CHRISTIAN GOMES DA SILVA RAMOS

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1 CHRISTIAN GOMES DA SILVA RAMOS β β LISBOA 2002

2 II INSTITUTO NACIONAL DE SAÚDE Dr. RICARDO JORGE CENTRO DE BACTERIOLOGIA UNIDADE DE RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS Estudo dos Padrões de Resistência aos β-lactâmicos e Inibidores de β-lactamasesem Estirpes de Escherichia coli Uropatogenicas Isoladas em Animais Por CHRISTIAN GOMES DA SILVA RAMOS Relatorio de Estágio realizado no âmbito do Programa de estágios profissionais financiados pelo Prodep III, medida 3, acção 2 Orientador: Doutora Maria Manuela Marin Caniça (INSA) Coordenador: Doutora Lígia Oliveira Martins (ULHT; ITQB, UNL)

3 III AGRADECIMENTOS Manifesto o meu reconhecimento à Doutora Maria Manuela Marin Caniça pelo seu rigor ciêntifíco e sentido crítico e pelo seu empenho em criar as condições necessárias à realização deste trabalho. À Doutora Maria Constânça Pomba Palma Féria pela sua orientação ciêntifica e inestimável apoio e estímulo, e preciosa ajuda na intrepertação das MIC s. À Doutora Lígia Oliveira Martins pelas inúmeras horas dispendidas nas revisão do manuscrito, assim como por todo o incentivo e disponibilidade demonstrados. À Drª. Marta Teresa Costa pela identificação das estirpes de E. coli, preciosa ajuda na realização e intrepertação das MIC s. À Engª. Mónica Ferreira pela orientação concedida no âmbito da detecção de ESBL s. Ao Prof. José Gonçalves e Prof. José Duarte Correia, assim como toda a equipe do Departamento de Patologia Clínica da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Técnica de Lisboa, os meus agradecimentos pela oportunidade, interesse e amizade que me proporcionaram. À Doutora Eugénia Ferreira, Doutora Paula Lavado, Engº. Ricardo Dias e D. Deolinda Louro, da Unidade de Resistência aos Antibióticos, C.B., INSA, agradeço a convivência amigável e o bom ambiente de trabalho. Um muito obrigado também para todos os que, durante a realização deste trabalho, me privilegiaram com a sua amizade.

4 IV ÍNDICE Página 1 Objectivos 1 2 Introdução Escherichia coli Estirpes patogénicas de E. coli Potenciais Fontes de Estirpes Patogénicas 4 3 O uso da Antibioterapia em infecções causadas por E. coli 4 4 As β-lactaminas Modos de acção das β-lactaminas 4 5 Principios da Resistência aos Antibióticos A Epidemiologia da Resistência Antimicrobiana Factores associados ao aumento da resistência aos antibióticos Mecanismos moleculares de resistência aos antibióticos Transferência genética da resistência aos antibióticos Mecanismos bioquímicos de resistência aos antibióticos 11 6 Resistência às β-lactaminas β-lactamases do tipo TEM e SHV β-lactamases de Espectro Estendido (ESBL) Cefalosporinases Oxacilinases Resistência não enzimática 18 7 Métodos de detecção de β-lactamases 18 8 Material e Métodos Estirpes Bacterianas Determinação da susceptibilidade às β-lactaminas Pesquisa de ESBL 20 Resultados Discussão Conclusão Referências Bibliográficas 30 ÍNDICE DE TABELAS Página Tabela 1 Padrões de susceptibilidade 21 Tabela 2 Actividades in vitro 22 Tabela 3 Percentagem de inibição 23 Tabela 4 Valores de MIC s 24 Tabela 5 Teste sinergia 25

5 V ÍNDICE DE QUADROS Página Quadro 1 Classificação de β-lactamases 13 Quadro 2 Substituições de aminoácidos nas IRT 15 ÍNDICE DE FIGURAS Página Fig. 1 Estrutura das Penicilinas e Cefalosporinas 5 Fig. 2 Parede celular bacteriana 6 Fig. 3 Interacção das β-lactaminas com as bactérias 6 Gráfico 1 Padrões de resistência 26

6 VI Sumário O Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge é um Laboratório do Estado que se encontra sob a tutela do Ministério da Saúde. Neste Laboratório efectuam-se diversos tipos de análises e realizam-se actividades de investigação científica relacionadas com a Saúde Humana. No Centro de Bacteriologia, um dos sete centros deste Instituto, situa-se a Unidade de Resistência aos Antibióticos que se dedica, em exclusivo, à investigação científica. A sua actividade caracteriza-se, essencialmente, pela realização de estudos sobre os mecanismos de resistência aos antibióticos e epidemiologia de estirpes clínicas de diversas espécies bacterianas importantes para a saúde pública. A equipe deste laboratório é constituida por três investigadores doutorados, um técnico e dois licenciados.

7 VII RESUMO Introdução: O aparecimento de resistência aos antibióticos mais comuns tem-se revelado um problema crescente a nível mundial. Estirpes de E. Coli uropatogenicas têm demonstrado uma evolução no aumento da resistência, ao longo dos últimos anos. O âmbito deste estudo recaiu na determinação dos perfis de resistência às β-lactaminas em estirpes de E. coli uropatogenicas, isoladas em animais, maioritariamente, cães. Alguns estudos referem que estas estirpes apresentam potencial zoonótico, sendo indistinguiveis das estirpes de origem Humana. Métodos: Estudaram-se 45 estirpes de E.coli, quanto a sua susceptibilidade à amoxicilina-aml, Co-amoxiclave-AMC, ticarcilina-tic, meciliname-mec, cefoxitima-fox, cefixima-cfm, cefuroxima-cxm, cefotaxima-ctx, ceftazidima- CAZ, ceftriaxona-cro e aztreoname-atm, através da determinação da Concentração Inibitória Mínima (MIC) pelo método da microdiluição. A pesquisa de ESBL foi realizada através do teste de sinergia pelo método de microdiluição usando CAZ/clavulatanato, CRO/clavulanato e CTX/clavulanato. Resultados: 57.8% das estirpes foram resistêntes à AML, mas apenas 28.6% eram resistentes à AMC. Determinou-se que, 53.3% e 24.4% das estirpes eram resistentes à TIC e MEC, respectivamente. A CRO, CTX e CAZ apresentaram um padrão de inibição semelhante, com 2.2%, 2.2% e 4.5% dos isolados apresentaram resistência para a ceftriaxona, cefotaxima e ceftazidima, respectivamente. Os níveis de resistência para a CXM, CFM e FOX foram de 4.4%,.1% e 8.%, respectivamente. Neste estudo verificou-se um aumento da resistência às β-lactaminas, onde, pela sua elevada resistência, aprofundou-se um pouco mais o estudo sobre uma estirpe (153), a qual apresentava resistência a todos os antibióticos testados. Conclusão: Assim, como mecanismos de resistência mais prováveis, pensa-se que a estirpe 153 seja produtora de uma β-lactamase TEM-1 (resistência à amoxicilina, ticarcilina e amoxicilina potenciada com ácido clavulânico), uma β-lactamase AmpC (resistência à cefoxitima, cefixima, ceftazidima, cefuroxima, ceftriaxona e aztreoname) e uma β-lactamase OXA-3 ou alterações nas PBP-2, mecanismos igualmente prováveis (resistência ao meciliname). Embora estes mecanismos pareçam bastente prováveis, é necessário recorrer a técnicas como a focagem isoelectrica, PCR-RFLP e PFGE para obter a confirmação, uma vez que também existe a probabilidade de se tratar de uma ou várias novas enzimas, ou mutações desconhecidas. Este trabalho mostra os efeitos da pressão selectiva imposta pelos antibióticos usados em animais, os quais têm contribuido para um aumento das resistências.

