NITERÓI 2008 FRANCISCO FERREIRA LIMA JÚNIOR

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1 CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS FACULDADE DE VETERINÁRIA PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL FRANCISCO FERREIRA LIMA JÚNIOR DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DE LACTATO DESIDROGENASE E FOSFATASE ALCALINA NO SORO E NO FLUIDO ABDOMINAL DE CÃES (Canis familiaris Linnaeus 1758) PARA CLASSIFICAÇÃO DAS EFUSÕES E DIFERENCIAÇÃO ENTRE FLUIDOS NEOPLÁSICOS E NÃO NEOPLÁSICOS NITERÓI 2008 FRANCISCO FERREIRA LIMA JÚNIOR

2 2 DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DE LACTATO DESIDROGENASE E FOSFATASE ALCALINA NO SORO E NO FLUIDO ABDOMINAL DE CÃES (Canis familiaris Linnaeus 1758) PARA CLASSIFICAÇÃO DAS EFUSÕES E DIFERENCIAÇÃO ENTRE FLUIDOS NEOPLÁSICOS E NÃO NEOPLÁSICOS Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal. Orientador: Prof. Dr. NAYRO XAVIER DE ALENCAR NITERÓI 2008

3 3 FRANCISCO FERREIRA LIMA JÚNIOR DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DE LACTATO DESIDROGENASE E FOSFATASE ALCALINA NO SORO E NO FLUIDO ABDOMINAL DE CÃES (Canis familiaris Linnaeus 1758) PARA CLASSIFICAÇÃO DAS EFUSÕES E DIFERENCIAÇÃO ENTRE FLUIDOS NEOPLÁSICOS E NÃO NEOPLÁSICOS Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal. Aprovado em Abril de BANCA EXAMINADORA PROF. DR. NAYRO XAVIER DE ALENCAR Orientador UFF PROFA. DRA. MÁRCIA CAROLINA SALOMÃO SANTOS UFF PROF. DR. RAIMUNDO SOUZA LOPES UNESP/BOTUCATU NITERÓI 2008

4 À minha mãe Wildnísia que me incentivou nos momentos mais difíceis desse caminho estreito e longo, rumo à docência do ensino superior. 4

5 5 AGRADECIMENTOS Ao meu orientador, pelos ensinamentos passados e pelo estímulo constante de luta e determinação, que me auxiliaram bastante. À professora Keila, pelo valioso auxílio e orientação em relação às análises estatísticas desse trabalho. Ao meu pai Francisco, que sempre me mostrou valores éticos e morais principalmente no tocante à nossa profissão. Aos meus irmãos Frederico e Micheline, pela amizade e cumplicidade que sempre tiveram comigo. À minha namorada, pelo companheirismo, amor e paciência que tem comigo. A todos os colegas que contribuíram para a execução dessa pesquisa, em especial a Katrin Paim e Damasceno Filho. Aos amigos cariocas: Daniel Lessa, Diogo, Juliana Jorge, Gracy, Gilberto, Guilherme, Gustavo e Leonardo, pela troca de idéias durante esse período. À Deus, que me iluminou no cumprimento de mais uma missão na vida. E a você que achava que tinha sido esquecido, mas que no momento em que precisei de tão pouco teve tanto a me oferecer: OBRIGADO!

