ASSOCIAÇÃO ENTRE RESULTADOS SOROLÓGICOS NO DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE E DA TRIP ANOSSOMÍASE CANINA, PELA TÉCNICA DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

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1 ISSN Veterinária e Zootecnía 39 ASSOCIAÇÃO ENTRE RESULTADOS SOROLÓGICOS NO DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE E DA TRIP ANOSSOMÍASE CANINA, PELA TÉCNICA DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA RESUMO Marcella Zampoli Troncarelli 1 Juliana Giantomassi Machad0 2 Luciana Bonato de Camargo ' Juliano Leônidas Hoilmann 4 Lucilene Camossi 5 Haroldo Greca 5 Patrícia Yoshida Faccioli 1 Helio Langoni". A leishmaniose visceral (L V) é uma zoonose causada por protozoário do gênero Leishmania, sendo o cão a principal fonte de infecção para o homem, especialmente em áreas urbanas. Na tripanossomíase, o cão é considerado o principal reservatório doméstico, principalmente devido a sua proximidade com o homem. Um dos métodos de diagnóstico soro lógico empregado para detectar a leishmaniose é a reação de imunofluorescência indireta (RlFI), embora possam ocorrer reações cruzadas com Trypanosoma cruzi. Com o objetivo de avaliar as reações cruzadas entre Leishmania e Trypanosoma, foram analisadas amostras de 826 soros de cães, submetidas à rotina diagnostica pela RlFI no Laboratório do Serviço de Diagnóstico de Zoonoses da FMVZ, UNESP, Botucatu, SP, durante o período de janeiro de 2005 a setembro de Utilizaram-se lâminas de imunofluorescência impregnadas com os antígenos de Leishmania major e de Tcruzi (cepa Y). Foram considerados positivos os títulos com fluorescência a partir da diluição 1:40 para Leishmania spp e 1:20 para Tcruzi. Do total de amostras analisadas, 656 (79,4%) foram negativas, tanto para Leishmania spp quanto para T cruzi e 15 amostras (1,8%) resultaram positivas para ambos parasitas, com títulos idênticos. Observou-se que 113 amostras (13,7%) resultaram positivas para ambos parasitas, porém com títulos para Leishmania spp maiores do que aqueles apresentados para T cruzi. Em apenas sete amostras (0,85%), o resultado foi positivo para Leishmania spp e T cruzi, porém com os títulos para T cruzi superiores àqueles apresentados para Leishmania spp. Em 21 amostras de soros (2,5%), os resultados foram positivos para Leishmania spp e negativos para T cruzi e em 14 soros (1,7%), os resultados foram positivos para T cruzi e negativos para Leishmania spp. Os resultados apresentados apontam para a importância da vigilância epidemiológica de ambas enfermidades, sendo que, nos casos de prováveis reações cruzadas, são necessárias outras técnicas laboratoriais, como a reação em cadeia da polimerase (PrR), para a confirmação diagnóstica. Mestranda da Área de Saúde Animal, Saúde Pública Veterinária e Segurança Alimentar, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia -- UNESP- Botucatu. matroncarelli(alyahoo.com.br 2 Doutoranda da Área de Saúde Animal. Saúde Pública Veterinária e Segurança Alimentar, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP- Botucatu. 3 Médica Veterinária 4 Mestrando do Programa de Doenças Tropicais da Faculdade de Medicina de Botucatu _. UNESP. ) Aprimorandos do Serviço de Diagnóstico de Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP- Botucatu. (, Professor Titular do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da FMVZ-1Jl\;ESP-Botucatu. Distrito de Rubião Juníor, s/no CEP: hlangoni@t1nvz.unesp.br o Troncarelli, M.Z. et. al. Associação entre resultados soro lógicos no diagnóstico da leishmaniose e da tripanossomíase canina, pela técnica de imunofluorescência indireta. Vet. e Zootec. v.l S, 11.1, abr., p.39-46,

