Bactérias anaeróbias

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1 Bactérias Aeróbios Metabolismo na presença de O 2 Obrigatórios Exigem O 2 como aceitador final de electrões Anaeróbios Metabolismo na ausência de O 2 Facultativos Crescem aerobicamente, usando O 2 como aceitador final de electrões e anaerobicamente, obtendo energia pela fermentação de compostos orgânicos Estritos Incapazes de usar O 2 e inibidas por ele Propriamente Estritos Não tolera [O 2 ] maior que 0,5% São membros da flora normal Aerotolerantes Toleram [O 2 ] até 2-8% Responsáveis pela maioria das infs. Bactérias e toxicidade ao O 2 Do metabolismo aeróbio bacteriano resultam espécies reactivas de O 2 peróxido de hidrogénio radicais hidroxilo aniões superoxido Estas espécies reactivas de O 2 tornam-se tóxicas: Causam danos no DNA Destroem componentes lipidicos das células Inactivam enzimas essenciais para as actividades metabólicas Bactérias aeróbias e facultativas têm enzimas protectoras Catalase Peroxidase Superoxido dismutase Conceito clássico toxicidade do O 2 nos anaeróbios dependia da ausência destas enzimas protectoras. Actualmente: Superoxido dismutase Produção induzida pela exposição ao O 2 em Bacteroides e outros Os níveis de enzima são superiores nos Gram- que nos Gram+ Correlacionam-se com o grau de tolerância ao O 2 nos anaeróbios obrigatórios moderados Papel importante na tolerância ao O 2 e na virulência de alguns anaeróbios Catalase Produção demonstrada em Bacteroides, Peptostreptococcus e Propionibacterium Não se correlaciona com a tolerância ao O 2 Peroxidase A sua actividade não foi demonstrada em anaeróbios. As razões pelas quais outros anaeróbios (Clostridium perfringens) são capazes de sobreviver a exposições de O 2 superiores a 72h ou mais apesar da ausência de enzimas protectoras são desconhecidas. 1

2 Bactérias são predominantes no organismo Maioria das inf. são endógenas, provocadas por bactérias que ganham virulência ou passam para locais estéreis onde se tornam patogénicas A identidade dos anaeróbios associados com infs. especificas pode frequentemente ser previsível pelo local do organismo envolvido Passagem através de barreiras muco-cutâneas (trauma ou cirurgia), propagação a partir de zonas contíguas, exp., por aspiração. Algumas inf. são exógenas associadas a agentes esporulados: Botulismo Clostridium botulinum Tétano Clostridium tetani Gangrena Gasosa Clostridium perfringes Processo infeccioso envolve uma mistura de bactérias que actuam por sinergismo de virulência e complementaridade metabólica por vezes, associam-se a bactérias aeróbias que numa 1ª fase lhes fornece alguns metabolitos. SNC Cabeça e pescoço Pleuropulmonar Intra-abdominais Tracto genital feminino Tecidos moles Abcessos cerebrais Abcesso periodontal Outras infs. orais Pneumonia por aspiração Abcessos pulmonares Pneumonia necrosante Peritonites e abcessos Abcessos tubo-ovarianos Abcessos vulvo-vaginais Aborto séptico Gangrena gasosa (mionecrose) Celulite crepitante Fasceite necrosante Colheita de amostras Por aspiração com agulha e seringa Amostra de tecido por biópsia Zaragatoas se possível, devem ser rejeitadas! Mais susceptíveis de contaminação Mais expostas ao O 2 e à dessecação Não permitem a preparação de um bom esfregaço Colheita de pequeno volume de produto para amostra Local Espécimen aceitável Espécimen inaceitável Sangue Sangue Dentes Aspirados endodentarios Aspirados de colecção purulenta Raspados das superfícies gengivais, dos dentes ou mucosa vizinha Faringe Aspirados de abcessos com agulhas Zaragatoa Seios Especimens colhidos por intervenção cirúrgica Irrigação ou aspirados 2