8 1 1. OBJECTIVOS O trabalho que serviu de base à realização deste relatório teve por objectivo contribuir para uma melhor compreensão dos padrões de resistências aos antibióticos β- Lactâmicos por parte de estirpes de Escherichia coli uropatogénicas isoladas de infecções em Cães, Gatos, Porcos e Cavalos. Este trabalho pertende ilucidar alguns dos mecanismos de resistência mais comuns, de modo a permitir uma maior eficiência terapêutica, assim como demonstrar algumas tendências na aquisição de novos mecânismos de resistência. Pertende-se ainda, realçar a importância da vigilância da resistência aos antibióticos em estirpes de origem veterinária, uma vez que existem evidências fortes que sugerem o potencial zoonótico de inúmeras espécies bacterianas, incluindo a Escherichia coli.

9 2 2. INTRODUÇÃO A expressão fenotípica da resistência exibida por algumas estirpes de Enterobactereaceae é por vezes difícil de detectar pelos métodos de rotina existentes nos Laboratórios clínicos. Fenotipos pouco vulgares ou díficeis de detectar são frequentes em estirpes de Enterobactereaceae produtoras de β-lactamases de Espectro Estendido (ESBL) ou resistentes aos inibidores das β-lactamases (IRT) combinados com β-lactaminas (Caniça, M. 2001, comunicação pessoal) A caracterização fenotípica comporta os dados clínicos e epidemiológicos clássicos, acompanhando a estirpe desde a sua origem. Este estudo baseia-se na determinação da Concentração Inibitória Miníma (MIC) para as β-lactaminas de maior uso clínico. Existem ainda, poucos estudos publicados sobre as susceptibilidades às β-lactaminas e combinações β-lactamina/inibidor de β-lactamase em estirpes clínicas de E. coli isoladas de animais (Féria et al, 2002), sendo por isso necessário aprofundar os nossos conhecimentos nesta linha de estudos. 2.1 Escherichia coli A Escherichia coli foi isolada, pela primeira vez, em 1885 por Theodor Eschrich, um bacteriologista alemão, sendo considerada um habitante natural do tracto intestinal. T. Eschrich atribuiu a esta bactéria o nome de Bacterium coli (bacterium = forma de bastonete, coli = colon, o seu habitat natural). Posteriormente, o nome do género foi alterado para Escherichia em homenagem ao seu descobridor (Neidhardt et al, 16). A estrutura e função de E coli é, geralmente, considerada um arquétipo para todos os organismos vivos. Escherichia coli é bastante conhecido e estudado, principalmente porque é extremamente fácil de manipular em laboratório. O seu crescimento é rápido, apresentando requisitos nutricionais simples, exibindo uma fisiologia e bioquímica deveras interessantes. No entanto, foi algo diferente que tornou útil esta bactéria, em termos de biologia molecular: sexo, mais precisamente, o processo de conjugação bacteriana, o qual foi descoberto nesta bactéria, em 146, por Joshua Lederberg e

10 3 Eduard Tantum. Aquando da sua descoberta, a conjugação assemelhava-se bastante à reprodução sexual em eucariótas (Madigan, Martinko & Parker, 16). A maioria das estirpes de E. coli não são patogénicas, antes pelo contrário, são comensais, sintetizando vitamina K (única fonte) e B12. As estirpes patogénicas produzem sintomas semelhantes aos de uma salmonelose, podendo por vezes, dependendo da estirpe, chegar a induzir morte (Neidhardt et al, 16; Madigan, Martinko & Parker, 16). 2.2 Estirpes patogénicas de E. coli Existem fundamentalmente dois grupos de E. coli patogénicos, as estirpes Enterotoxigénicas (ETEC) e as Enteropatogénicas (EPEC). Estirpes de Escherichia coli Enterotoxigénicas Trata-se de estirpes enterovirulentas, que apresentam uma etiologia semelhante à Cólera. A doença provocada é conhecida como gastroenterite, vulgarmente chamada de diarreia do viajante. Os sintomas clínicos mais frequentes incluem fortes diarreias, cãibras abdominais, febres baixas a moderadas e náuseas. Estudos demonstraram que são necessárias 10 7 a 10 células de ETEC para induzir sintomas. Provavelmente, será a dose necessária para uma colonização do intestino delgado, por forma a produzir toxina em quantidade suficiente, de modo a provocar os sintomas, os quais se manifestam em cerca de 24h. A sua presença é facilmente distinguível das estirpes não patogénicas, pois as ETEC apresentam características imunoquímicas marcadamente distintas. Estas estirpes não estão correlacionadas directamente com nenhum tipo específico de alimento, sendo transmitidas fundamentalmente por águas contaminadas, especialmente em países em vias de desenvolvimento (Andrews, 16). Estirpes de Escherichia coli Enteropatogénicas Estas estirpes não são produtoras de toxinas excretáveis, mas antes, de toxinas celulares, denominadas de verotoxinas. São extremamente potentes, sendo necessária uma dose muito pequena para despoletar sintomas. Os mais comuns são a diarreia associada a hemorragia e elevadas febres, os quais se manifestam em cerca de 16 a 20h. Este tipo de diarreia deve-se à acção das verotoxinas, as quais provocam uma destruição do epitélio do lúmen intestinal. Estas estirpes podem ser encontradas, principalmente, em carnes

