Alta prevalência de deficiência de imunoglobulina A detectada por ELISA em pacientes com diabetes mellitus

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1 ARTIGO Original Alta prevalência de deficiência de imunoglobulina A detectada por ELISA em pacientes com diabetes mellitus High prevalence of immunoglobulin A deficiency in patients with type 1 diabetes mellitus detected by ELISA Loraine Farias Landgraf 1, Nelson Augusto Rosário 2, Juliana Ferreira de Moura 3, Katherine Andrew Wells 4, Bonald Cavalcanti Figueiredo 5 RESUMO Objetivo: Medir as concentrações séricas de imunoglobulina A por ensaio imunoenzimático (ELISA) em pacientes com diabetes mellitus tipo 1 (DM-1) e verificar a prevalência da deficiência de imunoglobulina A (DIgA) em pacientes diabéticos. Métodos: A concentração sérica de imunoglobulina A foi determinada em 149 pacientes portadores de DM-1 por três métodos. A DIgA foi definida como sendo nível sérico inferior a 5 mg/dl. Quando os níveis séricos de imunoglobulina A eram indetectáveis por turbidimetria, realizou-se imunodifusão radial em concentração de placa baixa. Para os pacientes em que os níveis séricos de imunoglobulina A foram indetectáveis pelos dois métodos anteriores, a imunoglobulina sérica foi quantificada por ELISA. Em pacientes com DIgA, os níveis de imunoglobulina G e M foram medidos por turbidimetria para excluir outras deficiências humorais. Resultados: Dos 149 pacientes portadores de DM-1 avaliados, 141 (94,6%) tinham níveis séricos normais de imunoglobulina A por turbidimetria. Oito pacientes (5,3%) apresentavam níveis séricos indetectáveis de imunoglobulina A por turbidimetria e imunodifusão radial. Nesses oito pacientes, a determinação sérica de imunoglobulina A foi realizada por um método mais sensível, ELISA. Níveis séricos muito baixos de imunoglobulina A foram detectados nesses pacientes diabéticos. Em todos os pacientes diabéticos, os níveis séricos de imunoglobulinas G e M medidos por turbidimetria foram normais para a idade. Todos os 150 pacientes do Grupo Controle tiveram níveis séricos normais de imunoglobulina A por ELISA. Conclusões: Houve uma prevalência significativamente alta de DIgA entre os pacientes diabéticos tipo 1 (5,3%). A dosagem de imunoglobulina A em todos os pacientes diabéticos do tipo 1 é necessária, especialmente na fase anterior a alguns testes de triagem baseados em anticorpos de imunoglobulina A. Pacientes com DIgA podem ter resultados falsos-negativos para testes de triagem de doença celíaca envolvendo anticorpos antiendomisio e antigliadina. Descritores: Imunoglobulina A; Diabetes mellitus tipo 1; ELISA ABSTRACT Objective: To measure serum levels of immunoglobulin A by immunoenzymatic assay (ELISA) in type 1 diabetes mellitus (DM-1) patients and to verify the prevalence of immunoglobulin A deficiency in diabetic patients. Methods: The serum immunoglobulin A level was determined in 149 DM-1 patients by three methods. Immunoglobulin A deficiency (IgAD) was defined as serum immunoglobulin A level lower than 5 mg/dl. If serum immunoglobulin A level was undetectable by turbidimetry, radial immunodiffusion was performed in low plate concentration. For patients with undetectable serum immunoglobulin A level by the two previous methods, quantification was performed by ELISA. In patients with IgAD, the levels of immunoglobulins G and M were measured by turbidimetry to exclude other humoral immunodeficiencies. Results: Out of 149 DM-1 patients evaluated, 141 (94.6%) had normal serum immunoglobulin A levels by turbidimetry. Eight patients (5.3%) had undetectable serum immunoglobulin A levels by turbidimetry and radial immunodiffusion. In these eight patients, the determination of serum immunoglobulin A was performed by ELISA, a more sensitive method. Very low levels of serum