3 perinasais Área pulmonar SNC Área abdominal Tracto genital feminino Aspiração transtraquel Aspirados de colecções purulentas Colheira por operação Aspiração percutânea pulmonar Liquido pleural Aspirado por broncoscópio com protecção terminal LCR Aspirados por paracentese Bile Colheitas por intervenção cirúrgica Culdocentese Colheita cirúrgica Colheita por laparoscopia Espécimen da cavidade endometrial com curette de sucção Expectoração espectorada Aspirados nasofaríngeos Broncoscopia vulgar Aspirado de traqueostomia Conteúdo gástrico, Fezes Amostras intraluminares Zaragatoa rectal Descarga vaginal Amostras cervicais Corrimento colhido com zaragatoa Exsudado do endométrio Tracto urinário Aspirado de urina supra-púbico Urina Tecidos moles Aspirados de feridas profundas Aspirados com agulha através de zonas intactas Colheira cirúrgica Amostra superficial Transporte da amostra Amostras mantidas a 37ºC Evitar refrigeração das amostras leva à diminuição do nº microrganismos viáveis Em caso de atraso de mins entre colheita e processamento Velocidade de transporte tanto maior quanto menor a amostra colhida Usados para pequenas amostras de tecido, fluidos aspirados ou especimens colhidos com zaragatoas Tubos fechados ou frascos com uma atmosfera anaeróbica e base de agar isotonica que mantém ambiente húmido Port-A-Cul system, Anaerobic Transport Médium, Anaport e Anatube Tubos de vidro ou plástico, com sistemas catalíticos para gerar um ambiente anaeróbico depois da zaragatoa ser inserida Vacutainer anaerobic specimen collector, Anaerobic Culturette system Tubos com ambiente anaeróbico e meio de transporte reduzido PRAS, anaerobic transport system, anaerobic transport medium Exame macroscópico Inspecção visual sugerem a presença de bactérias : Purulência Odor pútrido Tecidos necrosados Pus com grãos de enxofre Exame com luz U.V. (360 nm) pesquisa de fluorescência vermelho tijolo: anaeróbios pigmentados Porphyromonas e Prevotella 3

4 Exame microscópico Esfregaço corado pelo Gram observação de morfologia típica de mts bacts Bacteroides bacilo Gram- pouco corado, pleomórfico Fusobacterium bacilo Gram- fusiforme e fino Veillonella coco Gram- pequeno Actinomyces bacilo Gram+ ramificado Clostridium perfringens bacilo Gram+ largo e rectangular Método de Gram - funciona como um controlo de qualidade Se espécimen transportada correctamente Se meio de isolamento foi apropriado Se sistema de incubação anaeróbico foi apropriado Se subcultura anaeróbica foi feita correctamente Se crescimento foi inibido pela presença de outras bactérias ou antibióticos Microscopia de campo escuro e contraste de fase demonstração de espiroquetas Imunoflourescência com anticorpos monoclonais rápida identificação de mts espécies, caro, mts falsos + e, não substitiu cultura Outros procedimentos Cromatografia gás-liquida (GLC) analise directa dos AG de cadeia curta Culturas de sangue com algum valor Analise directa de material purulento pouco sensível e especifico Testes serológicos uso limitado, teste de antigenio do látex para Clostridium difficile Selecção dos meios de cultura Maioria das inf. são polimicrobianas Vai depender tipo de amostra, volume amostra, recursos económicos Meios devem ser frescos e/ou pré-reduzidos Meios não selectivos devem ser enriquecidos com vit K 1 e hemina Agar-sangue crescimento de anaeróbios estritos e facultativos Brucella bacilos Gram- anaeróbios Brain-heart Columbia CDC cocos anaeróbios Schaedler bacilos Gram- anaeróbios, alta dose de glicose, favorece crescimento de organismos sacarolíticos Fastidious Anaerobe agar Fusobacterium Meios selectivos 4

