NORMAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAMPA CAMPUS ITAQUI DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA DO SOLO NORMAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA As aulas práticas de Microbiologia têm como objetivo ensinar ao acadêmico os princípios gerais e métodos utilizados no estudo de microbiologia. Nestas aulas utilizaremos uma variedade de fungos e algumas bactérias ambientais, porém é essencial que as normas sejam seguidas, a fim de se evitar contaminações acidentais. 01- O uso do jaleco/avental é obrigatório. 02- Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interferir com reagentes e equipamentos. 03- Limpar e desinfetar a superfície das bancadas antes e depois de cada aula prática. 04- Lavar as mãos e calçar luvas de procedimento ao iniciar a análise, lavar as mãos antes de sair do laboratório e sempre que for necessário. Se for portador de algum ferimento nas mãos, procurar não tocar no material. 05- Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a análise. 06- Utilizar exclusivamente material estéril para a análise. 07- No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente a desinfecção e esterilização. O mesmo procedimento deverá ser repetido se ocorrer ferimentos ou cortes. 08- Não comer ou beber no laboratório. 09- Não deixar seus pertences sobre os balcões onde os experimentos serão realizados. 10- Manter canetas, dedos e outros longe da boca. 11- Não utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho. 12- Avisar ao professor em caso de contaminação acidental. 13- Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os deixando sobre a bancada. 14- Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso. 15- Os cultivos após a leitura devem ser encaminhados para esterilização, portanto não os colocar na estufa ou despejar na pia. 16- Colocar os materiais contaminados (pipetas, lâminas e etc) em recipientes apropriados colocados na bancada. 17- Desinfetar a bancada de trabalho com lysoforme ou álcool ou hipoclorito de sódio, ao início e término de cada aula prática. Isto removerá microorganismos que possam contaminar a área de trabalho 18- Seguir as normas de uso de aparelhos. O microscópio deve ser manuseado cuidadosamente e após o seu uso, desligá-lo, limpá-lo, e colocar a capa. 19- Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se não há vazamento de gás ou substâncias inflamáveis por perto. 20- Trabalhe sempre próximo ao fogo, preservando o cuidado pessoal. Obs: Lysoforme é um desinfetante bruto (não diluído), geralmente utilizado em hospitais, pelo seu alto poder de desbacterização apresenta cheiro forte, podendo causar irritação nos olhos, dor de cabeça, dificuldade para respirar, etc.

2 DESINFECÇÃO E ESTERILIZAÇÃO ESTERILIZAÇÃO: Processo que visa a destruição total de todas as formas de vida de um material ou ambiente, através de métodos físicos ou químicos. DESINFECÇÃO: Consiste na destruição, remoção ou redução dos micro-organismos presentes num material inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfície ou local. ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminação a um objeto, superfície ou local. LIMPEZA: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de desinfecção ou esterilização. 1- ESTERILIZAÇÃO: A esterilização é o processo que inativa todos os micro-organismos presentes em determinado material ou ambiente, portanto é o método indicado para uso em itens que de forma alguma podem ser usados quando houver qualquer tipo de contaminação, classificados como críticos, ou seja, aqueles que durante o procedimento penetrarão em pele e mucosa, ou serão introduzidos diretamente na corrente sangüínea, sendo portanto de alto risco. A melhor maneira de garantirmos a destruição de micro-organismos presentes em instrumentos e equipamentos é mediante o uso do calor. A maioria dos micro-organismos que causam infecções em seres humanos desenvolvem-se em temperaturas próximas a do corpo, ou seja, 37ºC. Assim, ao serem expostos a altas temperaturas, são destruídos; o que não acontece quando os colocamos em contato com baixas temperaturas, pois nesse caso o micro-organismo fica apenas inibido, e não é destruído. Alguns micro-organismos produzem esporos, que são formas de resistência, podendo permanecer inativos por longos períodos e depois voltam ao estágio inicial de infectividade. Portanto as técnicas de esterilização devem destruir tanto a célula bacteriana, como os esporos. Existem diversos métodos de esterilização: Físicos ou Químicos. Mas definitivamente os métodos de esterilização mais empregados são os que utilizam o calor, seja este úmido (autoclave) ou seco (estufa, ou forno de Pasteur), sendo que o desempenho do calor úmido (autoclave) é melhor Esterilização por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur) Este tipo de esterilização é realizado a temperaturas de 140ºC a 180ºC, com tempo de exposição de 60 a 120 minutos em estufas elétricas equipadas com termostatos. O calor seco ou ar quente em temperatura suficientemente alta levam a desnaturação e oxidação das proteínas, que resultam na morte dos micro-organismos. A utilização do calor seco leva mais tempo que o calor úmido, mas como existem materiais que não podem ser esterilizados no calor úmido, o calor seco é o preferido. É indicado para esterilizar vidrarias, instrumentos de corte ou de ponta, os quais podem oxidar na presença do vapor da autoclave, e materiais impermeáveis como ceras, pomadas e óleos. Para ser eficiente, este processo depende de: - Aquecimento da estufa até a temperatura desejada antes da colocação do material. - Os materiais devem estar rigorosamente limpos e adequadamente embalados. - A colocação do material deve permitir a circulação do ar, portanto a estufa não pode estar abarrotada de material. Deve ser mantida uma distância de 2 cm entre as caixas. - O tempo de esterilização deve ser contado apenas após a colocação do material na estufa, e a partir do momento em que a temperatura foi atingida novamente.