immunoglobulin A were detected in these diabetic patients. In all diabetic patients, immunoglobulins G and M were normal for age by turbidimetry. All 150 patients of the Control Group had normal serum immunoglobulin A levels by ELISA. Conclusions: There was a significantly higher prevalence of immunoglobulin deficiency among DM-1 patients (5.3%). Measurement of serum immunoglobulin A is necessary in all DM-1 particularly before some immunoglobulin A antibody screening. Patients with IgAD may have false-negative results for celiac disease screening tests involving immunoglobulin A antiendomysium and antigliadin antibodies. Keywords: Immunoglobulin A; Diabetes mellitus, type 1; Enzymelinked immunosorbent assay Trabalho realizado no Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná UFPR, Curitiba (PR), Brasil. 1 Mestre pela Universidade Federal do Paraná UFPR, Curitiba (PR), Brasil. 2 Professor titular; Chefe da Divisão de Alergia Pediátrica e Imunologia da Universidade Federal do Paraná UFPR, Curitiba (PR), Brasil. 3 Livre-docente do Institute de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire, Sophia Antinopolis Valbonne (SA), França. 4 Acadêmica de Medicina da University of Tennessee College of Medicine Memphis, Tennessee (MF), United States. 5 Professor-associado, Departamento de Saúde Comunitária da Universidade Federal do Paraná UFPR, Curitiba (PR), Brasil. Autor correspondente: Loraine Farias Landgraf Avenida Sete de Setembro, conj. 305/306 Batel CEP Curitiba (PR), Brasil Tel.: lorainelandgraf@uol.com.br Data de submissão: 31/7/2007 Data de aceite: 15/1/2008

2 Alta prevalência de deficiência de imunoglobulina A detectada por ELISA em pacientes com diabetes mellitus 27 Introdução A deficiência de imunoglobulina A (DIgA) é definida como níveis séricos menores que 5 mg/dl acompanhados de níveis séricos normais ou aumentados de imunoglobulinas G (IgG) e M (IgM) (1). A DIgA é a imunodeficiência primária mais comum, com prevalência descrita entre 1:223 e 1:1.000 em diferentes países (2-4). A prevalência de DIgA na população brasileira é de 1:965 (5). Em pacientes com DIgA, as vias iniciais de diferenciação de células B estão intactas; há expressão normal de IgA na superfície. É possível que o distúrbio imunológico esteja localizado nos plasmócitos produtores de IgA (6,7). Estas células estão presentes em pacientes com DIgA, mas em quantidade reduzida, e seu fenótipo é imaturo. As células B maduras expressam IgA, IgM e IgD na superfície (8). A imunoglobulina A é importante para o controle da exposição do sistema imune aos antígenos ingeridos. O sistema imunológico associado à mucosa forma anticorpos específicos de modo a retardar o transporte de antígenos ingeridos para a circulação. Considera-se que o mecanismo ocorra por meio dos anticorpos IgA, evitando, assim, a ligação dos antígenos às células epiteliais (9). A molécula de IgA é capaz de se combinar com antígenos exógenos e impedir sua penetração na circulação e desencadear uma resposta imunológica (10). Quando antígenos entram na circulação, estimulam o desenvolvimento de anticorpos, fato que pode levar a uma reação cruzada com auto-antígenos específicos para determinados tecidos e, possivelmente, resultar em outros eventos imunológicos, como as doenças auto-imunes (11). A ausência do mecanismo de eliminação do antígeno, que normalmente é realizado pela IgA nas membranas mucosas, permite uma maior exposição antigênica ao sistema linfático e altera o controle de linfócitos-t e a formação de anticorpos, com conseqüente maior ocorrência de doenças auto-imunes em pacientes com DIgA (12). Há evidências de maior freqüência de doenças autoimunes, como diabetes mellitus tipo 1 (DM-1) e doença celíaca (DC), em pacientes com DIgA (13,14). A associação desta deficiência com DC já está