2 ISSN Veterinária e Zootecnia 40 Palavras-chave: Leishmaniose, doença de Chagas, soroiogia, imunofluorescência indireta, cães. SEROLOGIC RESUL TS CORRELATION IN CANINE LEISHMANIASIS AND TRIPANOSOMIASIS DIAGNOSIS, BY INDIRECT IMMUNOFLUORESCENCE TECHNIQUE ABSTRACT Visceral Leishmaniasis (VL) is a zoonosis caused by Leishmania genus protozoan, being the dog the main source of infection for human, especially in urban areas. In case of tripanossomiasis, dogs are considered lhe most important domestic reservoirs, due its proximity to humans. One of the serologic diagnosis methods used to detect leishmaniasis is the indirect immunofluorescence antibody test (IF AT). However, cross-reactions with Trypanosoma cruzi can be observed. In order to evaluate the cross-reactioris between Leishmania spp and Trypanosoma, 826 dog s serum samples were submitted to the IFAT diagnostic routine in the Serviço de Diagnóstico de Zoonoses laboratory of FMVZ, UNESP. Botucatu, SP, during the period of January 2005 to September Irnmunofluorescence slides were impregnated with Leishmania major antigens for leishmaniasis diagnosis and another were impregnated with 'Lcruzi (Y strain) for tripanossomiasis diagnosis. The titles higher than or equal to 40 for Leishmania spp and titles higher than or equai to 20 for Tal/zi were considered positive. From the total of analyzed samples, 656 (79.4%) were negative for Leishmania and also for T cruzi and 15 samples (1.8%) were positive for both parasites. with identical titles. It was observed that 113 samples (13.7%) were positive for both parasites, however with higher titles for Leishmania spp when cornpared with those presented for T cruzi. 111 only seven samples (0.85%). lhe results were positive for Leishmania spp and T. ctu:i, however with lhe T cruzi titles higher than those presented for Leishmania spp. Twenty one serum samples (2.5%), were positive for Leishmania spp and negative for T cruzi and 14 samples (1.7%) were positive for T. cruzi and negatives for Leishmania spp. These results reinforce the irnportance of thc epidemiological vigilance for these two diseases, and determine that otber laboratorial techniques. such as polimerase chain reaction (PCR). are necessary for diagnostic confirrnation, if probable cross-reactions occur. Key words: Leishrnaniasis, Chagas Disease, serology, indirect imrnunofluorescence, dogs. ASSOCIACIÓN ENTRE RESULTADOS SOROLÓGICOS EN EL DIAGNÓSTICO DE LA LElSHMANIASIS Y DE LA TRIPANOSOMÍASlS CANINA, POR LA TÉCNICA DE IMUNOFLUORESCÉNCIA JNDIRECTA RESllMEN La Leishmaniasis VisceraI (LV) es una zoonosis causada por ei protozoario dei género Leishmania, siendo el peno Ia principal fuente de infección para el hombre, especialmente cn áreas urbanas. En caso de Ias tripanossomíasis, los perros son los animales domésticos considerados como principales reservórios, principalmente por su proximidad ai hombre. Uno de los métodos sorológicos usados para el diagnóstico de Ia leishrnaniasis es Ia reacción de imunofluorescência indirecta (RIFI), también reacciones cruzadas con el Trypanosoma cruz; pueden ser observadas. Con el objetivo de evaluar Ias reacciones cruzadas entre Leishmania spp y Trypanosomu, fueron cvaluadas 826 muestras de suero de perros, sometidos a Ia rutina Troncarelii, rvf.z. ct. al. Associação entre resultados soro lógicos no diagnóstico da leishrnaniose e da tripanossomíase canina, pela técnica de imunofluorescência indireta. Veto e Zootec. v.15, n.l, abr., p.39-4g,