11 4 cruas de vaca e frango, e outros alimentos sujeitos a contaminação fecal, estando associadas a uma taxa de mortalidade de 50%. Para proceder à análise de EPEC é necessário seguir protocolos diferentes dos usados para a pesquisa de E. coli não patogénicas, uma vez que as primeiras apresentam características bioquímicas atípicas (Andrews, 16). 2.3 Potenciais fontes de estirpes patogénicas A evidência da presença de estirpes patogénicas em animais domésticos ainda não se encontra confirmada. Ainda assim, diversos factores apontam para a possível zoonose (Carter, GR, Chengappa, MM, Roberts, AW, 15). Bacon, R. et al demonstraram que em virtude do mau uso de antibióticos, foi promovida a selecção de estirpes de Salmonella Thyphimurium DT 104 multirresistentes, em carcaças de animais de produção. 2.7% em 521 isolados apresentavam resistência à Ampicilina, Cloranfenicol, Estreptomicina, Sulfonamidas e Tetraciclina (Bacon, RT, Sofos, JN, Belt, KE, Smith, GC, 1) 3. O uso da Antibioterapia em infecções causadas por E. coli A primeira abordagem para a quimioterapia antibacteriana de Enterobactereaceae, em animais, geralmente inclui, no que diz respeito às β-lactaminas, a Amoxicilina e Amoxicilina potenciada com ácido Clavulânico (Co-amoxiclave). Como segunda escolha utiliza-se a Cefuroxima, a Cefotaxima e a Ceftazidima. Em último recurso, dentro desta família, o Aztreoname e o Imipeneme (Hawkey, PM, Lewis, DA, 18). 4. As β-lactaminas As β-lactaminas constituem uma família que se caracteriza quimicamente pela presença de uma função amida no anel β-lactamico (fig. 1). Este encontra-se frequentemente associado a outro anel, Tiazolina ou Di-hidrotiazolina, para as Penicilinas e Cefalosporinas, respectivamente (Levy, 12). 4.1 Modo de acção das β-lactaminas As β-lactaminas são agentes bactericidas, actuando fundamentalmente em bactérias em crescimento activo (Vaz-Pato, 18).

12 5 A penetração das β-lactaminas depende da estrutura celular das bactérias alvo. Nas bactérias gram positivas, o constituinte maioritário da parede celular é o peptidoglicano, ao contrario de gram negativas, as quais possuem estruturas bastante mais complexas na parede celular (Madigan, Martinko & Parker, 16). Na face exterior da membrana citoplasmática existem proteínas envolvidas na síntese do peptidoglicano, conhecidas como transpeptidases ou PBP (Penicillin Binding Proteins) (Vaz-Pato, 18). Fig 1 Estrutura química das penicilinas e cefalosporinas. A semelhança estrutural entre o substrato nativo das PBP e o anel β-lactâmico permite a ligação covalente deste às PBP, inactivando-as e, consequentemente, induzindo a lise bacteriana (Abraham, 181). As figuras 2 e 3 descrevem este processo. As PBP 1, 2 e 3 são transpeptidases e transglicosidases, enquanto as PBP 4, 5 e 6 têm a actividade de D,D-carboxipeptidases. Apenas a inactivação das PBP 1, 2 ou 3 induz morte celular (Vaz-Pato, 18).

13 6 Fig 2 Esquema representativo dos tipos de parede celular bacteriana. Fig 3 Esquema representativo da interacção das β-lactaminas com bactérias gram-positivas (A) e gram-negativas (B).

14 7 5. Princípios da Resistência aos antibióticos 5.1 A Epidemiologia da Resistência Antibacteriana O aparecimento da resistência aos antibióticos mais comuns tem-se revelado um problema crescente a nível mundial (Farrar, 185; Holmberg, Solomon & Blake, 187; McGowan, 187a; O Brien, 187). O aumento da prevalência da resistência aos antibióticos em meio hospitalar tem sido atribuida a: (1) alterações na frequência relativa de bactérias resistentes, tais como Pseudomonas; (2) elevado número de doentes imunodeprimidos; e (3) variação nas práticas de administração de antibióticos (McGowan, 187). A importância clínica do aumento do número de microorganismos resistentes aos antibióticos pode ser ilustrada pelo facto de infecções provocadas por bactérias resistentes estarem frequentemente associadas a doença prolongada, hospitalizações frequentes e prolongadas e uma taxa de mortalidade elevada (Holmberg, Solomon & Blake, 187). 5.2 Factores associados ao aumento da resistência aos antibióticos É geralmente aceite entre os peritos, que o aumento da resistência aos antibióticos nas comunidades hospitalares está directamente relacionada com a administração de antibióticos (Young, 186). McGowan realçou sete critérios que demonstram a ligação entre o uso hospitalar de antibióticos e o aumento das resistências: (1) a resistência é mais prevalente em estirpes hospitalares; (2) durante os surtos, os doentes com estirpes resistentes têm maior probabilidade de já terem recebido antibioterapia; (3) mudanças na prescrição da antibióticos induziu alterações nos padrões de resistência; (4) zonas hospitalares com maior uso de de antibióticos, tais como UCI, apresentam maior prevalência de estirpes resistêntes; (5) o uso prolongado de terapia antibacteriana induziu amentos na resistência; (6) doses de antibiótico elevadas aumentam o risco de superinfecções e (7)

15 8 devem ser propostam modelos biológicos para correlacionar causa efeito (McGowan, 187). A introdução de antibióticos em rações para animais, em doses sub-terapêuticas, induziu a selecção de microorganismos resistentes (Levy, 185). Holmberg et al demonstraram que o desenvolvimento de infecções graves com Salmonella Newport multirresistente estava associado com o uso prévio de antibióticos, o qual constitui uma pressão selectiva para o crescimento de estirpes resistentes (Holmberg et al, 184). A zoonose de Salmonella s resistentes foi identificada em 38 surtos investigados pelo Center for Disease Control (CDC), entre 171 e 183 (Holmberg, Wells & Cohen, 184). Bactérias como E. coli podem também passar dos animais para o Homem na ausência de selecção antibacteriana (Marshall, Petrowski & Levy, 10). A colonização gastrointestinal com estas estirpes pode persistir durante vários meses, podendo assim ocorrer transferência de determinantes genéticos de resistência (Livrelli et al, 188). 5.3 Mecanismos moleculares de resistência aos antibióticos Os principais mecanismos genéticos de resistência aos antibióticos são: (1) resistência intrínseca; (2) mutação cromossomal; (3) plasmídica; (4) mediada por transposões; (5) mediada por integrões e (6) tolerância. Resistência intrínseca A resistência intrínseca indica a resistência natural aos antibióticos, característica de muitas bactérias a certos antibióticos. Este tipo de resistência pode resultar da presença de uma barreira de premeabilidade (Hancook & Woodruff, 188; Nikaido & Vaara, 185), por modificação dos locais alvo dos antibióticos (Spratt & Cromie, 188) ou pela indução de genes reprimidos na presença de antibiótico (O Brien, 187). Mutação cromossomica As mutações cromossomicas são alterações na sequência de DNA dos cromossomas bacterianos, as quais podem resultar na síntese de proteínas alteradas, novas proteínas, ou ainda, alterações na quantidade de proteína produzida. Têm sido detectadas mutações num elevado número de genes, incluindo os genes da PBP, da RNA polimerase, DNA