6 6 RESUMO O acúmulo de fluido no interior da cavidade abdominal é denominado ascite. A formação de efusão pode ser decorrente de várias enfermidades e, nessa situação, a coleta do fluido tem valor terapêutico, bem como a avaliação tem importância diagnóstica nas doenças hemorrágicas, inflamatórias, cardiovasculares, linfáticas, biliares ou neoplásicas. Esta pesquisa teve como objetivo, mensurar as atividades das enzimas fosfatase alcalina (FA) e lactato desidrogenase (LDH) no fluido abdominal e no soro de cães, estabelecendo sua utilidade para diferenciação dos fluidos classificados como transudato, transudato modificado e exsudato, bem como na separação de efusões neoplásicas das não neoplásicas. Foram utilizados 16 cães portadores de efusão abdominal, atendidos pelo setor de clínica médica de pequenos animais no Hospital Universitário de Medicina Veterinária Firmino Mársico Filho (UFF) e demais clínicas veterinárias de Niterói e do Rio de Janeiro (RJ). Foram coletadas amostras de sangue e fluido abdominal, encaminhando-se este material para análise laboratorial. Após o processamento das amostras, quatro foram classificadas como transudatos, oito como transudatos modificados e quatro como exsudatos. A atividade da LDH no fluido e sua relação fluido/soro, conseguiram diferenciar os transudatos dos transudatos modificados e exsudatos. Já a atividade sérica de LDH desses cães não possibilitou a diferenciação entre os três grupos. Os níveis de FA no fluido e no soro desses cães, também não conseguiram estabelecer diferenças entre os três grupos. Em contraste, a relação fluido/soro de FA conseguiu diferenciar os transudatos dos transudatos modificados e exsudatos. A distinção do grupo neoplásico em relação ao não neoplásico se deu pela atividade da LDH no fluido, pela sua relação fluido/soro e pela celularidade. Esta separação não ocorreu quando a atividade da FA foi mensurada no fluido, no soro e na relação fluido/soro. Os resultados sugerem que a LDH pode ser um eficiente marcador bioquímico para separação dos fluidos neoplásicos e não neoplásicos, podendo auxiliar na classificação das efusões abdominais. A fosfatase alcalina não demonstrou resultados satisfatórios de forma geral. Palavras-Chave: ascite, cão, marcadores bioquímicos, neoplasia. ABSTRACT The accumulation of fluid in the abdominal cavity is called ascite. The formation of effusion can be the result of several illnesses and, in this situation, the collection of the fluid have a therapeutic value, as well as the evaluation have diagnostic importance in lymphatic, cardiovascular, inflammatory, hemorrhagic, biliary or neoplasic diseases. The main goal of this survey was to measure the activity of alkaline phosphatase enzymes (ALP) and lactate dehydrogenase (LDH) in the abdominal fluid and serum to determine its availability to the differentiation of fluids classified as transudate, modified transudate and exudate as well as in the distinction of neoplasic to nonneoplasic effusions. Sixteen dogs with abdominal effusion were used, supervisioned by the small animal medical clinic subdivision of the Hospital Universitario de Medicina Veterinaria Firmino Marsico Filho (UFF) and further veterinary clinics from Niteroi city and Rio de Janeiro state (RJ). Blood and abdominal fluid samples were collected and analyzed quickly in the laboratory. After the sample processing, four abdominal fluids were classified as transudate, eight as modified transudate

7 7 and four as exudate. The activity of lactate dehydrogenase (LDH) in the fluid and its fluid/serum ratio enabled the differentiation of transudate from modified transudate and exudate. The serum activity of LDH in these dogs did not differentiate the three groups. It was not possible to determine differences between the three groups using the ALP levels in the fluid and in the serum of these dogs. However, the ALP fluid/serum ratio differentiated the transudates from the modified transudates and exudates. The distinction between the neoplasic and non-neoplasic groups was noted by the LDH activity in the fluid, its fluid/serum ratio and cellularity. This distinction didn t occurred when ALP activity was measured in the fluid, in the serum and in the fluid/serum ratio. The results suggest that LDH can be used as an efficient biochemistry marker to the separation of neoplasic and non-neoplasic effusion, and help in the abdominal effusion classifications. Alkaline phosphatase doesn t demonstrated satisfactory results. Key-words: ascite, dog, biochemistry markers, neoplasia.

8 8 LISTA DE TABELAS TABELA 1 - TABELA 2- TABELA 3- TABELA 4- TABELA 5- TABELA 6- Valores de referência da Fosfatase Alcalina (FA) e Lactato Desidrogenase (LDH) em cães saudáveis. Niterói RJ, UFF, 2008, p.30 Resultados das análises da Lactato Desidrogenase (LDH) nos grupos transudato, transudato modificado e exsudato. Niterói RJ, UFF, 2008, p.35 Resultados das análises da Fosfatase Alcalina (FA) nos grupos transudato, transudato modificado e exsudato. Niterói RJ, UFF, 2008, p.38 Distribuição de freqüências dos fluidos neoplásicos e não neoplásicos nos grupos transudato (T), transudato modificado (TM) e exsudato (E). Niterói RJ, UFF, 2008, p.41 Valores das médias e desvios-padrão das concentrações de Lactato Desidrogenase (LDH) e Fosfatase Alcalina (FA) no fluido, soro e na relação fluido/soro encontrados nos grupos neoplásicos e não neoplásicos. Niterói RJ, UFF, 2008, p.41 Valores de Lactato Desidrogenase (LDH) e Fosfatase Alcalina (FA) mensurados no fluido dos grupos neoplásicos e não neoplásicos. Niterói RJ, UFF, 2008, p.43