5 BBE agar (Bacteroides bile esculin agar) crescimento selectivo de B. fragilis, ocasionalmente outras bactérias crescem: Fusobacterium, Klebsiella, Enterococcus KVLB agar (agar sangue lisado com vancomicina e kanamicina) crescimento selectivo de Bacteroides e aumenta a produção de pigmento nos Bacteroides pigmentados (Prevotella e Porphyromonas); bacilos Gram- resistentes à kanamicina podem crescer neste meio Agar sangue de carneiro com álcool fenietil crescimento da maioria dos anaeróbios Gram- e +; inibe bacilos anaeróbios facultativos Gram- Agar sangue com colistina e acido nalidixico crescimento dos anaeróbios estritos e facultativos Gram +; maioria das bactérias Gram- são inibidas Caldos se sistema de incubação anaeróbico falhar, a espécimen em cultura não será perdida Meio de tioglicolato enriquecido com hemina e vit K 1 isolamento de anaeróbios de crescimento lento, como Actinomyces Chopped meat broth (caldo de carne) para isolamento de anaeróbios Preparação das amostras para sementeiras Volume liquido concentração por centrifugação, semear o sedimento Zaragatoa extracçao suave num pequeno volume (0,5-1ml) de caldo de tioglicolato; semear o espécimen no meio de cultura usando uma pipeta Tecidos homogeneização em 1ml caldo de tioglicolato suave e rápido, para evitar exposição ao O 2 Usar sempre pipetas e ansas esterilizadas na inoculação dos meios Incubação em anaerobiose Composição habitual 5% H 2, 5% CO 2, 90% N 2 Sistemas produção de anaerobiose: Jarra de anaerobiose Saco de Câmara de Roll tube anaerobiose anaerobiose Custo inicial Moderado Baixo Alto Moderado Custo de Moderado Alto Moderado Moderado manutenção Tempo Baixo Baixo Moderado Moderado Espaço Moderado Pequeno Moderado-grande Moderado Outras características Vantagens Sistemas de válvulas Sistema de evacuaçãosubstituição Sistema gerador de gás Sistema Gás-Pak catalisador palladium e indicador de anaerobiose Simples, conveniente, permite uso de técnicas 1 ou 2 placas, crescimento pode ser detectado examinando as placas pelo saco transparente Placas inspeccionadas a Sistema em anaerobiose por catalisador palladium, reactivo pelo calor a 160ºC/2h, ambiente mantido seco por gel de sílica (pode empobrecer crescimento bact) Placas inspeccionadas a Óptimo p/ espécies extremamente sensíveis ao O 2, não conveniente para isolamento de anaeróbios obrigatórios moderados associados às infs. humanas Tubos inspeccionados a 5

6 Desvantagens convencionais Possibilidade de exposição prolongada das placas ao O 2 durante inspecção/subculturas qq momento sem perturbar as condições de anaerobiose; simples, conveniente, permite uso de técnicas convencionais Uso de apenas 2 placas, possibilidade de exposição prolongada das placas ao O 2 durante subculturas qq momento sob condições de anaerobiose, isolamento segundo técnicas tradicionais Ocupa mt espaço, custo inicial elevado, consumo de tempo elevado qq momento sem perturbar as condições de anaerobiose Tecnicamente difícil, difícil isolamento de estirpes em cultura pura, não permite obs da morfologia celular típica Identificação das bactérias anaeróbicas Presumptiva: TSA colistina, vancomicina, kanamicina Provas bioquímicas - catalase, produção de indol, redução de nitratos, polianetolsulfonato de sódio, crescimento em 20% bile, alanina peptidase, discos verdes brilhantes, urease, licitinase e lipase Testes cromogénios kits de identificação rápida (4-24h) β-glicosidase, β-galactosidase, α- glicosidase, α-fucosidase Definitiva Cromatografia gás-liquida (GLC) analise directa dos ac. gordos de cadeia curta Testes bioquímicos PRAS determinar actividade sacarolítica Placas Presempto testes diferenciais nos quadrantes das placas I, II e III Sistemas rápidos de identificação API 20 A, Minitek system, API-ZYM system Anaeróbios Morfologia Esporos Dupla zona de β-hemolise kanamicina colistina vancomicina Crescimento em 20% bile catalase Alanina peptidase Produção de indol Redução de nitratos urease lipase lecitinase Mobilidade B. fragilis B - - R R R + V + V B. pigmentados CB/B - - R V V V - - V - - B. ureolyticus B - - S S R V - - V Fusobacterium B - - S S R V - - V - - V - - Veillonella C - - S S R - V Peptostreptococcus C - - V R S - V V V C. perfringens B + + S R S V C. difficile B + - S R S Propionibacterium B - - S R S - + +/- +/ Eubacterium CB/B - - S R S - - V