16 girase, proteínas ribossomais, sistemas energéticos bacterianos e sistemas de transporte. Geralmente, estas mutações estão associadas a uma diminuição na virulência (Reynolds, 184). Plasmídeos Os plasmídeos são moléculas de DNA circular, extracromossomal, com capacidade de replicação autónoma. Os plasmídeos de resistência podem ser encontrados numa grande diversidade de bactérias, uma vez que este é facilmente transmitido a bacterias da mesma espécie, ou de outras espécies, através de conjugação e transformação. Estas moléculas podem codificar diversas proteínas importantes na replicação, factores de fertilidade, resistência a metais tóxicos, bacteriofagos e antibióticos, adesão celular, virulência, entre outros (Madigan, Parker &Martinko, 16; Lewin, 16). Transposões Os transposões são sequências de DNA linear, com tamanho molecular compreendido entre 2.5 Kb e 23 Kb, que possuem a capacidade de se transferir de uma molecula de DNA para outra (Darnell et al, 15). Os transposões diferem dos plasmídeos basicamente em dois modos: não possuem capacidade de replicação autónoma e, consequentemente, têm que estar integrados em plasmídeos ou bacterifagos do cromossoma hospedeiro, e não necessitam de grande homologia de modo a se inserirem numa sequência de DNA. Os transposões contêm sempre sequências repetidas, directas ou inversas, ou ainda duplicações da sequência alvo. Algumas destas sequências invertidas (sequências de inserção IS) são capazes de movimento independente (Lewin, 16). Integrões Os integrões assemelham-se aos transposões, mas não posuem sequências terminais repetidas, nem codificam as proteínas necessárias para a sua transposição. Estes podem ser caracterizados pela presença de sequências específicas para o alvo de integração. Apresentam a capacidade de adquirir diversos genes para a resistência aos antibióticos, e de os expressar através de promotores próprios (intrínsecos) (Stokes & Hall, 18).

17 10 Tolerância A tolerância é definida como um rácio entre a Concentração Bactericida Mínima (BMC) e a Concentração Inibitória Mínima (MIC) igual ou superior a 32. Este tipo de resistência pode ser caracterizado pela inibição do crescimento sem lise celular. A tolerância encontra-se fundamentalmente em gram-positivos, possivelmente devido a alterações nas autolisinas (degroot, 11). 5.4 Transferência genética da resistência aos antibióticos Existem quatro processos distintos de transferência de genes de um microorganismo para outro. Estes são a Conjugação, Transformação, Transducção e Transposição. Conjugação A conjugação é um processo pelo qual o DNA é transferido por contacto celular, de um dador para um receptor. Genes que codificam resistência a antibióticos encontram-se frequentemente em plasmídeos conjugativos. Estes encontram-se largamente distribuidos, disseminando facilmente para diferentes espécies bacterianas (Davies & Smith, 178). Transformação A transformação é um processo onde o DNA do dador é integrado no cromossoma do receptor. Este é um mecanismo muito eficiente de transferência genética (Madigan, Parker & Martinko, 16; Lewin, 16). Transducção Na transducção a transferência genética é mediada por bacteriofagos. Os bacterifagos são pequenos vírus, os quais replicam como parasitas intracelulares obrigatórios nas bactérias (Madigan, Parker & Martinko, 16; Lewin, 16). Transposição A transposição é um mecanismo de transferência mediado por transposões, envolvendo tanto plasmídeos conjugativos, como não conjugativos, e cromossomas (Lupski, 187).

18 Mecanismos bioquímicos de resistência a antibióticos Existem quatro mecanismos fundamentais, os quais serão apenas brevemente discutidos nesta secção. Modificação dos locais alvo Mutações nos genes das PBP podem diminuir a sua afinidade para os antibióticos β- lactâmicos, conferindo alguma resistência. A resistência às Quinolonas e à Novobiocina pode surgir através de mutações no gene gyra, o qual codifica para uma girase. No caso da RNA polimerase possuir mutações, é provável que exista resistência à Rifampicina. A resistência aos Aminoglicosídeos está intimamente ligada a mutações no rrna, enquanto a resistência aos Macrólidos depende, principalmente, da metilação do rrna por intremédio de enzimas codificadas em plasmídeos (Reynolds, 184). Acumulação reduzida de antibiótico Este tipo de resistência pode ser intrínseco ou adquirido. Exemplo de resistência intrínseca é a incapacidade de certos antibióticos difundirem através das porinas da membrana externas das bactérias gram-negativas (Nikaido & Vaara, 185; Nikaido, 188). Bactérias como a Pseudomonas aeruginosa exibem uma premeabilidade extremamente reduzida para antibióticos hidrofílicos. Isto é reflexo de diferenças substânciais nas características das porinas (Hancock & Woodruff, 188; Livermore, 188). Os genes plasmídicos podem codificar proteínas membranares (Tet A, B e C), as quais funcionam como bombas de efluxo de extrusão da Tetraciclina, à custa de ATP. A Tetraciclina, geralmente, inibe a síntese proteíca bacteriana, interagindo com a subunidade ribossomal 30s. Mutações cromossomais em proteínas transportadoras ou porinas, podem resultar numa permeabilidade reduzida da parede celular (Bryan, 18; Hancock & Woodruff, 188).

19 12 A este mecanismo tem sido associada a resistência a vários antibióticos, nomeadamente, aminoglicosideos, quinolonas, cloranfenicol, tetraciclinas e β-lactâmicos (degroot, 11). Inactivação do antibiótico Este mecanismo de resistência consiste na inactivação do antibiótico por intermedio de enzimas. Existem três grupos principais de enzimas: (1) enzimas inactivadoras de aminoglicosideos; (2) cloranfenicol acetil transferases e (3) β-lactamases. Estas últimas serão discutidas em mais detalhe em pontos posteriores. A cloranfenicol acetil transferase (CAT) encontra-se em plasmídeos ou transposões, e cataliza a desacetilação do cloranfenicol com a Coenzima A (CoA). O composto resultante é inactivo na inibição da sintese proteíca (Bajanca-Lavado, 16). As enzimas de modificação de aminoglicosideos são de três tipos: (1) acetiltransferases, (2) adeniltransferases e (3) fosfotransferases. Os aminoglicosideos ligam-se às subunidades ribossomais 30s e 50s, induzindo um missreading transducional e a inibição do alongamento das cadeias peptidicas (Bryan, 188). Desvio metabólico A resistência exibida aquando a existência de um desvio metabólico caracteriza-se pela síntese de um local alvo alternativo, para o antibiótico. Este é o principal mecanismo de resistência às Sulfonamidas e ao Trimetoprime. A resistência a este último antibiótico é consequência da síntese de uma dihidropteroato sintetase alterada, a qual, geralmente, encontra-se em plasmídeos (degrott, 11). 6. Resistência às β-lactaminas A resistência enzimática aos antibióticos β-lactâmicos é mediado por β-lactamases, as quais hidrolizam o anel β-lactâmico, inactivando o antibiótico.