9 9 LISTA DE ILUSTRAÇÕES FIGURA 1- Cão, Macho, 13 anos. Tricotomia e antissepsia do abdômen ventral (A, B) com povidine. Introdução de cateter 20G no tecido subcutâneo (C, D). Niterói RJ, UFF, 2008, p.25 FIGURA 2- Cão, Macho, 13 anos. Cateter 20G inclinado para subseqüente introdução na cavidade abdominal (E). Paracentese abdominal (F, G). Fluido removido - 225mL (H). Niterói RJ, UFF, 2008, p.26 FIGURA 3- Analisador bioquímico semi-automático, modelo BIO F. Niterói RJ, UFF, 2008, p.30 FIGURA 4- A e B Grande quantidade de neutrófilos exibindo moderado grau de degeneração 100X e 200X; C Células epiteliais displásicas formação acinar (seta branca) 400X; D Células mesoteliais reativas (seta branca) e displásicas (seta preta) em grupos ou isoladas 400X; E e F Linfoblastos anisocitose, basofilia e microvacuolização citoplasmática, multinucleação (seta preta) e nucléolos evidentes 400X. Niterói RJ, UFF, 2008, p.33 FIGURA 5- FIGURA 6- FIGURA 7- Medianas das atividades da Lactato Desidrogenase (LDH) no soro e fluido dos grupos classificados como transudato, transudato modificado e exsudato. Niterói RJ, UFF, 2008, p.36 Medianas das atividades da Fosfatase Alcalina (FA) no soro e fluido dos grupos classificados como transudato, transudato modificado e exsudato. Niterói RJ, UFF, 2008, p.39 Associação da Lactato Desidrogenase e Fosfatase Alcalina para classificação do fluido abdominal. Niterói RJ, UFF, 2008, p. 44

10 10 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS CTI Centro de Terapia Intensiva ºC grau celsius EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético FA Fosfatase Alcalina g/dl grama por decilitro g Força relativa da centrífuga HUMVFMF Hospital Universitário de Medicina Veterinária Firmino Márcico Filho INPA Instituto Nacional de Proteção Animal LDH Lactato Desidrogenase mg/dl miligrama por decilitro µl microlitro µm micrômetro PCR Reação em Cadeia da Polimerase rpm rotações por minuto SPSS Statistical Package for the Social Science U.I. Unidade Internacional U/L Unidade por Litro U.S. Unidade Sigma VETMAR Clínica Veterinária Mário Ronconi x Média s Desvio-padrão C.V. Coeficiente de variação

11 11 L732 Lima Júnior, Francisco Ferreira. Determinação das concentrações de lactato desidrogenase e fosfatase alcalina no soro e no fluido abdominal de cães (Canis familiaris Linnaeus 1758) para classificação das efusões e diferenciação entre fluidos neoplásicos e não neoplásicos / Francisco Ferreira Lima Júnior. Niterói: [s.n.], f. Dissertação (Mestrado em Clínica e Reprodução Animal) Universidade Federal Fluminense, Orientador: Nayro Xavier de Alencar 1. Patologia Clínica Veterinária. 2. Cão. 3. Ascite. 4. Marcador Bioquímico. 5. Neoplasia. I. Título CDD

12 12 SUMÁRIO RESUMO, p. VI ABSTRACT, p. VII LISTA DE TABELAS, p. VIII LISTA DE ILUSTRAÇÕES, p. IX LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS, p. X