3 ISSN Veterinária e Zootecnia 41 diagnostica de Ia RIFI en el Laboratorio de Serviço de Diagnóstico de Zoonoses de Ia FMVZ. UNESP, Botucatu, SP, durante el período de enero de 2005 a septiembre de Fueron utilizadas láminas de imunofluorescência impregnadas con los antígenos Leishtnania major para el diagnóstico de leishrnaniasis y Ia cepa Y de Trypanosoma cruzi para Ia diagnosis de tripanossorniasis. Los títulos con fluorescencia arriba de 40 para Leishinania spp íueran considerados positivos y los títulos arriba de 20 para Tcnci fueron considerados positivos. DeI total de muestras analizadas. 656 (79.4%) fucron negativas. tanto para Leishmania spp cuánto para el Ticruzi y 15 muestras (1.8%) íucron positivas para ambos parasitos. con los títulos idénticos. Fue observado que 113 muestras (13.7%) fueron positivas para ambos parasitos, pero con títulos superiores para Leishmania spp que para cl T cruzi. E11 solamente sicte mucstras (0.85%). cl resultado fue positivo para cl T'cruzi y para Lcishmania spp. con los títulos para el T cruzi superiores a Ias que se preseniaran para Leishmania spp. En 21 muestras de sueros (2.5 Ir,). los resultados fueran positivos para Leishmania spp y negativas para el T'cruzi y en 14 sucros (1.7%), los resultados íueran positivos para el 'Lcruzi y negativos para Leishmania spp. Estos resultados scnalan Ia importancia de Ia vigilancia epidemiológica de arnbas enferrnedades, siendo que, en los casos de reacciones cruzadas probables, otras técnicas laboratoriales son necesarias, como Ia reacción en cadena de polimerase (PCR). para Ia confirmación diagnóstica. Palabras-clavc: Leishmaniasis, Mal de Chagas, serología. imunofluorescência indirecta. perros. INTRODUÇÃO A leishmaniose visceral (LV) é uma zoonose causada por protozoário do gênero Lcishniania. sendo o cão a principal fonte de infecção para o homem. especialmente em áreas urbanas. Além da importância da infecção canina por Leishmania spp. deve-se atentar também para a infecção dos cães por Trypanosoma cruzi. pois, dentre os animais domésticos. os cães são considerados os principais reservatórios para tripanossomatídeos. principalmente devido a sua proximidade com o homem. A prcvalência de lcishmaniose canina em áreas endêrnicas do Brasil é bastante elevada. Um exemplo importante é o município de Bauru-SP onde. entre janeiro a novembro de 2007, cães foram cuianasiados no Centro de Controle de Zoonoses. scndo 835 (23.2%) animais soropositivos rara leishmaniose (Cláudia Gornieri. comunicação pessoal). Estudo de prevalência canina foi realizado em Uberlândia e Corornandel. municípios de Minas Gerais. Em Uberlândia foram examinados pela R1FI os soros de 230 cães, sendo 200 da área urbana. com 4.5% de positividade e 30 da área rural. dos quais 6,6% foram positivos. Em Corornandcl. 89 soros foram examinados. resultando em 5,6% de positividade (MAYW ALD et al ). Em estudo realizado pelo Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães, unidade da FIOCRUZ em Pernambuco, foram avaliados 322 cães no município de Paulista (PE). localizado no litoral norte da região metropolitana de Recife. Foram identificados 40,3% de cães sorologicamenle positivos para leishmaniose e, desses, 11,5 1 yo apresentavam sinais clínicos sugestivos (FIOCRUZ. 2007). Não se deve descartar, no entanto. a possibilidade de infecção canina por 'Lcruzi, pois apesar de existirem escassos estudos de soroprevalência no Brasil. a infecção de cães por este agente é possível. Em estudo realizado por Reycs c colaboradores (2002). verificou-se que. de 61 cães dorniciliados de áreas endêrnicas para Tcnl?Í. na Costa Rica. 5,2% foram soropositivos para este agente C. em 55 cães errantes, a soroposiiividade foi de 12l%. Em outro._ Troncarclli, M_Z. d_ al, Associação entre resultados soro lógicos nu diagnóstico da lcishmaniosc e da tripanossomíase canina, pela técnica de imunofluorescência indireta. Vet. e Zootec. v.15, 11.1, abr., p.39-46,