20 13 Ao longo dos anos têm surgido vários esquemas de classificação. No entanto, pareçe que o esquema proposto por Bush et al em 15 é o que se apresenta mais coeso. Esta classificação baseia-se nos substractos e perfis de inibição (Ferreira, 2000). Quadro I: Esquema da classificação das β-lactamases (Bush et al, 15) Grupo Classe Molecular Substratos preferênciais Inibida por Àcido Clavulânico Enzimas representativas 1 C Cefalosporinas Não AmpC; MIR-1 2 a A Penicilinas Sim Penicilinases 2b A Penicilinas, Sim TEM-1, TEM-2, SHV-1 Cefalosporinas 2be A Penicilinas, Cefalosporinas de largo espectro e espectro estendido Sim TEM-3 a TEM-26, SHV- 2 a SHV-6 2br A Penicilinas -- TEM-30 a TEM-36, TRC-1 2c A Penicilinas, Sim PSE-1, PSE-3, PSE-4 Carbenicilinas 2d D Penicilinas, -- OXA-1 a OXA-11 Oxacilinas 2e A Cefalosporinas Sim AmpC 2f A Penicilinas, Cefalosporinas, Carbapenémes Sim NMC-A, Sme-1 3 B β-lactâmicos em ---- L1, CcrA geral 4 Não determinado Penicilinas ---- Penicilinases Adaptado de Ferreira, Esta classificação deriva directamente da sequência nucleotídica dos genes que codoficam as diferentes β-lactamases. As classes A, C e D possuem um resíduo de serina no centro activo, enquanto a classe B tem 4 átomos de zinco. As enzimas da classe A são muito activas contra a benzilpenicilina. As β-lactamases de Espectro Estendido (ESBL) pertencem a esta classe. As ESBL para além da benzilpenicilina, também inactivam diversas cefalosporinas e monobactamos. As enzimas da classe B são igualmente activas contra as benzilpenicilinas e cefalosporinas, inactivando ainda os carbapenémes.

21 14 As β-lactamases da classe C, conhecidas por AmpC, na maioria dos casos são indutíveis, mas algumas mutações podem provocar a sobreexpressão. A classe D é composta por enzimas do tipo OXA, as quais hidrolizam a oxacilina (Fluit et al, 2001). 6.1 β-lactamases do tipo TEM e SHV A β-lactamase TEM foi a primeira a ser descrita, em 165, por Kliebe et al, em E. coli, o que demonstra o quanto recentes são estas enzimas (Kliebe et al, 185). As enzimas TEM-1, TEM-2 e SHV-1 encontram-se bastante difundidas, e atacam cefalosporinas de espectro reduzido e penicilinas (Appelbaun et al, 186). O nível de resistência depende da quantidade de enzima produzida, a qual pode ter variações até 150 vezes entre diversas estirpes, o que reflete a quantidade de genes ou, a eficiência dos promotores (Wu, Shanon & Philips, 14). A produção de TEM ou SHV, mesmo em pequenas quantidades, confere resistência à ampicilina, amoxicilina, ticarcilina e carbenicilina, com MIC s superiores as 256 µg/ml, comparadas com 1 a 4 µg/ml em E. coli não produtoras de β-lactamase (Wu, Shanon & Philips, 14; Livermore, 15). Devido ao aumento das resistências às penicilinas, foram desenvolvidas moléculas inibidoras das β-lactamases, as quais funcionam como protectoras do antibiótico. Entre os inibidores mais comuns encontram-se o ácido clavulânico, o sublactâme e o tazobactâme (Ferreira, 2000). Estudos recentes correlacionam a resistência em estirpes de E. coli à hiperprodução de TEM não modificada, modificação em proteínas de membrana e modificação nas enzimas do tipo TEM. Estas últimas, embora pertençam à família TEM, são conhecidas como TEM resistentes aos inibidores (IRT) (Belaaouaj et al, 14; Chaïbi et al, 1).

22 15 As IRT diferem das TEM-1 e TEM-2 parentais em uma, duas ou três substituições de aminoácidos em locais diferentes. Quadro II: Substituições de aminoácidos nas β-lactamases IRT Posição do aminoácido a na sequência b β-lactamase c Nome pi alternativo TEM-1 Gln Met Trp Met Arg Val Arg Asn 5.4 TEM-30=TEM-41 IRT-2 Ser 5.2 TEM-31 IRT-1 Cys 5.2 TEM-32 IRT-3 Ile Thr 5.4 TEM-33 IRT-5 Leu 5.4 TEM-34 IRT-6 Val 5.4 TEM-35 IRT-4 Leu Asp 5.2 TEM-36 IRT-7 Val Asp 5.2 TEM-37 IRT-8 Ile Asp 5.2 TEM-38 IRT- Val Leu 5.2 TEM-3 IRT-10 Leu Arg Asp 5.4 TEM-40 IRT-161, Ile 5.4 IRT-11 TEM-44 IRT-13 Lys Ser 5.4 TEM-45 IRT-14 Leu Gln 5.2 TEM-51 IRT-15 His 5.2 a Ala, alanina; Asn, asparagina; Arg, arginina; Asp, ácido aspártico; Cys, cisteína; Gln, glutamina; His, histidina; Ile, isoleucina; Leu, leucina; Lys, lisina; Ser, serina; Thr, treonina; Trp, triptofano; Val, valina. b Comforme os sistema de numeração ABL de Ambler et al c Classificação das β-lactamases TEM Adaptado de Chaïbi et al, 1 Belaaouaj et al em 14 descreveram uma β-lactamase de pi 5.2, derivada de uma TEM, com a substituição de dois aminoácidos, a qual é resistente à combinação amoxicilina/ácido clavulânico (AMC), sendo classificada como IRT (Belaaouaj et al, 14; Brun et al, 14). Sabe-se que os genes bla IRT, embora inicialmente exclusivos de E. coli, encontram-se também em K. pneumoniae e P. mirabilis (Bret et al, 16; Lemozy et al, 15). O fenotipo de resistência das IRT, por si só, proporciona resistência às combinações β- lactamina/inibidor. Contudo, mutações no promotor dos genes bla IRT conduz a uma expressão mais elevada da enzima, elevando os valores de resistência (Caniça et al, 17).

23 16 Os genes bla IRT podem apresentar mutações que afectem as propriedades cinéticas das enzimas, alterando os locais de ligação, quer da β-lactamina, quer do inibidor (Knox et al, 15; Caniça et al, 16). Um estudo conclui que as IRT com 2 substituições são resultado de uma evolução convergente, uma vez que, cada substituição de aminoácidos, per si, traduz-se num fenótipo de resistência (Caniça et al, 18). Uma mutação particular causadora de fenótipo IRT pode ser encontrada em dois frameworks genéticos distintos, tal como duas mutações IRT diferentes podem estar presentes em framewoks genéticos idênticos. Assim, pensa-se que as IRT tiveram uma evolução convergente, uma vez que, embora as mutações ocorressem em diferentes frameworks genéticos, todas conferem um fenótipo IRT idêntico (Caniça et al, 17). As estirpes produtoras de IRT são resistentes a todas as combinações β- lactâmico/inibidor, mas são menos resistentes que as TEM-1 às cefalosporinas de 1ª e 2ª geração (C1G e C2G), continuando susceptíveis às cefalosporinas de espectro estendido (Livermore, 15). 6.2 β-lactamases de Espectro Estendido (ESBL) As ESBL derivadas de TEM e SHV caracterizam-se pela capacidade de atacar as cefalosporinas de espectro estendido, monobactâmos e penicilinas. A resistência ao Aztreoname é variável dentro da família. A sinergia entre as C3G e as combinações β- lactâmico/inibidor também é característica das ESBL (Livermore, 15). As ESBL não relacionadas com TEM e SHV são raras, mas encontram-se entre as mais potentes da classe e podem vir a ter uma importância crescente num futuro próximo. Estas enzimas conferem resistência a todas as cefalosporinas, ao aztreoname e às penicilinas, sendo susceptíveis aos carbapenémes e cefamicinas (Livermore, 15).

