NITROFURANOS EM AVICULTURA

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1 NITROFURANOS EM AVICULTURA Glenn Kennedy Chefe, Departamento de Vigilância Química Divisão de ciências veterinária (VSD) Departamento de agricultura & Desenvolvimento rural Belfast, Irlanda do norte, Reino Unido, Controle de resíduos na União Européia A União Européia (UE) pôs em prática uma série de medidas para proteger a saúde do consumidor e assegurar que os alimentos de origem animal produzidos dentro da UE e produzidos em outros países para serem exportados à UE, sejam seguros para o consumo. Os medicamentos veterinários autorizados são avaliados pela Agência de Avaliação de Medicamentos Européia. Baseado nessa avaliação, um Limite Máximo de Resíduo (LMR) é calculado para cada medicamento nos tecidos de cada espécie animal na qual o produto pode ser utilizado. São construídas grandes margens de segurança no cálculo de LMRs. Isto significa que uma concentração violativa (>LMR) em tecido não possa, necessariamente, ser um risco à saúde humana. Significa, porém, que o produto não é satisfatório para a finalidade de comércio internacional. Todos o LMRs são listados nos Anexos do Regulamento do Conselho 2377/90 1. Os compostos listados no Anexo I tiveram um LMR final estabelecido (por exemplo sulphonamidas). Os compostos listados no Anexo II não requerem nenhum LMR (por exemplo vitamina A). Os compostos que ainda estão sob avaliação recebem um LMR temporário e são listados no Anexo III. Um Anexo adicional para este regulamento (Anexo IV) lista aqueles compostos para os quais nenhum LMR pode ser fixado. Estes compostos não podem ser utilizados para animais produtores de alimento. O nitrofuranos estão incluídos neste grupo. Uso da droga nitrofurano na UE Os nitrofuranos são um grupo de combinações de antibacterianos. Os membros principais deste grupo são a furazolidona, furaltadona, nitrofurantoina e nitrofurazona. Elas são drogas relativamente de largo-espectro bactericida. São ativas contra Salmonella spp., coliformes, Mycoplasma spp., Coccidia spp. e alguns outros protozoários. O uso de todos os nitrofuranos, com a exceção da furazolidona foi proibido na UE em A proibição foi introduzida devido a preocupações em cima da carcinogenicidade destes produtos. Dois anos depois, a proibição foi estendida para cobrir a furazolidona. Novamente, as razões para a proibição eram a carcinogenicidade do composto, o metabolismo extenso da furazolidona e a falta de informação relativa à segurança de seus metabólitos 3. Desde então, tem sido proibido o uso de qualquer nitrofurano em qualquer animal dentro da UE, ou em qualquer animal destinado à exportação para a EU. 20

2 Monitoramento para resíduos de drogas veterinárias A UE requer para os Estados Membros (EM) o estabelecimento de programas 4 de Vigilância Nacional de Resíduos para monitorar alimentos de origem animal quanto a presença de medicamentos autorizados, compostos do Anexo IV e para resíduos dos promotores de crescimento hormonais e ß-agonistas que também são proibidos na UE 5. A UE exige para os EM que submetam planos de monitoramento para a Comissão para aprovação anualmente, e exige dos EM que informem os resultados à Comissão a cada ano. A Comissão também estabeleceu um sistema de Alerta Rápido para informar aos EM quando são descobertos resíduos potencialmente prejudiciais em produtos importados de terceiros(3 o ) países. Este sistema é projetado para acelerar as respostas dos EM quando tais resíduos são detectados. Exige-se, então, que todos os EM da UE, que testem seus produtos domésticos quanto a presença de nitrofuranos. Esta exigência tem estado em vigor desde antes destes compostos serem banidos nos anos noventa. Quando a furazolidona foi licenciada na UE, obteve um LMR provisório de 5 µg/kg (foi incluída naquele momento no Anexo III do Regulamento do Conselho 2377/90). O resíduo de marcador foi definido como "qualquer combinação que contenha um grupo 5-nitro intato" (Figura 1). Na prática, a maioria dos EM desenvolveu métodos analíticos para descobrir drogas desta família, normalmente baseado (naquele momento) em detecção em HPLC com UV. O O O 2 N O H C N N 5-nitro group Figura 1 A estrutura da furazolidona Detecção de nitrofuranos Em comum com a maioria dos outros laboratórios da UE, nós desenvolvemos um ensaio (LC-MS) para a detecção de furazolidona, no início dos anos noventa 6. Utilizando este método que teve um limite de detecção de 2 µg/kg, nós testamos várias centenas de rins de suínos (antes da proibição) para a presença de drogas da família furazolidona e nunca encontramos qualquer resultado positivo. Ou os criadores de suínos na Irlanda do Norte (IN) não estavam utilizando furazolidona ou nosso teste era ineficaz. Nós levamos a cabo uma série de experimentos com animais os quais mostraram que os resíduos de furazolidona eram muito instáveis nos tecidos dos animais tratados (até mesmo quando congelado). Além disso, nós pudemos mostrar 21