13 1- INTRODUÇÃO O peritônio é uma membrana serosa composta por células mesoteliais que se sobrepõe a uma camada de colágeno, fibras elásticas, células adiposas e reticulares. Sua porção parietal reveste a fáscia transversal da parede abdominal, e a porção visceral envolve as vísceras abdominais (KRUTH, 2004). Ascite significa o acúmulo de fluido na cavidade peritoneal. Classicamente esta definição aplica-se aos fluidos transudativos e exsudativos, podendo ser utilizada também quando se refere ao acúmulo de sangue, quilo, urina ou bile (KING e GELENS, 1992). Ressalta-se que algumas causas de ascite em cães incluem hipertensão portal, hipoproteinemia, neoplasias abdominais, peritonite, coagulopatias, trauma e obstruções na drenagem linfática (NESTOR et al., 2004). O aumento da pressão hidrostática no interior dos vasos sanguíneos, a queda da pressão oncótica plasmática, as obstruções linfáticas e a alteração da permeabilidade vascular, são os mecanismos primários de formação das efusões. Além desses mecanismos e colaborando com eles, devem ser consideradas as enfermidades relacionadas à retenção de sódio, que facilitam a formação de edemas e efusões, visto que, o sódio total do organismo é o principal determinante do volume fluídico extracelular (KUMAR et al., 1994; SMITH et al., 1972). O cão portador de ascite apresenta aumento abdominal, ganho de peso, atividade reduzida, inapetência e frequência respiratória aumentada. A taquipnéia pode resultar de deslocamento cranial do diafragma por massas ou líquido, causando ventilação restrita (KRUTH, 2004). Para determinar a classificação do fluido ascítico, se faz necessário a realização prévia de abdominocentese. Tal procedimento deve ser realizado com agulha ou cateter, após tricotomia e preparo cirúrgico com povidine em uma área entre a bexiga e o umbigo, próxima à linha média (BOOTHE, 1998; SHELLY, 2003). As amostras devem ser acondicionadas em tubos com e sem anticoagulante (ácido etilenodiaminotetracético EDTA), e encaminhadas para

14 2 análise laboratorial das características físico-químicas, citológicas e bioquímicas (COWELL et al., 1999). As efusões são geralmente classificadas como transudatos, transudatos modificados e exsudatos, dependendo da concentração de proteínas, contagem de células nucleadas e tipos celulares presentes (MEYER e FRANKS, 1993). As células mais comumente encontradas em efusões são os macrófagos, linfócitos, células mesoteliais, neutrófilos, hemácias, eosinófilos, mastócitos e células neoplásicas (COWELL et al., 1993). Algumas efusões são oriundas de enfermidades específicas, como a efusão quilosa, hemorrágica, neoplásica, biliar, eosinofílica, parasitária e uroperitônio (SHELLY, 2003; COWELL et al., 1999). Em humanos, alguns parâmetros bioquímicos aferidos no fluido abdominal têm auxiliado na detecção da causa da efusão, particularmente quando diferenciam efusões neoplásicas de efusões associadas à cirrose e tuberculose (BANSAL et al., 1998). A lactato desidrogenase (LDH) foi utilizada como marcador bioquímico de fluidos abdominais e pleurais em humanos, auxiliando na diferenciação entre transudatos e exsudatos (PARAMOTHAYAN e BARRON, 2002). As concentrações de fosfatase alcalina (FA) também demonstraram seu valor, quando mensuradas no fluido abdominal de outras espécies, a exemplo dos caprinos e eqüinos (NAZIFI et al., 2000; SAULEZ et al., 2004). De acordo com Metintas et al. (1997), a mesma enzima (FA) quando mensurada no fluido pleural e no soro de humanos, demonstrou ser um bom marcador bioquímico, auxiliando na diferenciação entre transudatos e exsudatos. A relação fluido/soro dessa enzima também possibilitou a diferenciação entre os grupos. O presente trabalho teve como objetivo mensurar as concentrações de LDH e FA no soro sanguíneo e em fluidos abdominais de cães, com o intuito de demonstrar a eficácia dessas enzimas como marcadores bioquímicos para separação entre transudatos, transudatos modificados e exsudatos. Objetivouse também com esse trabalho, separar as efusões neoplásicas das não neoplásicas através desses possíveis marcadores, em conjunto com a celularidade dos líquidos dos grupos