bem estabelecida e considera-se como o distúrbio não infeccioso mais comum em pacientes com DIgA (14). Embora o mecanismo exato e o padrão familiar de herança não sejam conhecidos, a maior susceptibilidade a DM-1 foi associada a vários genes que codificam respostas imunológicas, incluindo os genes HLA classe I (HLA-A, B, C), classe II (HLA-DR, DQ, DP) e classe III (15). OBJETIVO O objetivo deste estudo foi medir a concentração sérica de IgA em pacientes com DM-1 para determinar a prevalência de DIgA nestes indivíduos e realizar um imunoensaio, a fim de detectar IgA no soro em concentrações abaixo de 5 mg/dl. MÉTODOS Foi desenvolvido um ensaio imunoenzimático (ELISA) de alta sensibilidade, pois os métodos laboratoriais convencionais propiciavam apenas a determinação de níveis séricos de IgA entre 0,84 e 1,3 mg/dl por imunodifusão radial (IDR) e entre 40 e 500 mg/dl por turbidimetria. A confirmação de DIgA é necessária para evitar resultados falsos-negativos de testes sorológicos que ocorrem em pacientes com DM-1 portadores de outras doenças auto-imunes. Por exemplo, a triagem para a DC se baseia na presença de anticorpos IgA antigliadina e IgA antiendomisio. Este estudo recomenda a utilização de ELISA como um método mais sensível para a determinação de níveis de IgA no soro. Cento e quarenta e nove crianças e jovens adultos com DM-1 foram avaliados no seguimento feito no Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná (UFPR). Todos os pacientes e/ou os pais ou responsáveis responderam um questionário para avaliar a presença de sinais e sintomas de DIgA, histórico de infecção respiratória e gastrintestinal e a duração do aleitamento materno. O termo de consentimento livre e informado foi obtido de todos os pais e pacientes. Juntamente com o exame de cada paciente foi coletada amostra sanguínea para análise adicional. Setenta e sete (51,7%) pacientes eram do sexo masculino, e 72 (48,3%), do sexo feminino. A idade variou entre 1,7 e 22,5 anos. A idade média foi 12,6 ± 4,0 anos e a idade mediana, 12,9 anos. A idade média no início da DM-1 foi 7,0 ± 3,5 anos (mediana de 6,8 anos) e a duração da DM-1 foi, em média, 5,4 ± 4,2 anos (mediana de 4,6 anos). O Grupo Controle compreendia 150 crianças e jovens adultos normais da Clínica Pediátrica do Hospital de Clínicas da UFPR que haviam fornecido amostras de sangue para exames laboratoriais de rotina ou avaliação pré-operatória para cirurgia eletiva. Todos os indivíduos e/ou seus pais ou responsáveis responderam a um questionário para avaliar a presença de sinais e sintomas de DIgA, história de infecção respiratória e gastrintestinal e duração do aleitamento materno. Oitenta e cinco (57%) pacientes eram do sexo masculino, e 65 (43%), do feminino. A idade variou de cinco a 21 anos. A idade média foi 10,4 ± 3,3 anos e a mediana foi 10,0 anos. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de Clínicas da UFPR. O soro dos pacientes foi armazenado à temperatura de -80 o C antes de se determinar a concentração sérica de IgA por três métodos diferentes. Os casos em que a IgA sérica não foi detectada por turbidimetria foram testados novamente duas vezes por IDR. A placa de IDR (LC Partigen IgA, Behring) com gel agarose conti-

3 28 Landgraf LF, Rosário NA, Moura JF, Wells KA, Figueiredo BC nha anticorpos específicos para purificados de anti-iga humana (cadeia α-específica). Os limites para a detecção de IDR variaram de 0,84 a 1,3 mg/dl. As amostras em que a concentração sérica de IgA continuava indetectável pelos dois métodos anteriores foram novamente testadas por ELISA. Em pacientes com DIgA, a determinação de IgG e IgM foi obtida por turbidimetria, para excluir outras imunodeficiências humorais com níveis mais baixos de IgA, como hipogamaglobulinemia e imunodeficiências variáveis comuns. Todos os