3 que as drogas da família eram muito rapidamente excretadas nos porcos tratados. A Figura 2 demonstra que as drogas da família da furazolidona podem ser detectadas em rins somente durante algumas horas depois do final de um período de cinco dias de tratamento de suínos (a furazolidona estava incorporada na dieta numa concentração de 400 mg/kg). Quando nós soubemos que a UE ia provavelmente proibir o uso da furazolidona, nós percebemos que nosso método LC-MS era de valor limitado. As concentrações de furazolidona nos tecidos eram baixas, a droga era excretada rapidamente de tecidos e os resíduos eram muito instáveis. Nós voltamos então para algum trabalho levado a cabo no final dos anos oitenta em RIKILT (na Holanda) para apoiar-nos. Eles tinham examinado o metabolismo da furazolidona e tinha demonstrado que a droga era capaz de formar resíduos intimamente ligados a tecidos. Eles demonstraram que o tratamento ácido moderado poderia liberar um composto chamado AOZ. Eles desenvolveram um método de HPLC para a detecção de AOZ e mostraram que ele era ao mesmo tempo estável e persistente nos tecidos de animais tratados. Nós então desenvolvemos um método para a detecção de AOZ em rins suínos 7 e demonstramos: a) que o AOZ poderia ser detectado em tecidos suínos (rim-figura 3) por longos períodos depois que o tratamento com a droga tinha cessado 8, e b) que 16% de 200 rins de porcos na Irlanda do Norte continham resíduos de AOZ 8. Isto confirmou que a testagem para furazolidona era inefetiva. Nós nunca tínhamos achado qualquer resíduo de furazolidona em suínos na Irlanda do Norte, mas estávamos habilitados a mostrar que ela era extensamente utilizada na indústria suína. Quando a proibição foi introduzida, nós estávamos em posição de monitorar o cumprimento da proibição do uso da furazolidona - mas, estávamos impossibilitados de controlar quaisquer das outras drogas de nitrofurano Furazolidone (µg/kg) Time (hours) Figura 2 22

4 1000 Concentration (µg/kg) Furazolidone AOZ Time (days) Figura 3 FoodBRAND e os métodos analíticos para drogas de nitrofurano O projeto FoodBRAND ( foi fundado pela Comissão Européia para retificar esta situação. FoodBRAND tem 4 objetivos principais: 1. Desenvolver testes de triagem para resíduos de nitrofurano ligados intimamente (aderidos) à tecidos. 2. Desenvolver um Método de Referência para resíduos de nitrofurano ligados à tecidos. 3. Avaliar a prevalência de resíduos ligados a tecidos em suínos dentro da UE. 4. Disseminar resultados para o Consumidor Europeu, a rede CRL/NRL e para a comunidade científica. Este projeto que tem parcerias em cinco Estados Membros da UE, Hungria e República Tcheca, teve a seu encargo a síntese de padrões de referência dos metabolitos putativos dos outros nitrofuranos. Inicialmente, a maioria destes padrões não estava disponível a partir de qualquer fonte comercial. Porém, com o surgimento da crise global dos nitrofuranos durante o último ano, agora existem várias fontes comerciais para estes padrões. Usando estes padrões, a equipe do FoodBRAND pôde desenvolver um método sensível para todos os quatro supostos metabólitos das drogas de nitrofurano. O método que emprega LC-MS-MS preenche o critério organizado pela UE para a inequívoca (sem dúvida) confirmação da presença destes metabólitos. Como resultado da emergência da crise dos nitrofuranos, a equipe do projeto FoodBRAND disseminou padrões analíticos e métodos para toda a rede de Laboratórios Nacionais de Referência da UE durante abril de Adicionalmente, o trabalho da equipe do projeto FoodBRAND é provável que resulte na comercialização de vários imunoensaios para metabólitos de nitrofurano durante Atualmente, o FoodBRAND está levando a cabo uma pesquisa para determinar a prevalência de 23