24 17 Este tipo de β-lactamases existe fundamentalmente em Acinetobacter e P. aeruginosa. No entanto, sabe-se que pode ocorrer troca de material genético entre estas espécies e as Enterobactereaceae (Fluit, 2001). 6.3 Cefalosporinases (AmpC) As enzimas AmpC existem desde muito antes da era dos antibióticos (Livermore, 15). O gene da cefalosporinase cromossomal, ampc, em E. coli é regulado por um promotor fraco e um atenuador da transcrição (Jaurin et al, 181; Olsson et al, 183; Nelson & Elisha, 1). Estirpes com o gene nativo produzem baixas quantidades de enzima, e são susceptíveis à ampicilina. Contudo, em algumas estirpes de E. coli, esta enzima é hiperproduzida, conduzindo a um fenótipo de resistência ao Cefoxitime e susceptibilidade reduzida às oximinocefalosporinas. Estudos sobre a base molecular da hiperprodução de AmpC demonstram que algumas estirpes hiperprodutoras possuem várias cópias do gene ampc, enquanto outras apresentam mutações ao nível do promotor e/ou atenuador, resultando numa transcrição mais eficiente. A aquisição de promotores fortes de Shigella sp. também foi descrito como uma causa de hiperprodução de AmpC em E. coli (Nelson, 1). As mutações no atenuador, embora impliquem resistência, não conferem níveis elevados, ao contrário das mutações no promotor. Estas últimas podem corresponder a um aumento transcripcional até 120 vezes em relação ao nível de transcrição constitutivo (Caroff et al, 2000). Nos últimos dez anos têm sido descritas várias cefalosporinases plasmidícas em E. coli e outras espécies. Pensa-se, que esta transição pode estar associada a integrões e transposões, e de certo modo constitui um risco elevado de disseminação de resistência (Ferreira, 2000). 6.4 Oxacilinases

25 18 As β-lactamases do grupo 2d são caracterizadas pela elevada taxa de hidrolise da Oxacilina e baixa susceptibilidade à inibição pelo ácido clavulânico (Mugnier et al, 18). Algumas destas enzimas, não derivadas de ESBL, apresentam uma actividade de largo espectro. As OXA têm sido descritas crescentemente em E. coli. Contudo, ainda são raras (Danel et al, 1). Enquanto algumas oxacilinases diferem apenas por uma substituição num aminoácido (caso da OXA-1 e OXA-4, OXA-11 e OXA-14), outras demonstram elevada homologia aminoacídica (OXA-1, OXA-5, OXA-7 e OXA-10), sendo que a maioria apenas apresenta uma similaridade de aminoácidos entre 20 a 30% (Naas et al, 18). 6.5 Resistência não enzimática No caso da resistência aos β-lactâmicos, esta é devido fundamentalmente a modificações nas PBP. Em E. coli as PBP-1 ligam-se essencialmente à cefaloridina. As PBP-2 ligam-se ao meciliname, ao ácido clavulânico e tienamicina, e as PBP-3 à piperacilina, mezlocilina e aztreoname. A inibição das PBP-1a e PBP-1b conduz a um efeito bactericida, enquanto a inibição das PBP-2 e PBP-3 produz um efeito bacterióstatico (Vaz-Pato, 18; Percival, 12). 7. Métodos de detecção de β-lactamases A determinação da susceptibilidade aos antibióticos em isolados clínicos é crucial para o sucesso da antibioterapia em infecções bacterianas. Uma identificação inequívoca da presença de determinada β-lactamase em Enterobactereaceae implica a sequenciação do gene ou proteína. No entanto, o tipo de enzima pode ser inferido a partir dos dados da susceptibilidade (Livermore, 15, 2001; M Zali, 2000). Os testes directos podem ser usados em E. coli, mas a sua utilidade é reduzida, uma vez que, a questão que se coloca não é se é produzida β-lactamase, mas antes, que tipo de β- lactamase é produzida (Livermore, 2001).

26 1 O teste com Nitrocefin é um dos mais comuns e sensíveis para a maioria das β- Lactamases. A β-lactamase hidrolisa o nitrocefin (uma cefalosporina cromogénica), provocando uma alteração da côr, de amarelo para vermelho. A hidrolise da penicilina a ácido penicilinóico reduz o iodo, produzindo uma descoloração do complexo iodoamido. Este é o princípio básico dos testes iodométricos. A detecção de ESBL não é óbvia, e a determinação da susceptibilidade não é convergente, uma vez que ainda não existe consenso sobre os valores limíte entre resistência e susceptibilidade (Livermore, 15, 2001). As ESBL podem ser inferidas através da avaliação do sinergismo entre C3G e inibidores de β-lactamases (frequentemente usa-se o ácido clavulânico), uma vez que as ESBL são inibidas (Livermore, 15). O E-teste permite também a detecção de ESBL, mas como todos os outros, apresenta limitações intrepertativas (M Zali, 2000). 8. MATERIAL E MÉTODOS 8.1 Estirpes bacterianas Foram isoladas 45 estirpes de E. coli (28 de cães, 7 de suínos, 6 de gatos, 3 humanas e 1 de equíno) e enviadas para a Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa. Todos os isolados foram provinientes de pacientes com bacteriúria significativa e sintomas claros de Infecção do Tracto Urinário (ITU). As estirpes foram isoladas em Columbia suplementado com 5% de sangue de carneiro (biomerieux, França). Os isolados foram identificados com o sistema API 20E (biomerieux, França). As estirpes foram guardadas em meio BHI com 20% glicerol, e congeladas a 70º C, para estudos posteriores.