4 ISSN Veterinária e Zootecnia 42 estudo realizado no mesmo país, de 54 cães, 15 (27,7%) foram soropositivos para este parasita (MONTENEGRO et al., 2002). Lucheis et al. (2005) estudaram cinqüenta cães pertencentes a 30 indivíduos com doença de Chagas crônica, provenientes de 15 diferentes municípios da região oeste do Estado de São Paulo. Realizou-se o xenodiagnóstico artificial, hemo cultura e PCR para Tcruzi/T.rangeli. Quarenta e três soros de cães (86%) foram positivos em pelo menos um dos testes realizados. Ressalta-se ainda que existem áreas de sobreposição no Brasil, tanto de leishmaniose quanto de tripanossomíase, sendo que o cão pode apresentar esta co-infecção, como já verificado por Savani e colaboradores (2005). Em outros países este fato também tem sido demonstrado. Em muitas regiões da América do Sul, como a Província de Salta (Argentina), há uma sobreposição de áreas endêrnicas para tri panossomíase americana (doença de Chagas) e para leishmaniose. Um dos métodos de diagnóstico sorológico empregado para detectar a leishmaniose é a reação de imunof1uorescência indireta (RIFI). Apesar desta técnica apresentar elevada sensibilidade e especificidade, podem ocorrer reações cruzadas com Trypanosoma cruzi e outros antígenos (VERCAMMEN et al., 1997; ROSÁRIO, 2002; ZANETTE, 2006; FERREIRA et ai., 2007), principalmente se forem utilizados antígenos não purificados (BRENER et al ). A reação cruzada entre T cruzi e Leishmania spp em exames sorológicos já havia sido descrita por Camargo e Rebonato (1969), e é justificada, pois ambos parasitas compartilham vários antígenos (CHIARAMONTE et a1., 1996). Um estudo bastante específico sobre este tema foi realizado no Brasil por Vexenat e colaboradores (1996), e a ocorrência de reações cruzadas entre Trypanosoma cruzi, Leishmania chagasi e Leishmania (Viannia) braziliensis foi demonstrada. É importante ressaltar que as técnicas que utilizam antígenos totais são limitadas em termos de especificidade, apresentando reações cruzadas não somente com outras espécies da família Trypanosomatidae, mas também com outros organismos filogeneticamente distantes (RACHAMIN et ai., 1991; GONTIJO & MELO. 2004). Em artigo de revisão sobre métodos de diagnóstico da leishmaniose visceral canina realizado por IKEDA-GARCIA e MARCONDES (2007), relata-se também a possibilidade de ocorrência de reações cruzadas entre Leishmania e Tcruzi em diagnósticos soro lógicos. Com efeito, os resultados da RIF] não devem ser utilizados como indicadores de infecção leishmaniótica específica (COSTA et al., 1991; AL VES & BEVILACQUA, 2004). Portanto, no caso de haver reações cruzadas entre Tcruzi e Leishmania spp, deve-se levar em consideração o resultado sorológico associado aos fatores clínicos e epidemiológicos, bem como utilizar técnicas associadas para se chegar ao diagnóstico diferencial. Deve-se atentar para os sinais clínicos do animal, se este os apresentar, e à procedência do mesmo (área endêmica ou não para leishmaniose e doença de Chagas), presença de vetores (flebotomíneos, no caso da Ieishmaniose e triatorníneos, para a doença de Chagas) e o contato do cão com animais