5 Tabela 1 Nitrofuranos e seus metabólitos sugeridos Droga Metabólito Furazolidona AOZ Furaltadona AMOZ Nitrofurantoina AHD Nitrofurazona SEM metabolitos de nitrofurano em produtos suínos, coletados principalmente em lojas e supermercados de toda a UE. Os resultados da pesquisa estarão logo disponíveis, e serão estudados de perto pela Comissão Européia, especialmente levando em conta os problemas relatados recentemente, de resíduos de nitrofurano em produtos avícolas de Portugal. Tolerância zero para substâncias proibidas A UE tem uma política de tolerância zero para resíduos de nitrofuranos. Qualquer concentração confirmada de qualquer dos metabólitos é um ofença. É permitido aos EM da UE condenar produtos quando são detectadas e confirmadas concentrações muito baixas dos metabólitos de nitrofurano sob a condição de que as autoridades competentes tenham confiança estatística suficiente no método analítico. A EU portanto, não estabelece limites de tolerância para os metabólitos de nitrofurano. Melhor ela está em processo de estabelecer um Limite de Desempenho Mínimo Exigido (MRPL) para métodos destinados à detecção de metabólitos de nitrofurano. O MRPL provisório (ainda a ser adotado oficialmente) é 1.0 µg/kg para metabólitos de nitrofurano em carne. Este termo causou muita confusão, dentro da UE e avança no campo. Isto não é um limite de tolerância. Isto não significa que uma concentração de 2 µg/kg de AOZ em carne de aves é inaceitável, enquanto uma concentração de 0.5 µg/kg é aceitável. O que significa é que todo o Estado Membro deve ser capaz de descobrir e confirmar metabólitos de nitrofurano ao MRPL ou abaixo se eles puderem. Isto é, portanto, uma meta que os piores laboratórios atuando têm que alcançar. Sob a condição de que o controle estatístico do método seja aceitável (como definido na Decisão da Comissão n.2002/657/ec) 9 os Estados Membros individualmente não tem nenhum limite para o mais baixo nível que possa ser relatado como positivo. Porém, na prática, a maioria dos EM, inclusive o Reino Unido, adotou "Limites de notificação" não oficiais para os nitrofuranos. Em carne de aves e seus produtos derivados, os limites de notificação para os nitrofuranos no REINO UNIDO (UK) são apresentados na Tabela 2. 24

6 Tabela 2 Limites de notificação para metabólitos de nitrofurano no Reino Unido (UK). Metabólito AOZ AMOZ AHD SEM Limite de notificação - UK 0.3 µg/kg 0.3 µg/kg 0.3 µg/kg 1.0 µg/kg Medidas preventivas da UE contra a Tailândia e o Brasil No início de 2002, VSD e RIKILT começaram a informar resultados positivos em um ampla escala de aves e produtos de aquacultura de um espectro muito largo de países, inclusive a Tailândia e o Brasil. Naquele momento, mais de 60% dos camarões tailandeses testados na UE foram identificados como contendo resíduos dos metabólitos de nitrofurano. Aproximadamente 10% das amostras de frango/pato tailandesas testadas, também continham resíduos de metabólitos de nitrofurano. Em aves brasileiras, a figura equivalente era aproximadamente 20%. A Comissão Européia reagiu depressa contra a Tailândia baixando a Decisão 2002/251/EC em 27 de março de Uma medida preventiva semelhante foi decretada contra o frango brasileiro em 27 de outubro de Estas decisões exigiram para todos os Estados Membros da UE que detivesse cada lote de aves e camarões tailandêses e frangos brasileiros no Posto de Inspeção de Fronteira onde primeiro entrou na UE. Amostras oficiais retiradas dos estoques consignados tiveram de ser testadas quanto a presença de metabólitos de nitrofuranos (e, no caso de Tailândia-cloramphenicol). Dependendo do resultado de laboratório, a carga em consignação ou seria permitida na cadeia alimentícia na UE (metabólito de nitrofurano não detectado ou não confirmado) ou seria destruída (metabólito de nitrofurano presente e confirmado). A amostragem e testagem oficial dos produtos tailandêses brasileiros foi implementada em todos os EM da UE. Onde os EM não tinham acesso a equipamento de LC-MS-MS, eles sub-contrataram o trabalho para outro laboratório com o equipamento necessário. Em ambos os países a taxa de violação caiu dramaticamente. Porém, ainda estão sendo encontrados metabólitos de nitrofuranos em produtos de aquacultura e avícolas da Tailândia e do Brasil. Causas de resíduos em aves Um dos piores eventos que uma nação exportadora de alimentos pode enfrentar é a rejeição e/ou destruição de produtos pelos seus clientes. Nações produtoras de alimentos estão sob a obrigação de assegurar que seus produtos atendem as especificações do cliente. Claramente, a presença de resíduos de antibióticos ilegais não preenche as exigências do consumidor europeu. Então, as nações produtoras de alimentos têm que tentar controlar os abusos de seu país através de uma combinação 25