15 3 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 ESPAÇO PERITONEAL O peritônio é uma membrana serosa e delgada que anatomicamente divide-se em três camadas: parietal, visceral e de conexão, sendo todas interligadas. A camada parietal reveste a superfície interna da cavidade abdominal, encontrando-se aderida a musculatura do abdômen que separa os espaços extra e intraperitoneais. O revestimento completo ou em partes dos órgãos da cavidade abdominal é feito pela camada visceral. A camada de conexão envolve o mesentério, omento e ligamentos intra-abdominais. O espaço retroperitoneal situa-se entre a margem dorsal do peritônio parietal e a parede abdominal. Este espaço acomoda as glândulas adrenais, rins, ureteres, vasos sanguíneos calibrosos e linfonodos (MAHAFFEY e BARBER, 1998). 2.2 FISIOPATOLOGIA DA ASCITE Aproximadamente dois terços da água total do organismo encontra-se no interior das células; o restante compõe o fluido extracelular, que encontrase distribuído entre o compartimento vascular e o espaço intersticial (BRIGHT, 1995). A análise quantitativa de como as pressões osmótica e hidrostática afetam o movimento da água através das paredes capilares, foi inicialmente obtida por Starling (1892), citado por Hyatt e Smith (1954). Portanto, a interação das pressões osmótica e hidrostática ficou conhecida como o equilíbrio das forças de Starling (CUNNINGHAM, 1992). Normalmente, a relação eficiente entre essas pressões nos espaços vascular e intersticial, quando associada à drenagem linfática adequada, correspondem aos fatores responsáveis pela filtração e absorção de líquidos na microcirculação, não ocorrendo desta maneira acúmulo de líquido intersticial (ROCHA e SILVA, 1994).

16 4 O líquido abdominal é um ultrafiltrado plasmático. Em cães, a cavidade peritoneal contém 0-15mL de líquido com coloração amarelo-palha, ph 7,4, densidade de 1,016, concentração protéica < 3,0g/dL e contagem celular < 3000/µL (FELDMAN, 1984). Normalmente, esta pequena quantidade de fluido tem a função de facilitar uma melhor movimentação dos órgãos abdominais (MEYER e FRANKS, 1993). O desenvolvimento do quadro efusivo, se dá principalmente devido ao aumento da pressão hidrostática no espaço intravascular, a queda da pressão coloidosmótica, as obstruções linfáticas, e por fim a alteração na permeabilidade vascular (MEGNER e TRUMP, 2002). A elevação da pressão hidrostática intravascular aumenta a pressão de filtração, promovendo um fluxo maior de fluido para o espaço intersticial (NETO et al., 1999). Neste caso, a presença da cirrose hepática associada com a obstrução do fluxo sanguíneo portal, e da insuficiência cardíaca com o processo de congestão hepática são comuns para o desenvolvimento da ascite (JONES et al., 1996; MEGNER e TRUMP, 2002). As concentrações plasmáticas de albumina e globulina, determinam a diferença de pressão existente entre os compartimentos intravascular e intersticial. Ao ocorrer esse evento, a predominância da pressão hidrostática do sangue e, uma posterior saída de fluido para o interstício se dá devido a uma queda da pressão coloidosmótica do plasma (CUNNINGHAM, 1992; JONES et al., 1996). As enfermidades hepáticas e renais (síndrome nefrótica), presença de endoparasitas e dietas com baixo teor protéico, são as principais causas da diminuição da pressão coloidosmótica plasmática (SMITH et al., 1972). O acúmulo de linfa nas cavidades corporais é provocado pelo bloqueio dos vasos linfáticos, quando esses são comprometidos por neoplasias, processos inflamatórios, infecciosos e por cirurgia. Nesses casos, o fluxo normal do líquido intersticial para os vasos linfáticos fica impedido. Ocorre dilatação dos vasos linfáticos e, se esses estiverem próximos às superfícies serosas que revestem as cavidades corporais, podem extravasar causando um quadro efusivo (CHEVILLE, 2004; SMITH et al., 1972; SHIBATA, 2006). A permeabilidade vascular quando aumentada, permite o extravasamento de um fluido rico em proteínas, reduzindo a pressão