silvestres, já que estes também são reservatórios importantes, tanto de Leishmania spp quanto de 'Lcruzi. Com o objetivo de avaliar as reações cruzadas entre estas duas espécies de protozoários, foram analisadas amostras de 826 soros de cães, submetidas à rotina diagnóstica pela RTFI no Laboratório do Serviço de Diagnóstico de Zoonoses da FMVZ, UNESP, Botucatu-SP, durante o período de janeiro de 2005 a setembro de Troncarelli, M.l. ct. ai. Associação entre resultados soro lógicos tripanossomíase canina, pela técnica de imunofluorescência indireta. no diagnóstico Veto e Zootec. da leishmaniose e da v.15, n.l, abr., p.39-46,

5 ISSN Veterinária e Zootecnia 43 MATERIAL E MÉTODOS A técnica de RIFI foi realizada de acordo com Camargo (1966). As lâminas com o antígeno Leishmania major foram preparadas pipetando-se 10/lL da suspensão de promastigotas em cada um dos orifícios, retirando-se em seguida por aspiração, restando somente uma fina película. As lâminas foram secas em temperatura ambiente e mantidas em laminário a -20 C. até o momento do uso. por período máximo de duas semanas. Foram utilizadas microplacas para a diluição dos soros. pipetando-se 190/lL de PBS 0.01 M. ph 7.2 e 1O~lL do soro a ser testado no primeiro orifício, homogeneizando-se, perfazendo a diluição 1:20. Foram distribuídos 100/lL de PBS O.OlM, ph 7,2 em outras cinco cavidades e a partir da primeira diluição, transferindo-se 1OO~lL para o orifício seguinte, homogeneizando-se, repetindo até a quinta cavidade, desprezando-se os últimos. Essas diluições forneceram títulos 20, 40, 80, 160, 320 e 640. Da mesma forma, foram diluídas amostras de soros controles positivo e negativo. A diluição inicial utilizada foi 1:40. Em lâminas fixadas com o antígeno de L. major, foram distribuídos 10~lL de cada diluição nos orifícios, incubando-se a 37 C por 30 minutos em câmara úmida. A seguir, foram lavadas em jarras de coplin com PBS 7,2 por 10 minutos, por duas vezes consecutivas e secas em estufa. O conjugado espécie-específico foi diluído, segundo seu título pré-estabelecido, em solução de Azul de Evans a 20 mg% a qual foi previamente diluída em PBS 0,01M, ph 7,2 na proporção de 1:5. Foram distribuídos 1O~lL de conjugado para cada diluição, incubando-se novamente a 37 C por 30 minutos em câmara úmida. Procedeu-se nova lavagem em jarra de coplin com PBS 0,01 M. ph 7,2 por 10 minutos, duas vezes consecutivas, secando-se em estufa. As lâminas foram montadas com glicerina tarnponada ph 8,5, cobrindo-se com larninula 24x60mm, examinando-se em microscópio de imunofluorescência, no aumento 40 vezes. Após a leitura dos controles. foi procedido o exame das amostras em teste. considerando-se como título final a maior diluição do soro em que ainda ocorresse fluorescência completa na borda de pelo menos 50% das promastigotas. A RIFI para a detecção de anticorpos anti-tcruzi foi realizada da mesma forma que a técnica de RIFI descrita para Leishmania spp. porém a diluição inicial utilizada foi de 1:20, em solução salina tamponada O,OlM ph 7,2. como triagem da reação, e os soros foram testados para pesquisa de anticorpos IgG anti-tcruzi, como descrito por CAMARGO (1966). utilizando lâminas de irnunofluorescência impregnadas com antígenos de Ticruzi (cepa Y). O soro foi considerado como positivo a partir do título 20, pesquisando-se outras diluições sucessivamente, até onde se observasse fluorescência, obtendo-se o título final. RESULTADOS Como representado na Tabela I verifica-se que, do total de amostras analisadas, 656 (79,4%) foram negativas, tanto para Leishmania quanto