3 1.2- Esterilização pelo Calor Úmido O calor úmido pode ser utilizado para destruir micro-organismos presentes em materiais através das formas de: vapor d água, água fervente e água aquecida abaixo de seu ponto de ebulição. Água fervente É a água levada a ponto de ebulição: 100ºC, este procedimento destrói os micro-organismos vegetativos presentes no meio líquido. Entretanto, os materiais ou objetos contaminados não são esterilizados com segurança, pois alguns esporos bacterianos podem resistir a 100ºC por mais de 1 hora. Vapor d água O vapor d água sob pressão é a mais prática e segura aplicação do calor úmido. O aparelho destinado a este fim é a AUTOCLAVE. É um processo mais eficiente para destruir os micro-organismos e os esporos, que o calor seco. A autoclavação é feita a 121º C com tempo de exposição de 15 a 30 minutos. A penetração do vapor no material garante maior nível de destruição dos micro-organismos, e por este motivo é mais rápido. Funcionamento da autoclave: 1- A câmara de parede dupla da autoclave é lavada com vapor fluente para remover todo o ar; 2- É então preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e pressão por um período específico de tempo. É essencial que todo o ar residual inicialmente presente na câmara seja completamente substituído por vapor d água, porque se o ar estiver presente reduzirá a temperatura interna da autoclave; 3- A autoclave é usualmente operada a uma pressão de 15 lb./pol², na qual a temperatura do vapor é de 121ºC. A eficiência do processo de esterilização depende de alguns fatores: - Os materiais devem ser limpos antes do processo, sendo adequadamente embalados. - O tempo deve ser contado a partir do momento em que a temperatura de 121ºC é atingida. - A distribuição do material no interior da autoclave deve garantir que o vapor atinja todo o material por igual. - Se o material sair úmido da autoclave indica falhas no processo, neste caso deve ser novamente esterilizado Esterilização por radiação Sua ação esterilizante se processa através da alteração da composição molecular das células, as quais sofrem perda ou adição de cargas elétricas (ionização), ficando carregadas negativa ou positivamente. A esterilização por irradiação é obtida através dos Raios Gama Cobalto à 60 C. É um método eficaz e oferece como vantagens ser altamente penetrante, atravessando o invólucro dos materiais embalados em não tecido ou papel grau cirúrgico e não danifica o material submetido ao processo, por ser frio. Ex: Peças cromadas e artigos termosensíveis. 2- DESINFECÇÃO Este processo pode ser realizado de forma física (Pasteurização) e química (Desinfetantes), e pode ser classificado como sendo uma desinfecção de alto, intermediário ou de baixo nível, dependendo da quantidade de micro-organismos inativados.