17 5 coloidosmótica intravascular e elevando a pressão coloidosmótica intersticial. O comprometimento da permeabilidade vascular é um evento característico de processos inflamatórios, possibilitando desta forma, a liberação de substâncias como prostaglandinas, histamina, heparina e serotonina, que promovem vasodilatação e aumento da permeabilidade endotelial (CUNNINGHAM, 1992; CHEVILLE, 2004; KUMAR et al., 1994). A formação da ascite está associada também a uma elevação no teor de sódio do organismo, devido a falha na excreção urinária desse íon, que resulta secundariamente na retenção de água. Esse mecanismo pode ocorrer principalmente na insuficiência cardíaca congestiva, nefrose, nefrite, glomerulonefrite e cirrose hepática (SMITH et al., 1972; NETO et al., 1999). 2.3 ABDOMINOCENTESE Antes da realização da abdominocentese, aconselha-se avaliar o paciente através de exames radiográficos e ultrassonográficos (ETTINGER e BARRET, 1995). A avaliação radiográfica consiste em um método diagnóstico aceitável para as efusões peritoneais e pleurais, podendo ser utilizada também para quantificar o quadro efusivo como leve, moderado ou severo. A natureza da efusão não pode usualmente ser determinada pela radiografia (STEYN e WITTUM, 1993). A ultrassonografia abdominal é um recurso bastante útil para demonstrar efusões de pequeno volume ou localizadas (KRUTH, 2004). Para que não ocorra cistocentese acidental, deve-se esvaziar a bexiga do paciente antes do procedimento (COWELL e TYLER, 1993). Após a tomada dessas medidas, o paciente deve ser colocado em decúbito lateral, sendo efetuada sua contenção. Em seguida, realiza-se a tricotomia e antissepsia do abdômen ventral. A introdução de agulhas ou cateteres de calibre 18 a 20G deve ser feita dois centímetros caudalmente ou a direita da cicatriz umbilical, inclinada para o interior da cavidade, acoplando-se uma seringa de 10 a 12mL para remoção do fluido (SHELLY, 2003; MARKS, 2002; MEYER et al., 1995; BOOTHE, 1998). O fluido coletado é armazenado em tubo contendo o anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA- 10%), para avaliação citológica, determinação de proteínas totais, e posterior

18 6 contagem total de células nucleadas. Outra parte da amostra é acondicionada em tubo sem anticoagulante, para determinação de testes bioquímicos e encaminhamento para cultura bacteriana (COWELL et al., 1999). A utilização do cateter para o procedimento de paracentese abdominal, demonstrou uma acurácia maior quando comparada ao uso da agulha (KOLATA, 1976). O emprego do cateter de diálise peritoneal também foi o método preferido para a coleta de líquido abdominal, demonstrando um aumento na acurácia diagnóstica de 82,9%, quando comparado à utilização da agulha em relato feito por HUNT (1980). 2.4 AVALIAÇÃO LABORATORIAL DO FLUIDO ASCÍTICO A avaliação do fluido ascítico apresenta normalmente grande valor diagnóstico. Essa análise físico-química e citológica quando realizada adequadamente, pode definir um diagnóstico etiológico ou mais frequentemente, uma classificação geral do distúrbio de base (MEYER et al., 1995). O procedimento rotineiramente utilizado para avaliar as características físico-químicas do fluido, inclui a observação da cor, aspecto, densidade, concentração protéica, glicose e sangue oculto. Em relação à avaliação citológica, deve-se realizar a contagem global e diferencial das células nucleadas, não esquecendo de analisar cautelosamente a morfologia das mesmas (PRASSE e DUNCAN, 1976; PARRY, 1997). Caso a análise citológica do fluido caracterize uma infecção, o mesmo deve ser submetido a cultura microbiológica para bactérias aeróbias e anaeróbias (COWELL et al., 1999). O fluido deve ser avaliado o mais breve possível. Caso haja algum contratempo que comprometa essa avaliação em tempo hábil, é prudente que se faça o armazenamento desse material em geladeira até o momento do exame. Este período não pode ultrapassar 24 horas (LARKIN, 1994) Avaliação físico-química Normalmente, a coloração do fluido ascítico oscila entre incolor e amarelo-palha (FELDMAN, 1984). Alguns componentes do fluido interferem nessa coloração natural, a exemplo dos fluidos que apresentam coloração

19 7 amarelo-escuro em decorrência da presença de bilirrubina. Já as efusões vermelhas a acastanhadas, são compostas por eritrócitos e/ou hemoglobina (ALLEMAN, 2003). O número total e a natureza das células presentes no fluido, estão relacionados diretamente com o aspecto da efusão. Desta forma, efusões com pouca ou elevada celularidade demonstram-se límpidas ou turvas (PARRY, 1997). Um fluido ascítico naturalmente apresenta densidade de 1,016 (FELDMAN, 1984) porém, valores maiores podem ser encontrados em decorrência do aumento na concentração protéica desse fluido (ALLEMAN, 2003). A maioria dos laboratórios de patologia clínica veterinária, utiliza o refratômetro para a determinação rápida da concentração de proteínas no plasma e nos fluidos corporais (GEORGE e O NEILL, 2001; GEORGE, 2001). Essa determinação também pode ser realizada por meio da espectrofotometria, da utilização de tiras testes de urina ou através de um analisador automático. Em relação aos fluidos turvos ou sanguinolentos, recomenda-se a centrifugação prévia para posterior determinação protéica do sobrenadante (TYLER e COWELL, 1989; BRAUN et al., 2001; SHELLY, 2003). A concentração protéica considerada usualmente normal nos fluidos cavitários, encontra-se abaixo de 2,5mg/dL (BAKER e LUMSDEN, 2000). A determinação da glicose e do sangue oculto, também é realizada no fluido através da imersão de tiras testes de urina (GARCIA-NAVARRO, 1996) Contagem de hemácias e células nucleadas O conhecimento do número total de hemácias e células nucleadas se faz necessário para uma classificação adicional do tipo de fluido (SHELLY, 2003). A contagem total de células nucleadas inclui os neutrófilos, macrófagos, células mesoteliais e outras células nucleadas encontradas no fluido. A contagem celular pode ser realizada pelos métodos manuais (hemocitômetro) ou automáticos. Os contadores automatizados podem contar debris celulares, limitando o seu aproveitamento para fluidos relativamente claros (TYLER e