para T cruzi e 15 amostras (1.8%) resultaram positivas para ambos parasitas, com títulos idênticos. Observou-se que 113 amostras (13,7%) resultaram positivas para ambos parasitas, porém com títulos para Leishmania maiores do que aqueles apresentados para T cruzi. Em apenas sete amostras (0,85%), o resultado foi positivo para Lcishmania e T cruzi, porém com os títulos para T cruzi superiores àqueles apresentados para Leishmania. Em 21 amostras (2,5%), os resultados foram positivos para Leishmania e negativos para T cruzi e em 14 (1,7%), os resultados foram positivos para T cruzi e negativos para Leishmania. A maioria das amostras positivas para Leishmania spp e Trypanosoma cruzi foi obtida de cães provenientes de região endêrnica (Bauru-Sl") para lcishrnaniose visccral canina, sugerindo assim reação cruzada ou co-infecção destas duas enfermidades. Sendo assim, para a confirmação diagnóstica, torna-se necessária a avaliação cpidemiológica e testes diagnósticos complementares mais precisos. Troncarelli, M.I. et. al. Associação entre resultados soro lógicos no diagnóstico da lcishrnaniose e da tripanossorniase canina, pela técnica de irnunofluorescência indireta. Veto e Zootec. v.15, n.l, abr., p.39-46, 2008_

6 ISSN Veterinária e Zootecnia 44 Tabela 1. Resultados da pesquisa de anticorpos anti-leishmania spp e anti-trypanosoma cruzi em amostras de soros caninos examinados no Serviço de Diagnóstico de Zoonoses, DHVSP, FMVZ, UNESP - Botucatu-SP, Leishmania sp~ (A) Trypanosoma cruzi (B) TOTAL A - Título da RIFT para Leishmania spp. B - Título da RTFI para Trypanosoma cruzi Número de amostras 113(A>B) 7 (B > A) 15 (A=B) % 13,7 0,8 ],8 2,5 1,7 79,5 100 DISCUSSÃO E CONCLUSÕES OS resultados do presente estudo sugerem a ocorrência de reações cruzadas sorológicas entre Leishtnania e T cruzi pela técnica de RTFI em soros caninos, já que houve um número elevado de amostras positivas onde se detectou a presença de anticorpos contra ambos parasitas. É importante ressaltar que, neste caso, os títulos de anticorpos anti- Leishmania foram quase sempre superiores aos títulos anti- T cruzi, sendo que em somente sete amostras ocorreu o contrário. Além disso, em somente 15 amostras os títulos contra ambos parasitas foram idênticos. Este é um indicador importante que pode auxiliar os clínicos, que devem também considerar os aspectos epidemiológicos envolvidos, além de realizar diagnósticos complementares nos animais, a fim de obter o diagnóstico definitivo. Estes resultados corroboram os apresentados em outros estudos realizados. como o de Lauricella et al. (1998) que. comparando o imunodiagnóstico da infecção por T criei em 182 cães naturalmente infectados na Argentina, por meio das técnicas de hcmaglutinação indireta (HAl), RTFl e Ensaio Tmunoenzimático (ELTSA), verificaram que o teste de ELISA apresentou 96,2% de espccificidade e 94% de sensibilidade. porém constatou-se que Leishmania spp e Tcruzi produziram reações cruzadas. Costa e colaboradores (2003), durante estudo de padronização da técnica de imunocromatografia para () diagnóstico de leishmaniose canina e comparação com a RIFI, verificaram que 100% dos 14 animais experimentalmente infectados com 'Lcruzi apresentaram sorologia positiva pela RTFT, tanto para Trypanosotna quanto para Leishmania, o que não ocorreu pelo método imunocromatográfico. Padilla e colaboradores (2002), em estudo sorológico para tripanossomíase e leishmaniose canina na Argentina, verificaram que dos soros de 208 cães, 62 (29.8%) foram positivos para Leishmania e 50 (24%) foram positivos para