27 20 As estirpes E. coli ATCC 2522, E. coli R111 (TEM-1), E. coli Sal (IRT-1), E. coli Guer (IRT-2), E. coli P37 (IRT-14), e um isolado caracterizado por Féria, C. et al, 2002, E. coli 434 (AmpC+TEM-1), foram usadas como estirpes de referência na determinação das MIC s. 8.2 Determinação da susceptibilidade às β-lactaminas A determinação das MIC s foi realizada pelo método da microdiluição, adaptado dos métodos propostos por Courvalin et al, 185, e pela American Society for Microbiology, 18 (Féria et al, 2002). Os pós de antibiótico e inibidor de β-lactamases usados nos ensaios para determinação das MIC s foram fornecidos pelos seguintes fabricantes: Clavulanato de sódio (Atral- Cipan), Ticarcilina (GlaxoSmithKlineBeecham), Meciliname (Leo Pharmaceutical Products), Ceftazidima (GlaxoWellcome), Ceftriaxona (Roche Pharmaceuticals), Cefotaxima (HoeschstMarionRoussel), Aztreoname (Bristol-Myers Squibb), Amoxicilina (Sigma), Cefuroxima e Cefixima (Atral-Cipan). O ácido clavulânico foi usado numa concentração fixa de 2 µg/ml com amoxicilina diluida em série aritmética de factor Pesquisa de ESBL A pesquisa de ESBL foi realizada pelo teste de sinergia entre o ácido clavulânico e os seguintes antibióticos: Cefotaxima, ceftriaxona e ceftazidima (Féria et al, 2002).. RESULTADOS Os padrões de resistência de 45 estirpes de E. coli uropatogenicas, relativamente a 10 β- lactaminas e a uma combinação β-lactamina/inibidor de β-lactamase, encontram-se na tabela 1.

28 % das estirpes estudas apresentavam resistência à amoxicilina, mas apenas 28.6% eram resistentes à combinação amoxicilina/ácido clavulânico. Determinou-se que, 53.3% e 24.4% das estirpes eram resistentes à ticarcilina e meciliname, respectivamente. A ceftriaxona, cefotaxima e ceftazidima apresentaram um padrão de inibição semelhante, onde apenas 2.2%, 2.2% e 4.5% dos isolados apresentaram resistência para a ceftriaxona, cefotaxima e ceftazidima, respectivamente. Os níveis de resistência para a cefuroxima, cefixima e cefoxitima são ligeiramente mais elevados do que para as cefalosporinas anteriores, situando-se em 4.4%,.1% e 8.%, respectivamente. A nível global, das 45 estirpes estudadas, nota-se uma elevada resistência para a amoxicilina e ticarcilina, uma percentagem de resistência média para o meciliname e amoxicilina potênciada com ácido clavulânico, e baixas percentagens de resistência para a cefoxitima, cefuroxima, ceftazidima e cefixima (tabela 1). Apenas um isolado apresentou resistência para o aztreoname, cefotaxima e ceftriaxona. Tabela 1:Padrões de susceptibilidade aos antibióticos em isolados de E. coli uropatogenicas MIC (µg/ml) Breakpoint a Método da Microdiluição b Antibiótico S R S I R Amoxicilina 4 >16 16 (35.5) 3 (6.7) 26 (57.8) Co-amoxiclave c 4 >16 12 (28.6) 14 (42.8) 12 (28.6) Meciliname 2 >8 27 (60) 7 (15.6) 11 (24.4) Cefuroxima 8 >32 11 (24.5) 32 (71.1) 2 (4.4) Cefoxitima 8 >32 26 (57.8) 15 (33.3) 4 (8.) Ceftazidima 4 >32 42 (5.5) 0 2 (4.5) Ceftriaxona 4 >32 44 (7.8) 0 1 (2.2) Cefotaxima 4 >32 40 (8) 4 (8.8) 1 (2.2) Cefixima 1 >2 30 (68) 10 (22.7) 4 (.1) Aztreoname 4 >32 3 (86.7) 5 (11.1) 1 (2.2)

29 22 Ticarcilina 16 >64 15 (33.4) 6 (13.3) 24 (53.3) a Breakpoints e susceptibilidades intrepertados com base nas recomendações do Comité do Antibiograma, da Sociedade Francesa de Microbiologia; b Número de isolados (%); c O clavulanato foi usado numa concentração fixa de 2 µg/ml.

30 23 Tabela 2. Actividades in vitro de 11 antibióticos contra isolados uropatogénicos de E. coli (n = 45) Percentagens cumulativas de inibição das estirpes estudadas em mg/l Antibiótic o < >40 6 AML AMC TIC MEC CAZ CRO CTX

31 24 CXM CFM FOX ATM AML: Amoxicilina; AMC: Amoxicilina potênciada com ácido clavulânico; TIC: Ticarcilina; MEC: Meciliname; CAZ: Ceftazidima; CRO: Ceftriaxona; CTX: Cefotaxima; CXM: Cefuroxima; CFM: Cefixima; FOX: Cefoxitime; ATM: Aztreoname.

32 25 As MIC 50 e MIC 0 encontram-se descritas na tabela 3. A ticarcilina foi o antibiótico que apresentou valores mais elevados, de 256 e >406 µg/ml, para as MIC 50 e MIC 0, respectivamente. A ceftriaxona situa-se no extremo oposto, com valores de MIC 50 e MIC 0 de 0.06 e 1 µg/ml. Tabela 3: Percentagens de inibição a 50% e a 0% de 11 antibióticos Antibiótico MIC 50 MIC 0 AML AMC TIC 256 >406 MEC CAZ CRO CTX CXM 8 16 CFM FOX 4 16 ATM É possível ver que as MIC 0 para as cefalosporinas se encontra abaixo dos valores críticos, em termos de resistência, assim como para o aztreoname e meciliname. A amoxicilina e a ticarcilina apresentam valores de MIC 50 na gama resistente, enquanto a amoxicilina potenciada com ácido clavulânico, tem um valor intermédio. A tabela 4 resume as MIC s obtidas para as estirpes que apresentaram um padrão de resistência mais elevado, assim como, para os padrões usados e enzimas citadas na bibliografia.

33 26 Tabela 4: MIC s de estirpes de E. coli uropatogenicas. MIC c em µg/ml Estirpes AML AMC TIC MEC FOX CFM CXM CTX CAZ CRO ATM > > > E > ATCC TEM > ND ND ND IRT ND ND IRT ND IRT ND ND TEM-1 + AmpC >2048 >2048 > ND ND ND OXA-1 a > ND ND ND SHV-1 b > ND ND ND SHV-1 + AmpC c > ND ND ND AmpC d ND ND ND IRT-4 e ND ND ND 0.03 TEM-10 + SHV-1 f >128 ND ND ND ND ND ND 16 > ND ND-não determinado; a (Danel et al, 1); b (Rice et al, 2000); c (Goni-Urriza et al, 2000); d (Nelson & Elisha, 1); e (Brun et al, 14); f (Yang et al, 18) A partir dos resultados obtidos pode notar-se que existem duas estirpes, a 1 e a 153, as quais apresentam valores de MIC, para as cefalosporinas, algo elevados. A estirpe 153 apresenta também uma elevada resistência ao meciliname e ao aztreoname. A NCCLS refere que quando existe sinergia (Fractional Inibitory Concentration 0.5) entre uma cefalosporina e um inibidor de β-lactamases, a enzima envolvida no fenomeno de resistência poderá ser uma ESBL.