resultados foram expressos em mg/dl. Medida de IgA pelo método imunoenzimático ELISA O teste ELISA para detecção de IgA foi preparado e padronizado no Laboratório do Hospital de Clínicas da UFPR e compreendia: 1. Sensibilização de uma placa ELISA Nune Maxisorp (Nalge Nune International, Roskilde, Dinamarca), usando anticorpo anti-iga humano (cadeia α-específica) produzido em cabra (Sigma, EUA); 2. Adição de IgA humana (Calbiochem, EUA) ou soro do paciente para estabelecer uma curva padrão; 3. Incubação com o anticorpo conjugado a peroxidase anti-iga humana (cadeia α-específica) produzido em cabra (Sigma, EUA). Uma placa de ELISA foi sensibilizada com anticorpo anti-iga humana (cadeia α-específica) produzido em cabra na concentração de 10 µl/ml, diluído em 0,05 M de tampão carbonato, ph 9,6 (coating buffer) a 4 o C, por, pelo menos, 12 horas. A placa foi lavada três vezes com uma solução de Tween 20 (v/v) a 0,5%, em 0,15 M de NaCl. Os sítios restantes de ligação à proteína foram bloqueados por uma hora a 37 o C pela adição de 100 µl de caseína (p/v) a 2%, diluída em 0,05 M de tampão fosfato e 0,15 M de NaCl em ph 7,4. Após lavagem da placa, o IgA humano foi acrescentado em triplicata por diluição seriada (3,9 a 500 ng/ml), o soro total de pacientes com DIgA (n = 4), diluído a 1:20 (n = 4) ou o soro dos pacientes normais (controles) diluído a 1: com 0,05 M de tampão fosfato, caseína (p/v) a 0,25% e Tween 20 (v/v) a 0,05%. Após uma hora de incubação a 37 o C e outra lavagem, foram adicionados 100 µl do anticorpo conjugado a peroxidase anti-iga humana (cadeia α-específica) produzido em cabra. O anticorpo foi diluído a 1: na solução tampão. Após a incubação e lavagem finais, 100 µl da solução revelada foram adicionados, contendo o-fenilenediamina (p/v) a 0,02%, dissolvida em tampão citratofosfato com 0,025 M de ácido cítrico, 0,05 M de fosfato de sódio em ph 5,0 e 30 volumes de peróxido de hidrogênio (0,02% v/v). Após incubação por 15 minutos, a reação enzimática foi interrompida pelo acréscimo de 20 µl de ácido sulfúrico a 2 M. A absorbância foi determinada no comprimento de onda de 450 nm. RESULTADOS A concentração normal de IgA no soro, isto é, maior que 5 mg/dl, foi determinada por meio de ELISA em 150 pacientes do Grupo Controle e os níveis variavam de 44 a 509 mg/dl. No grupo de pacientes com DM-1, 141 dos 149 (94,6%) apresentaram níveis séricos normais de IgA em detecção por turbidimetria (Tabela 1). O método de turbidimetria, assim como a IDR, cujo limite inferior para Tabela 1. Características demográficas dos pacientes sem deficiência de IgA e com diabetes mellitus tipo 1 (DM-1) e controles Características DM-1 (n = 141) Controles (n = 150) Idade (anos) 1,7-22, ,6 ± 9,4* 10,4 ± 3,3* Gênero (M:F) 77:72 85:65 Idade ao diagnóstico (anos) 7,0 ± 3,5* - Duração da doença (anos) 5,4 ± 4,2* - IgA sérica (mg/dl) *média ± dp detecção é de 0,84 mg/dl, foram ineficazes para avaliar oito pacientes (8/149, 5,3%) cujas concentrações séricas de IgA estavam abaixo do nível detectável. A determinação do nível sérico de IgA nestes oito pacientes foi feita por meio de ELISA, devido à sua maior sensibilidade em relação aos dois métodos anteriores. Os testes com ELISA mostraram que oito pacientes apresentavam concentração de IgA no soro menor que 5 mg/dl, indicando DIgA (Quadro 1). A presença de níveis séricos normais de IgG e IgM por turbidimetria confirmaram o diagnóstico de DIgA ao excluir a possibilidade de outras imunodeficiências humorais. Quadro 1. Níveis séricos de imunoglobulina A (ELISA), G e M em oito pacientes com DM-1 e hipogamaglobulinemia A. Valores em mg/dl ELISA IgA IgG IgM 0, , , , , , , , A idade média dos oito pacientes foi 14,6 ± 3,1 anos. A idade média ao diagnóstico de DM-1 foi 8,9 ± 3,4 anos, e a duração da doença foi de 5,7 ± 4,9 anos.

