficoeritrina (SAPE) durante 45 minutos no escuro, a temperatura ambiente e em constante agitação. A placa foi submetida então a outra série de lavagens e ressuspendidas em tampão de lavagem para leitura em citômetro de fluxo Luminex100 IS System (Luminex Corporation, Austin, EUA). O limite de detecção foi de 3.2 pg/ml para todos os analitos Coleta dos órgãos de neonato Os órgãos (timo, baço, coração, pulmão e fígado) dos camundongos de 1 dia de idade foram coletados assepticamente e macerados em tela de nylon (BD&Pharmingen, San Diego, CA, EUA) em placa de petri contendo meio de cultura RPMI A suspensão de células foi centrifugada e lavada por duas vezes em RPMI 1640 e armazenadas a -70 ºC até a extração do RNA. 54

56 3.19 Extração de RNA, obtenção do cdna e reação semi-quantitativa de PCR em tempo real (Real-Time PCR) O RNA total dos tecidos de neonatos de mães imunizadas por via intravenosa com as vacinas foi extraído com kit QIAmp RNA blood (Qiagen, Valencia, CA, EUA) seguindo as orientações fornecidas pelo fabricante. Para obtenção de cdna partiu-se do RNA total purificado utilizando a metodologia do kit Sensiscript Reverse Transcriptase (Qiagen). A reação de amplificação em tempo real foi realizada com 1 a 10 µg amostra de cdna, 25 µl da solução Platinum SYBR Green qpcr SuperMix-UDG (Invitrogen), 1 µl de ROX Reference Dye, 12 µl de água destilada estéril e 10 µm dos primers. A síntese dos primers para Gag F5 -AGGAGCCACCCCACAAGATTTA 3 ; R5 -TGGCCGGGTCCTCCTACTC-3 (Chikhlikar et al., 2004) foi realizada pela Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). As amostras foram incubadas durante 10 minutos a 95 o C e 45 ciclos de 15 segundos a 95 o C, 30 segundos a 60 o C e 30 segundos a 72 o C cada, em termociclador icycler (BioRad, EUA). Os dados obtidos foram interpretados com o programa icycler iq Program (BioRad). Os resultados representam o CT (cycle threshold) do gene de interesse Análise estatística Os resultados foram analisados pelo teste estatístico Mann-Whitney quando comparados dois grupos e pelo teste Kruskall-Wallis com pós-teste de Dunn s quando foram comparados três ou mais grupos. Os resultados foram considerados estatisticamente diferentes quando *P<0.05; **P<0.01 e ***P<

57 Resultados

58 4 Resultados 4.1 Expressão da proteína Gag em células HEK-293 transfectadas com as vacinas gênicas Para procedermos a imunização de camundongos neonatos com as vacinas LAMP/gag e gag, avaliamos inicialmente a expressão da proteína por western blot após a transfecção de células HEK-293 com os plasmídeos pela técnica de lipofecção utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Detectamos a proteína Gag com anticorpos IgG anti-gag pela identificação da banda de 55 kda e a quimera LAMP/gag em bandas protéicas de aproximadamente 220 kda ou superiores (Figura 2). Estas bandas são atribuídas à multimerização de Gag em altas concentrações, já as bandas abaixo de 200 kda são atribuídas à proteólise da proteína quimérica (Marques et al., 2003). A transfecção das células com LAMP/gag resultou em uma banda mais intensa de proteína em relação às células transfectadas com gag. Vale ressaltar que as transfecções foram realizadas em condições similares quanto a concentração de plasmídeo, número de células nas transfecções e na concentração das proteínas provenientes da lise das células transfectadas submetida a eletroforese. 57

59 Figura 2 Expressão de Gag por células HEK-293 transfectadas com os plasmídeos pitrgag e pitr-lamp/gag. As células HEK 293 foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 com os plasmídeos contendo os genes gag nativo e LAMP/gag e as proteínas sintetizadas por estas células foram submetidas a eletroforese em gel de poliacrilamida e imunotransferência para membrana de PVDF e reveladas com IgG anti-gag através da técnica de Western Blot. Coluna (1): lisado viral de HIV-1; (2): 20µ g de proteína de lisado de células HEK não transfectadas com plasmídeos; (3) e (4): 20µ g de proteína de lisado de células HEK transfectadas com plasmídeos gag nativo provenientes de diferentes extrações; (5) e (6): 20 µg de proteína de lisado de células HEK transfectadas com plasmídeos LAMP/gag provenientes de diferentes extrações. 58