34 27 Tabela 5: Resultados do teste de sinergia em isolados de E. coli e estirpes padrão MIC s em µg/ml Estirpes CTX/CA CAZ/CA CRO/CA FIC TEM TEM TEM-1+AmpC HB FIC 0.5-sinergia; 0.5 FIC 4-indiferença; FIC>4-antagonismo CA ácido clavulânico 10. Discussão Neste estudo notou-se um aumento da resistência à amoxicilina, Co-amoxiclave, meciliname, ceftazidima, ceftriaxona, cefotaxima, aztreoname e ticarcilina, que para os quais, sobre isolados do mesmo tipo de amostras, em junho de 2001 se cifravam em 36.1%, 1.4,%, 13.%, 1.4%, 1.4%, 0%, 0% e 34.7%, respectivamente (Féria et al, 2002). Deve realçar-se que as estirpes incluídas neste estudo foram isoladas maioritáriamente em 2001, no entanto, foram incluidas estirpes de 18 (2), 1 (7) e 2002 (5), pelo que estes valores são meramente indicativos. É contudo, importante verificar a tendência do aumento da resistência de estirpes de origem veterinária (gráfico 1), o que vem reforçar a ideia lançada por Féria et al, onde é bem patente a importância da vigilância da resistência antimicrobiana em veterinária em animais de produção e companhia, uma vez que estes entram em contacto directo com o Homem, podendo vir a tornar-se um problema de saúde pública.

35 28 Um estudo realizado em Espanha, em 18, com isolados de E. coli proviniêntes de vacas leiteiras revela que 2.1% das estipes eram resistentes à cefuroxima, o que fortalece a ideia de uma evolução na resistência às cefalosporinas (Orden et al, 1). Gráfico 1: Padrões de resistência das estirpes estudadas Padrões de resistencia de isolados de E. coli uropatogenicos (n=45) Percentagem de Resistencia Amoxicilina Co-amoxiclavec Meciliname Cefuroxima Cefoxitima Ceftazidima Ceftriaxona Cefotaxima Antibióticos testados Cefixima Aztreoname Ticarcilina S I R A estirpe 153 apresenta resistência para os 11 antibióticos testados. As enzimas tipo IRT apresentam sensibilidade à ceftazidima, cefotaxima, ceftriaxona, meciliname e aztreoname (Caniça et al, 14; Ferreira, 2000). Um estudo realizado em Portugal determinou que enzimas do tipo TEM-10 apresentam MIC s >32 µg/ml para a ceftazidima, >256µg/ml para o aztreoname, 8 µg/ml para a cefuroxima e 2 µg/ml para a cefotaxima. A susceptibilidade à ceftazidima é restabelecida pelo ácido clavulânico, indicando que se trata de uma ESBL (Barroso et al, 2000). Yang et al determinaram que isolados clínicos de E. coli produtores de TEM-43 têm MIC >128 µg/ml para a ceftazidima, 32 µg/ml para a cefotaxima, 4 µg/ml para a cefoxitima e >128 µg/ml para o aztreoname (Yang et al, 18).

36 2 Altos níveis de resistência à ceftazidima e à sua combinação com o ácido clavulânico podem ser resultado da produção de TEM-50, embora estas enzimas sejam raras (Rice et al, 2000). Um fenotipo de resistência à ampicilina, ticarcilina, cefotaxima, ceftazidima e aztreoname pode ser resultado da presença de uma OXA-1, uma enzima derivada da OXA-10 (Mugnier et al, 18). Outras enzimas da familia OXA, como a OXA-17 e OXA-20, induzem perfis de resistência semelhantes, no entanto, estas enzimas são muito raras em E. coli, encontrando-se principalmente em Pseudomonas (Mugnier et al, 18; Danel et al, 1; Naas et al, 18). Além disso, estas enzimas encontram-se frequentemente associadas a integrões, os quais ainda são raros em E. coli (Naas et al, 18). As enzimas AmpC têm sido descritas em plasmídeos conjugativos de Klebsiella e, menos frequentemente, em E. coli (Marchese et al, 18). Dentro deste grupo, existem vários sub-grupos, de acordo com a cefalosporina maioritariamente degradada. Por exemplo, as FOX-3 e FOX-4 degradam preferencialmente a cefoxitima (Bou et al, 2000), enquanto a CTX-M-16 liga-se com maior afinidade à cefotaxima (Bonnet et al, 2001). Siu et al descrevem a existência concomitante de SHV-5 e TEM-1 em diversos isolados clínicos de E. coli, as quais conferem um perfil de resistência semelhante à presença de uma ESBL (Siu et al, 1). Embora seja necessário recorrer a métodos como a focagem isoelectrica, PCR-RFLP, PFGE e sequenciação, para determinar a ou as enzimas envolvidas no fenómeno de resistência, é possível inferir as enzimas apartir do padrão da resistência (Livermore, 15, Livermore, 2001). Contudo, é necessário considerar a hipotese de existirem outros mecanismos de resistência não enzimática, de modo a não subestimar o potencial infeccioso das estirpes. Porém, estes mecanismos são raros em E. coli, e não implicam elevados níveis de resistência (Livermore, 15).

37 30 Comparando o fenotipo determinado para a estirpe 153 com os dados disponíveis na bibliografia, tudo indica que esta estirpe possua pelo menos duas β-lactamases distintas: uma TEM-1, (devido à presença de de vários plasmídeos multicópias ou devido à existência de hiperexpressão resultante de mutações no promotor) e uma AmpC hiperproduzida (desreprimida). Já foi descrita em Portugal, uma estirpe de E. coli, proveniente de um cão, a qual apresentava um perfil de resistência semelhante, mas os valores de MIC eram algo inferiores e, era intermédia para o meciliname (Féria et al, 2002). No entanto, atendendo a que, alterações das porinas e a impermiabilidade devido à presença de bombas de extrusão são muito raras em E. coli, para além da presença de TEM-1 e AmpC, o terceiro mecanismo provável, será uma alteração nas PBP-2, facto evidenciado pela resistência ao meciliname (Vaz-Pato, 18; Sougakof & Jarlier, 2000). Igualmente provável será a existência de uma OXA-3, a qual explicaria a resistência ao meciliname (Sougakof & Jarlier, 2000). Assim, a estirpe 153 terá três mecanismos essenciais de resistência às β-lactaminas: (1) Produção de TEM-1, (2) hiperexpressão de AmpC e (3) alterações nas PBP-2 ou produção de OXA CONCLUSÃO A ITU em cães causada por estirpes resistêntes pode provocar a fácil disseminação destas na comunidade canina fundamentalmente, devido ao comportamento social destes animais. Por outro lado, a Organização Mundial de Saúde relatou em 2001 um aumento do número de animais de estimação nos países Europeus (Sociedade Protectora dos Animais, 2002).