7 de testes analíticos, controle de disponibilidade de droga e trabalho de campo na investigação/eliminação da causa de resíduos. Quando tenta-se identificar a causa de resíduos em frangos, é essencial examinar por inteiro a cadeia criador-frango quanto a possíveis problemas. A administração deliberada de nitrofuranos para as aves pode ter acontecido - mas é importante assegurar que outras possíveis causas sejam descartadas. O mercado internacional avícola é crescentemente dominado por organizações de integração - que têm controle completo sobre os criadores de frango, rações e frangos. Porém, apesar do controle que tais grandes organizações podem exercer, ainda é possível acontecerem problemas. Os exemplos seguintes podem não cobrir todos os problemas potenciais. Porém, eles servem como um ponto de partida para investigações adicionais. Em algumas destas áreas, trabalhos já feitos pela Veterinary Sciences Division (VSD) em suínos, ou sendo finalizados pela VSD em aves, podem ajudar a prover algumas das respostas. a) Matrizes avícolas - É reconhecido que os nitrofuranos podem acumular-se em ovos. Um trabalho levado a cabo na VSD 12 demonstrou que a furazolidona transfere-se prontamente através das camadas internas dos ovos. Uma característica bastante incomum do ovo é que é a droga mãe (furazolidona) se acumula no ovo (veja Figura 4). Um trabalho adicional está agora em desenvolvimento na VSD para ver se a droga persiste desde ovos de reprodutoras através do pintinho de um dia até a ave crescida. Estes estudos que estão sendo levados a cabo para todas as quatro drogas de nitrofurano estão em uma fase bastante inicial e poucos resultados estão atualmente disponíveis. b) Ingredientes de Rações - Os nitrofuranos estão proibidos no Brasil, Tailândia, Portugal e em toda parte. As rações não deveriam ter nenhum nitrofurano presente. Poré m, resíduos de metabólitos de nitrofuranos de fato ocorrem nestes países. Os produtores de frangos precisam assegurar-se de que as fábricas de rações também não produzam dietas para peixes ornamentais que contém nitrofuranos. Muitos medicamentos veterinários e aditivos alimentares são electrostáticos. Eles podem ficar retidos nos equipamentos das fábricas de rações em vários locais conduzindo à contaminação acidental de lotes posteriores de alimentos. Um dos melhores exemplos disto é o lasalocid. Lasalocid foi comercializado originalmente na UE como um pó. Entretanto, ele pode facilmente difundir-se desde um lote medicado (grupo 0, Figura 5) para os próximos (quatro-ton.) 9 lotes de alimento. Os fabricantes responderam introduzindo uma forma granular que era menos electrostática. Isto reduziu (mas não eliminou) o problema 13. Um trabalho adicional levado a cabo pela VSD demonstrou que a furazolidona também poderia ser retida desde um lote de alimento medicado para os próximos 2 lotes de alimento. Porém, este estudo que foi realizado em 1995, utilizou um método que possuía um limite de detecção muito alto (1.0 mg de furazolidona por kg de alimento). Os produtores precisam conferir todos os ingredientes de rações para ter certeza de que os nitrofuranos (ou seus metabólitos) não estão presentes. Resultados obtidos da Tailândia sugerem que alguns alimentos prontos e ingredientes de rações (ex.: mixes de vitamina) contêm baixos níveis de nitrofuranos. Outra possível fonte de contaminação são as cascas de camarões. 26