4 Alta prevalência de deficiência de imunoglobulina A detectada por ELISA em pacientes com diabetes mellitus 29 A idade média dos pacientes com DIgA, a idade média ao diagnóstico de DM-1 e a duração do aleitamento materno não foram estatisticamente diferentes dos resultados do grupo com DM-1. Nenhum paciente com DIgA relatou infecções respiratórias ou gastrintestinais recorrentes. DISCUSSÃO Segundo o Grupo Latino-Americano de Imunodeficiências Primárias (LAGID, do inglês Latin American Group of Immunodeficiencies), as imunodeficiências humorais representam 58% dos casos das imunodeficiências primárias a deficiência de IgA é a mais comum (16). Um estudo clínico realizado no Brasil com doadores de sangue adultos hígidos, inclusive gestantes, revelou a presença de 12 pacientes com DIgA uma prevalência de 1:965 (5). No presente estudo, a DIgA foi definida como níveis de IgA no soro menores que 5 mg/dl, acompanhados de níveis séricos normais ou aumentados de imunoglobulinas G (IgG) e M (IgM) (1). Nenhum paciente no Grupo Controle (n = 150) era portador de DigA; no entanto, a DIgA foi detectada em 5,3% dos pacientes com DM-1, que é aproximadamente 50 vezes mais do que a prevalência de DIgA na população brasileira normal, estimada em 1:1.000 (5). A prevalência de DIgA na população normal da França é de 1:1.400, e Liblau et al. (17) detectaram um paciente com DIgA para cada 261 indivíduos diabéticos. Um estudo semelhante foi feito na Itália, onde a prevalência de DIgA na população normal foi identificada como 1:500, e um paciente com DIgA foi detectado entre cada 27 pacientes diabéticos (18). Em soro de indivíduos com DIgA, a presença de IgA foi detectada por ELISA um método mais preciso e sensível do que a turbidimetria e a IDR. A confirmação de DIgA foi necessária para evitar testes sorológicos falsos-negativos, fato que poderia ocorrer em pacientes com DM-1 portadores de outras doenças auto-imunes. Por exemplo, a triagem para DC baseia-se na presença de anticorpos IgA antigliadina e IgA antiendomisio. Este estudo recomenda a utilização de ELISA como o método mais sensível para determinação de níveis séricos de IgA. Níveis muito baixos de IgA foram detectados em quatro pacientes com DigA, com níveis 200 mil vezes mais baixos que o limite inferior de normalidade de IgA estabelecido pela Organização Mundial da Saúde (OMS, 5 mg/ml). O soro empregado para os testes ELI- SA foi diluído cinco vezes. Nenhum dos oito pacientes com DIgA apresentou infecções gastrintestinais ou de trato respiratório superior ou inferior. A maioria dos casos de DIgA é assintomática, apesar da maior susceptibilidade a infecções. A ausência de sintomas entre estes pacientes poderia ser explicada pela presença de células B com expressão de IgM na superfície da mucosa gastrintestinal e a aquisição de um mecanismo compensatório que torna o IgM capaz de transportar o componente secretório por meio do epitélio (12). Alguns outros estudos completados no Brasil mostraram prevalências diferentes de DIgA em pacientes diabéticos. Em São Paulo, Baptista et al. (19) submeteram pacientes diabéticos à triagem para doença celíaca e encontraram 3/104 (2,9%) com DigA. Na região Nordeste do Brasil, Araújo, Silva e Melo (20) encontraram uma prevalência de 2,0% de DIgA entre diabéticos. Estes achados indicam uma prevalência maior em pacientes com DM-1 do que na população brasileira normal (1:965) (5). CONCLUSÕES Em função da alta prevalência de DIgA entre pacientes com DM-1 (5,3%) detectada no presente estudo, recomenda-se a medida de IgA no soro em todos os pacientes com DM-1. REFERÊNCIAS 1. Hong R, Amman RJ. Disorders of the IgA system. In: Sthiem ER. Immunologic disorders of infants and children. Philadelphia: WB Saunders; p Bachmann R. Studies on the serum gamma-a-globulin level. 