20 8 COWELL, 1989; BAKER e LUMSDEN, 2000; COWELL et al., 1999; BAUER e MORITZ, 2005). A amostra de fluido para essa contagem deve ser armazenada em tubo contendo EDTA. Nesse caso, o EDTA também auxilia prevenindo a coagulação da amostra, quando a mesma apresenta alta concentração protéica (SHELLY, 2003) Exame citológico A contagem diferencial de células nucleadas se faz pela avaliação de uma lâmina confeccionada diretamente ou após centrifugação da amostra (MEYER, 2003; COWELL et al., 1999). Alguns profissionais realizam um diferencial verificando três tipos de células (mononucleadas pequenas e grandes e neutrófilos), contando 100 células, enquanto outros avaliam todos os tipos celulares, também em 100 células (SHELLY, 2003). A citologia em amostras de fluidos pode ser realizada de forma rápida, fácil e barata, sendo esse procedimento mais efetivo, quando avaliadas amostras com celularidade moderada a elevada. Para uma avaliação citológica ideal, o material deve ser fixado e corado adequadamente (TYLER e COWELL, 1989). A análise citológica tem auxiliado bastante no diagnóstico de neoplasias, infecções bacterianas e processos inflamatórios, podendo ser realizada inclusive durante os procedimentos cirúrgicos (ELSE e SIMPSON, 1988; CLINKENBEARD et al., 1995; ROGERS et al., 1996). Os esfregaços devem ser realizados através do sedimento ou diretamente do fluido, dependendo da celularidade apresentada pelo mesmo (TYLER e COWELL, 1989). Um esfregaço direto, provavelmente é suficiente para avaliar amostras com elevada celularidade (> células/µl). Já nas amostras que apresentam celularidade moderada (2.000 a células/µl), deve-se preparar um esfregaço direto e outro do fluido centrifugado. A citocentrifugação é recomendada para amostras que apresentem menos que células/µl (SHELLY, 2003). Quando necessário, o fluido deve ser centrifugado por cinco minutos em velocidade de 1000 a 1500 rotações por minuto (rpm). O sobrenadante nesse caso é desprezado, ficando apenas uma pequena parte do mesmo associado

21 9 ao sedimento. Após homogeneização, uma gota do fluido é colocada em lâmina de vidro limpa, e uma outra lâmina é sobreposta sobre a amostra. Realiza-se a compressão e o deslizamento (squash) entre ambas, sendo o material distribuído de uma área espessa multicelular para um esfregaço de camada única (COWELL et al., 1999; SHELLY, 2003). Após o preparo do squash, o material pode ser fixado ao ar, quando o corante de escolha for do grupo Romanowsky ou o azul de metileno. Caso o material não seja corado imediatamente após a secagem ou se a remessa do material para exame demorar alguns dias, torna-se necessário a fixação do esfregaço em álcool metílico a 95% durante três a cinco minutos. Tal procedimento previne a deterioração das células e maximiza as propriedades tintoriais dos corantes de rotina (MOTA e OLIVEIRA, 1999). Os principais grupos de corantes utilizados na citologia são o novo azul de metileno, o papanicolau e os corantes do grupo Romanowsky. Esse último inclui os corantes de Wright, Giemsa e Leishman, que são caracteristicamente policromáticos, possuindo propriedades tintoriais de coloração azul e vermelha. Na medicina veterinária essas colorações são bastante utilizadas, pelo fato de serem permanentes e de fácil execução (ELSE e SIMPSON, 1988; JÖRUNDSSON et al., 1999). A avaliação dos esfregaços se dá por meio de microscopia óptica. Inicialmente utilizando-se a objetiva de 10x para observação de estruturas maiores, examinando-se logo em seguida a morfologia celular com as objetivas de 40x e 100x (CLINKENBEARD e COWELL, 1994) Características citológicas das efusões cavitárias Diversos tipos celulares podem estar presentes nas efusões, dentre eles, hemácias, células mesoteliais, leucócitos, dentre outros. As hemácias podem ser visualizadas na avaliação citológica das efusões que ocorrem secundariamente a processos hemorrágicos, ou em acidentes de punção no momento da coleta. Essa diferença é feita pela presença ou não de eritrofagocitose e plaquetas na efusão (TYLER e COWELL, 1989).