8 1000 Concentration (µg/kg) 100 Furazolidone AOZ Time fed diet (days) Figura 4 Cascas de camarões tratados podem conter resíduos de nitrofuranos a concentrações várias vezes mais altas que a carne de camarão. Se cascas de camarões são usadas como uma fonte de cálcio em dietas avícolas, existe o potencial para acontecer a contaminação de rações. Outra série de experimentos está em andamento na VSD para ajudar a equacionar este assunto. Vinte grupos de frangos foram alimentados com um dos quatro nitrofuranos, em concentrações que variaram de 0.01 a 1.0% da dose terapêutica. Estas dietas foram fornecidas durante 8 dias. O fígado e músculos das aves estão sendo analisados quanto a presença do metabólito apropriado. Alguns destes resultados estão agora disponíveis. O quadro que está emergindo indica que mesmo concentrações muito baixas em rações podem causar resíduos nas aves acima dos limites notificáveis para o REINO UNIDO. A Figure 6 mostra que até mesmo 30 µg de furazolidona por kg de ração (aproximadamente 0.01% da dose terapêutica) causará resíduos no fígado de aves a 1.0 µg/kg. c) Contaminação durante o transporte - Uma série de experimentos, realizados pela VSD, examinou a capacidade de suínos não tratados em acumular AOZ nos tecidos, como resultado da breve exposição em alojamento contaminado (ex.: durante o transporte ou ao repousarem) 8. Suínos estavam com a furazolidona na dieta (400 mg/kg durante 5 dias). Ao término deste período, estes suínos foram removidos. A baia foi raspada e limpa, com o alimento residual, fezes e urina sendo removidos. Um grupo de porcos sem tratar foi posto então no alojamento. Estes foram abatidos 27

9 % " $ # " IV SIMPÓSIO BRASIL SUL DE AVICULTURA após um período de 24 horas. O AOZ foi avaliado no rim. Os resultados mostraram (Figura 7) que até mesmo uma exposição muito pequena em alojamento contaminado resultou na detecção de resíduos de AOZ em rim de suíno. Depois que este experimento foi finalizado, a baia vazia foi novamente limpa (como descrito acima) e então lavada com água corrente. Foram postos dois suínos na baia por 24 h. As concentrações de AOZ foram medidas nos tecidos suínos (Tabela 3). Estes dados demonstraram que o AOZ transfere-se muito facilmente como resultado de uma breve exposição em alojamento contaminado.! P o w d er G ran u lar Figura 5 Tabela 3 Concentrações de AOZ em suínos não tratados. Tecido AOZ (µg/kg) Fígado 23 Rim 3.5 Músculo 0.4 SEM

10 25 20 Liver AOZ (µg/kg) Furazolidone (mg/kg) Figura 6 Figura 7 Kidney AOZ in pigs exposed to contaminated housing 29

11 O Consumidor IV SIMPÓSIO BRASIL SUL DE AVICULTURA Não interessa ao consumidor de frango se os resíduos de AOZ estão presentes como resultado de contaminação ou abuso. O consumidor quer carne livre de resíduos ilegais. Uma série de estudos foi conduzida na VSD para observar se resíduos de AOZ permaneciam estáveis após o cozimento e observar se os resíduos de AOZ na carne poderiam ser absorvidos pelos consumidores 14. a) Estabilidade depois de cozinhar - Consumidores normalmente comem carne cozida. Em muitos casos, é útil saber se um resíduo veterinário no alimento é estável durante o processo de cozimento. Já é bem conhecido que muitos resíduos de drogas veterinárias são instáveis após o cozimento. Por exemplo, penicilinas e nitrofuranos (moléculas originais) desaparecem muito rapidamente. Porém, a Tabela 4 demonstra que o AOZ estava muito estável após uma série de processos culinários. Tabela 4 Estabilidade do AOZ após o cozimento Tecido Concentração total de AOZ (µg/kg) Método de Cozimento Crú Frito Grelhado Microondas Fígado Rim Músculo b) Absorção de AOZ da dieta - O estudo final relatado aqui examinou a habilidade de ratos (simulando seres humanos) em absorver AOZ através da dieta. Para viabilizar isto, foi produzido fígado suíno contendo AOZ. Um porco foi alimentado com furazolidona (300 mg/kg) durante 5 dias. O fígado do suíno foi coletado e lavado extensivamente para permanecerem apenas resíduos intimamente ligados de nitrofuranos (bound residues). Este fígado foi então fornecido a ratos durante 3 dias. Ao final deste período os tecidos de rato foram testados quanto a presença de AOZ. Tabela 5 Absorção de AOZ da dieta pelos ratos. Tecido AOZ ligado AOZ 4Extrativo (µg/kg) (µg/kg) Fígado Rim Músculo