3. The frequency of A-gamma-A-globulinemia. Scand J Clin Lab Invest. 1965;17(4): Grundbacher FJ. Genetic aspects of selective immunoglobulin A deficiency. J Med Genet. 1972;9(3): Cassidy JT, Nordby GL. Human serum immunoglobulin concentrations: prevalence of immunoglobulin deficiencies. J Allergy Clin Immunol. 1975;55(1): Carneiro-Sampaio MMS, Carbonare SB, Rozentraub RB, De Araújo MV, Ribeiro MA, Porto MHO. Frequency of selective IgA deficiency among Brazilian blood donors and health pregnant women. Allergol Immunopathol (Madr). 1989;17(4): Grey HJ, Rabellino E, Pirofsky B. Immunoglobulins on the surface of lymphocytes. IV. Distribution in hypogammaglobulinemia, cellular immune deficiency, and chronic lymphocyte leukemia. J Clin Invest. 1971;50(11): Lawton AR, Royal SA, Self KS, Cooper MD. IgA determinations on B-lymphocytes in patients with deficiency of circulating IgA. J Lab Clin Med. 1972;80(1): Conley ME, Cooper MD. Immature IgA B cells in IgA-deficient patients. N Engl J Med. 1981;305(9): Strober W, Brown WR. The mucosal immune system. In: Austen F, Frank MM, Atkinson JP, Cantor HI. Samter s immunological diseases; Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; p Newcomb RW, Sutoris CA. Comparative studies on human and rabbit exocrine IgA antibodies to an albumin. Immunochemistry. 1974;11(10): Burks AW Jr, Stelle RW. Selective IgA deficiency. Ann Allergy. 1986;57(1): Klemola T. Deficiency of immunoglobulin A. Ann Clin Res. 1987;19(4): Van Thiel DH, Smith WI Jr, Rabin BS, Fisher SE, Lester RA. A syndrome of immunoglobulin A deficiency, diabetes mellitus, malabsorption, a common HLA haplotype. Immunologic and genetics studies of forty-three family members. Ann Intern Med. 1977;86(1):10-9.

5 30 Landgraf LF, Rosário NA, Moura JF, Wells KA, Figueiredo BC 14. Crabbé PA, Heremans JF. Selective IgA deficiency with steatorrhea. A new syndrome. Am J Med. 1967;42(2): Dorman JS, LaPorte RE, Stone RA, Trucco M. Worldwide differences in the incidence of type 1 diabetes are associated with amino acid variation at position 57 of the HLA-DQ beta chain. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990;87(19): Carneiro-Sampaio MMS. Primary Immunodeficiencies in Latin America. ACI International. 1999;11(2): Liblau RS, Caillat-Zucman S, Fischer AM, Bach J, Boitard C. The prevalence of selective IgA deficiency in type 1 diabetes mellitus. APMIS. 1992;100(8): Cerutti F, Urbino A, Sacchetti C, Palomba E, Zoppo M, Tovo PA. Selective IgA deficiency in juvenile-onset insulin-dependent diabetes mellitus. Pediatr Med Chir. 1988;10(2): Baptista ML, Koda YK, Mitsunori R, Nisihara N, Ioshii SO. Prevalence of celiac disease in Brazilian children and adolescents with type 1 diabetes mellitus. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2005;41(5): Araújo J, da Silva GA, de Melo FM. Serum prevalence of celiac disease in children and adolescents with type 1 diabetes mellitus. J Pediatr (Rio J). 2006;82(3):210-4.