7 Bactérias Bacilos anaeróbios, Gram +, Bacilos, Gram +, não Cocos anaeróbios Gram + Bactérias Gram Actinomyces Actinomyces Mobiluncus Bifidocterium Eubacterium Propionibacterium Lactobacillus Pele e mucosas (oral, TGI, genital) do Homem e animais Mts são oportunistas Inf. graves com risco de vida Crescimento lento Anaeróbios estrictos ou facultativos Produção de inf. crónicas de desenvolvimento lento Desenvolvimento de filamentos ou hifas semelhante aos fungos Crescimento lento em cultura 2 semanas A. israelli, A. meyeri, A. naelundii, A. odontolyticus, A. viscosus Colonizam tracto resp. sup, TGI, TGU feminino Baixa virulência traumatismos, cirurgia, infs. Actinomicose macroscopicamente: grãos de enxofre amarelos ou laranja Cervicofacial, torácica, abdominal, pélvica, SNC Sensíveis à penicilina e resistentes ao metronidazole Propionibacterium Bacilos pequenos Gram + em cadeias curtas Na pele, conjuntiva, ouvido externo, orofaringe, TGU feminino Anaeróbios facultativos ou estritos, imóveis, catalase +, fermentadores de carbohidratos co produção de ác. propriónico P. acnes acne e inf. oportunistas P. propionicus - canaliculite lacrimal e abcessos Lactobacillus Bacilos anaeróbios facultativos ou obrigatórios Boca, estômago e TGU (o + comum na uretra) Frequentemente isolado na urina e sangue Resistente à vancomicina Bacteremia, endocardite, septicemia oportunista Tratamento penicilina + aminoglicosídeo Mobiluncus Anaeróbios obrigatórios de crescimento lento Gram variável ou Gram Bacilos encurvados com extremidades afiladas Classificados como Gram + Parede celular Gram+ Falta de endotoxina Susceptível à vancomicina, clindamicina, eritromicina e ampicilina Resistente à colistina Vaginose bacteriana Bifidobacterium e Eubacterium Orofaringe, cólon e vagina Baixa virulência raramente causam infs. 7