4 2.1- Desinfecção por agentes físicos: Temperaturas abaixo de seu ponto de ebulição (100º C) Pasteurização: é o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente para eliminar as células vegetativas de micro-organismos, mas não os esporos. É indicado o uso de temperatura de 77ºC por 30 minutos Desinfecção por agentes químicos: Glutaraldeído: é indicado qualquer objeto sensível ao calor, e para rápida desinfecção de itens reutilizados. É utilizado em solução a 2% com ph alcalino (7,5-8,5) por 30 minutos. Formaldeído (formol): Pode ser encontrado na forma sólida (pastilhas formalina) ou em solução aquosa 37-40% (diluído em álcool ou água). A solução deve ser usada por 30 minutos sendo a concentração de 8% em solução alcoólica e 10% em solução aquosa. Peróxido de Hidrogênio: Age em presença de matéria orgânica e deve-se fazer a imersão do material em solução com concentração de 3-6% por minutos. Ácido Peracético: A concentração de uso é variável para a desinfecção, sendo que o tempo de exposição deve ser no mínimo de 20 minutos. Sua ação esterilizante se dá pela ação oxidante e atua na parede celular e no interior da célula, danificando o sistema enzimático, destruindo o microorganismo. Compostos Clorados: Causa a inibição de reações enzimáticas intracelulares, desnaturação de proteínas e inativação de ácidos nucléicos. Apresentam atividade antimicrobiana de amplo espectro, tem baixo custo e ação rápida, entretanto seu uso é limitado, pois é irritante, instável por 24 horas, fotossensível e volátil, além de ser corrosivo para metais. Seu uso é indicado para artigos de vidro e borracha, sendo contra-indicado para metais (é corrosivo). Apresenta-se na forma líquida (ex: Hipoclorito de sódio) e na forma sólida (ex: Hipoclorito de Cálcio), e o tempo de exposição dos artigos a estes compostos é de aproximadamente 10 minutos. Álcool: Seu mecanismo de ação é através da desnaturação de proteínas. São usados em concentração de 70% peso por 10 minutos, para a desinfecção de superfícies. O uso destas substâncias é contra-indicado para materiais médico-cirúrgicos, borracha, plástico e acrílico. Fenólicos: Seu mecanismo de ação é através do rompimento da parede celular, precipitando proteínas, quando usado em alta concentração, e alteração dos sistemas enzimáticos fundamentais, quando utilizado em baixa concentração. Sua concentração para uso é de 0,4-5% sendo que o tempo de exposição deve ser menor ou igual a 10 minutos. Seu uso é indicado para descontaminação de ambiente hospitalar, itens cirúrgicos e médicos não-críticos, sendo que devem ser consideradas as limitações devido a toxicidade (hiperbilirrubinemia crianças berçários), e ação residual em materiais porosos. Iodóforos: Sua ação é através de seu alto poder de penetração na parede celular, levando a ruptura de proteínas. São utilizados em concentração de 30 a 50 ppm por um tempo menor ou igual a 10 minutos. Compostos de Amônio Quaternário: Age através da inativação de enzimas, desnaturação de proteínas essenciais, ruptura da membrana celular. Sua concentração para uso é de 0,4 a 0,6% por um tempo de no mínimo 10 minutos. É indicado para a limpeza de ambiente hospitalar (pisos, paredes e superfícies). Detergentes: São agentes tensoativos, com ação detergente, umectante e emulsionante. Podem ser classificados como Catiônicos (ex. Quaternários de Amônio), Aniônicos (ex. sabões, detergentes sulfatados ou sulfonados) e Enzimáticos. Este último tem como princípio ativo enzimas proteinases, amilase e lípases e, portanto, causam transformações em proteínas, polissacarídeos e gorduras (ex: Endozime )

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6 MEIOS DE CULTIVO DE micro-organismos Os meios de cultivo, também chamados meios de cultura, são complexos que se destinam ao cultivo artificial de micro-organismos. As técnicas de semeadura permitem que o cultivo destes micro-organismos nos meios de cultura seja eficiente e que as seguintes finalidades sejam atingidas: - crescimento; isolamento; estudo da morfologia colonial; pesquisa de patogenicidade e pesquisa das características bioquímicas. Os meios de cultivo devem conter as substâncias exigidas pelos micro-organismos para o seu crescimento e multiplicação. Para que possam fazer a síntese de sua própria matéria nutritiva devem dispor de: - fontes de carbono (proteínas, açúcares); - fontes de nitrogênio (peptonas); - fontes de energia; - alguns sais inorgânicos, vitaminas e outras substâncias favorecedoras do crescimento. Classificação dos meios de cultivo: - Quanto à consistência: Meios líquidos: são aqueles em que os nutrientes estão dissolvidos em uma solução aquosa. Meios semi-sólidos: são aqueles que possuem na sua composição, além dos nutrientes, uma pequena percentagem de Ágar. São geralmente utilizados em tubos e a partir desse tipo de cultura é possível observar a motilidade bacteriana. Meios sólidos: são aqueles que possuem uma percentagem maior de Ágar (cerca de 15 g/litro de água destilada), além dos nutrientes. Podem ser dispostos em tubos ou em Placas de Petri, dependendo da finalidade. Através do meio sólido em placas de Petri é possível conseguir o isolamento de micro-organismos e, portanto, é o meio ideal para que seja feito o estudo da morfologia colonial. - Quanto à função: Meios simples: possuem os componentes essenciais para o crescimento de micro-organismos pouco exigentes. Ex: caldo simples. Meios de enriquecimento: são adicionadas ao meio simples substâncias enriquecedoras como sangue, soro, ovo, extrato de leveduras, etc. Meios seletivos: aqueles que favorecem o desenvolvimento de determinados micro-organismos em detrimento de outros, geralmente pela adição de substâncias inibidoras. Meios de manutenção: são aqueles destinados a manter a viabilidade de uma cultura bacteriana ou fúngica.