12 Conclusões O desenvolvimento de novos métodos analíticos para detectar os resíduos ligados dos antibióticos ilegais nitrofuranos, revelou o difundido uso indevido destes compostos através do Sul e Sudeste da Ásia, Brasil e Portugal. A probabilidade de uso indevido destes produtos é fortalecida porque eles são baratos, efetivos e (até recentemente) difíceis de detectar. O achado de resíduos de nitrofurano em camarões e produtos avícolas pelo mundo inteiro conduziu a UE (até hoje) a tomar medidas preventivas contra a Tailândia e Brasil, sujeitando os produtos destes países à extensivas análises nos Postos de Inspeção de Fronteira da UE. As autoridades competentes e os produtores primários nos países afetados, atualmente, estão tentando erradicar dos seus sistemas de produção, o uso indevido desta droga. Porém, eles também deveriam estar atentos para o fato de que resíduos ilegais em rações podem surgir como resultado de contaminação acidental de alimentos, premix vitamínicos, etc. Trabalhos experimentais demonstraram que até mesmo um baixo nível de contaminação de alimentos pode causar resíduos proibidos em carne de aves. Referências 1- Council Regulation 2377/90. Official Journal of the European Communities (1990), L224, Council Regulation 2901/93. Official Journal of the European Communities (1993), L264, Council Regulation 1442/95. Official Journal of the European Communities (1995), L143, Council Directive 96/23/EC. Official Journal of the European Communities (1996), L125, Council Directive 96/22/EC. Official Journal of the European Communities (1996), L125, McCRACKEN, R. J.; BLANCHFLOWER, W. J.; ROWAN, C.; McCOY, M. A. and KENNEDY, D. G. (1995). Determination of furazolidone in porcine tissues using thermospray liquid chromatography - mass spectrometry and a study of the pharmacokinetics and stability of its residues. Analyst, 120, McCRACKEN, R. J.; and KENNEDY, D. G. (1997). Determination of the furazolidone metabolite, 3-amino-2-oxazolidinone, in porcine tissues using liquid chromatographythermospray mass spectrometry and the occurrence of residues in pigs produced in Northern Ireland. Journal of Chromatography B, Biomedical Applications. 691,

13 8- McCRACKEN, R. J., McCOY, M. A. and KENNEDY, D. G. (1997). The prevalence and possible causes of bound and extractable residues of the furazolidone metabolite: 9-3-amino-2-oxazolidinone in porcine tissues. Food Additives and Contaminants, 14, Commission Decision 2002/657/EC. Official Journal of the European Communities (2002), L221, Commission Decision 2002/251/EC. Official Journal of the European Communities (2002), L84, Commission Decision 2002/794/EC. Official Journal of the European Communities (2002), L276, McCRACKEN, R. J.; SPENCE D. E.; FLOYD, S. D. and KENNEDY D. G. (2001). Evaluation of the residues of furazolidone and its metabolite, 3-amino-2-oxazolidinone in eggs. Food Additives and Contaminants, 18, KENNEDY, D. G.; HUGHES, P. J. and BLANCHFLOWER, W. J. (1998). Ionophore residues in eggs in Northern Ireland: incidence and cause. Food Additives and Contaminants. 15, McCRACKEN, R. J.; and KENNEDY, D. G. (1997). The bioavailability of residues of the furazolidone metabolite, 3-amino-2-oxazolidinone, in porcine tissues and the effect of cooking upon residue concentrations. Food Additives and Contaminants, 14, Agradecimento: Ao Dr. Paulo Roberto Souza da Silveira, pesquisador da Embrapa Suínos e Aves pela tradução dessa palestra. 32