Ticruzi. Somente nove cães (4,3%) foram soropositivos para Ticruzi, quando se utilizou antígeno específico e purificado, o que sugere que exclusivamente estes animais estavam realmente infectados pelo Trypanosoma. Conclui-se, com base na literatura e nos resultados apresentados no presente estudo, que reações cruzadas para Leishmania spp e 'Lcruzi podem ocorrer à sorologia de amostras caninas. Com isso, se faz necessária a avaliação dos aspectos epidemiológicos envolvidos. além do uso de técnicas laboratoriais complementares, como a Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), para a confirmação diagnóstica. Ressalta-se ainda que a vigilância epidemiológica, tanto da Ieishmaniose corno da doença de Chagas é extremamente importante Troncarelli, M.Z. et. alo Associação entre resultados soro lógicos no diagnóstico da leishmaniose e da tripanossomíase canina, pela técnica de imunofluorescência indireta. Vet. e Zootec. v.15, n. I, abr., p.39-46,

7 ISSN Veterinária e Zootecnia 45 e deve ser permanentemente realizada, já que o cão é um importante reservatório para estas zoonoses. REFERÊN elas ALVES, W.A.: BEVILACQUA, P.D. Reflexões sobre a qualidade do diagnóstico da leishmaniose visceral canina em inquéritos epidemiológicos: o caso da epidemia de Belo Horizonte, Minas Gerais. Brasil, Cad. Saúde Pública, v.20, p , BRENER. Z.; ANDRADE, Z.A.; BARRAL-NETTO, M. Diagnóstico lahoratorial da infecção pelo Trypanosoma cruzi. In: BRENER, Z.; ANDRADE, Z.A. Trypanosoma cruri c doença de Chagas. 2.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, cap.17, p CAMARGO, M.E. Fluorescent antibody test for the sorodiagnosis of american tripanosorniasis: tcchnical modification employing preserved culture forms of Trypanosoma cruzi in a slide test. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, v.8, p , CAMARGO, M.E.; REBONATO, C. Cross-reactivity in fluorescence tests for Trypanosoma and Leishmania antibodies. A simple inhibition procedure to ensure specific results. Am. J. Trop. Med. Hyg., v.18, p , CH1i\.RAMO TE, M.O. et al. Trypanosoma cruzi and Leishmania spp. Human mixed infection. Arn, J. Trop. Med. Hyg., v.54, p , COSTA, c.a. et al. Leishmaniose visceral canina: avaliação da metodologia sorológica utilizada em inquéritos epidemiológicos. Rev. Soe. Bras. Med. Trop., v.24, p.21-25, COSTA, R.T. ct al. Standarization of a rapid immunochromatographic test with the recombinant aniigcns K39 and K26 for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis. Trans. R. Soe. Trop. Mcd. Hyg., v.97, p , FERRElRA, E.C. ct al. Comparison of serologica1 assays for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis in animals presenting different clinicalmanifestations. Veto Parasitol., v.146, p , F10CRUZ. Agência FIOCRUZ de Notícias. Cães apresentam alta incidência de leishmaniose em município pernarnbucano Disponível em: < Acesso em: out TIJO. C.M.F.: MELO, M.N. Leishmaniose visceral no Brasil: quadro atual, desafios e perspectivas. Rcv. Bras. Epidemiol., v.7, n.3, IKEDA-GARCIA. F.B.; MARCONDES, M. Métodos de diagnóstico da leishmaniose visceral canina. Rev. Clin. Vet., n.71, p.34-42, LAURICELLA, M.A. et al. Immunodiagnosis of Tripanosoma cruzi (Chagas'Disease) infection in naturally infected dogs, Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v.93, p , Troncarelli, M.Z. et. ai. Associação entre resultados sorojógicos no diagnóstico da leishmaniose e da tripanossomíase canina, pela técnica de imunofluorescência indireta. Veto e Zootec. v.15, n.l, abr., p.39-46,

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