8 Bactérias Bacilos anaeróbios, Gram +, Bacilos, Gram +, não Cocos anaeróbios Gram + Bactérias Gram Eram classificados como Peptostreptococcus Colonizam cavidade oral, TGI, TGU e pele Infs ocorrem qd bacts. Passam destes locais para outros estéreis Tracto resp. sup. sinusite e inf. pleuropulmonares TGI inf. intrabdominais TGU endometrite, abcessos pélvicos, salpingite Pele celulite, infs. tecidos moles Sangue infs. ósseas Dx lab difícil: Necessário meio de transporte para prevenir contaminação com outros agente que colonizem as mucosas Meio de transporte sem oxigénio Meios de cultura nutricionalmente ricos Incubação 5-7 dias Sensíveis à penicilina, metronidazole, imipenem e cloramfenicol Resistentes aos aminoglicosídeos (tds anaeróbios) Anaerococus, Fingoldia, Micromonas, Peptostreptococcus, Schleiferella Colonizam tracto resp.sup, TGI, TGU (prevalentes) Patogénicas possuem catalase e superóxido dismutase toleram exposição ao O 2 Produzem enzimas citotóxicas Causam infs. endógenas Tracto resp. Abcessos cerebrais Intrabdominais Ginecológicas Cutâneas e dos tecidos moles Bacteremia Gastroenterite Meios selectivos Enriquecidos com bile Enriquecidos com sangue lisado estimula produção de pigmento por Prevotella e Porphyromonas Bacteroides bacilos, crescimento estimulado em meios com 20% bile, crescimento rápido (2 dias), sem endotoxinas B.fragillis pleiomórfico, o + virulento, produz BFT e β-lactamases, identificação: Gram e morfologia das colónias Resistência à kanamicina, vancomicina e colistina Crescimento estimulado em meios com 20%bile Fusobacterium bacilos alongados, produzem β-lactamases Porphyromonas bacilos assacarolíticos, bilesusceptivel, pigmentados, produzem β-lactamases Prevotella bacilos pequenos sacarolíticos, bile-susceptivel, pigmentados e não-pigmentados, produzem β-lactamases 8

9 Bactérias Bacilos anaeróbios, Gram +, Bacilos anaeróbios, Gram +, não Cocos anaeróbios Gram + Bactérias Gram Clostridium Anaeróbios estritos Ubiquitários solo, água, TGI de humanos e animais Maioria comensais Capacidade de patogenicidade Sobrevivência em condições adversas pela esporulação Crescimento rápido em meios sem O 2, enriquecidos nutricionalmente Produção Toxinas histoliticas Enterotoxinas Neurotoxinas Clostridium perfringens Bacilos grandes, rectangulares, Gram + Esporos raramente obs (in vivo/in vitro) Imóveis, crescimento típico de bacts. móveis Hemolíticos zona dupla de hemolise pelas toxinas α e β em agar-sangue Produção de toxinas letais: α, β, ε, ι 5 tipos (A-E): A infs. + freq C enterite necrosante Produção de lecitinase (PLC) = α-toxina (lise) Dça por exposição exógena ou endógena Infs. tecidos moles, celulite, miosite supurativa, mionecrose ou gangrenas gasosas, gastroenterite, intoxicação alimentar (autolimitada), enterite necrosante Tratamento penicilina Clostridium tetani Bacilo móvel, com nas extremidades Difícil crescimento anaeróbios estritos Proteoliticos, não fermentam carbohidratos 2 toxinas: Tetanolisina hemolisina, oxigénio-labil Tetanospasmina neurotoxina termo-labil provoca Tétano por desregulação da actividade excitatória neuronial paralisia espástica Vacinação com toxoide tetânico Testes de neutralização antitoxina tetânica Tétano:sistémico, localizado, cefálico,neonatal Clostridium difficile Anaeróbios estritos Infs. endógenas Diarreia pós-antibioterapia Colite pseudomembranosa Produção: Toxina A = enterotoxina Toxina B = citotoxina Hialuronidase Factores de adesão Diagnóstico detecção de enterotoxina ou citotoxina nas fezes Tratamento vancomicina e metanizadole Clostridium botulinum Anaeróbios estritos Crescimento lento Produção de 1 de 7 toxinas (A-G) toxinas botulinicas (termo-labeis) Estirpes que causam dça produzem lipase, proteínas digerem leite, gelatinases, fermentam glicose Dça humana toxinas A, B, E e F Botulismo bloqueio da libertação de Ach paralisia flácida Isolar bacts 10 mins a 80ºC Toxinas inactivadas se 10 mins a ºC 9