22 10 As células mesoteliais também compreendem o revestimento seroso da cavidade peritoneal, podendo apresentar-se isoladas ou agregadas. Esta célula pode ser oval ou redonda, possuindo diâmetro que varia de 12 a 30 micrômetros (µm). Seu citoplasma é basofílico, sem vacúolos, não apresentando material fagocitado. O núcleo central tem uma membrana nuclear proeminente e uma cromatina roxo-escura, possuindo também um ou dois nucléolos azuis. Quando apresentam-se reativas, essas células exibem um bordo citoplasmático com fímbrias róseas a vermelhas (SHELLY, 2003; MEYER et al., 1995). As células mesoteliais reativas não podem ser confundidas com células neoplásicas. Quando neoplásicas, as células apresentam citoplasma extremamente basofílico, podendo conter material fagocitado (COWELL et al., 1999). A fagocitose é uma importante função dos macrófagos. Estas células derivam-se dos monócitos do sangue, possuindo um citoplasma granular de coloração azul-pálido, que muitas vezes apresenta-se vacuolizado, e em algumas circunstâncias contêm células, debris celulares, bactérias ou pigmentos fagocitados. Os macrófagos apresentam-se em menor número quando encontrados em efusões exsudativas de caráter crônico, podendo apresentar-se também em transudatos e hemorragia crônica (PRASE e DUNCAN, 1976; DJALDETTI et al., 1997). Os linfócitos apresentam-se em pequeno número nas efusões, podendo ser o tipo celular predominante nas efusões quilosas e provenientes de linfoma. Quando presentes nas efusões quilosas, usualmente consistem em linfócitos pequenos e maduros. Por sua vez, a presença de linfoblastos grandes e imaturos é característica primária dessas células em efusões linfomatóides. Os linfócitos encontrados em efusões quilosas são numericamente maiores que os neutrófilos, apresentando uma pequena quantidade de citoplasma azulado, núcleo oval a riniforme e um padrão de cromatina nuclear condensada, não evidenciando-se nucléolo. Os linfoblastos presentes nas efusões linfomatóides, usualmente são maiores que os neutrófilos, possuindo uma quantidade pequena a moderada de citoplasma azulado, núcleo de forma irregular, padrão de cromatina fina ou reticular, e presença de um ou mais nucléolos evidentes (TYLER e COWELL, 1989).

23 11 Os neutrófilos encontram-se em quantidades variadas na maioria das efusões, predominando nas que possuem caráter inflamatório. Citologicamente eles classificam-se em neutrófilos degenerados e não degenerados. Os neutrófilos degenerados sofrem alterações na permeabilidade da membrana celular, ocasionadas por toxinas bacterianas, que levam a vacuolização citoplasmática e tumefação nuclear, indicadas pela perda do padrão da cromatina. Em contrapartida, os neutrófilos não degenerados apresentam padrão de cromatina nuclear basofílica, e sua presença sugere que o fluido seja asséptico (COWELL et al., 1999; THRALL et al., 2007). Eosinófilos são células reconhecidas facilmente pela característica particular de seus grânulos laranja. Uma quantidade moderada a elevada no número de eosinófilos pode ser vista em efusões associadas ao mastocitoma, dirofilariose, síndrome eosinofílica e granuloma eosinofílico pulmonar (DE SOUZA et al., 2001; TYLER e COWELL, 1989). Os mastócitos podem ser prontamente identificados por seus grânulos de coloração vermelho-púrpura. Os mastocitomas dentro das cavidades corporais podem estar associados a quadros efusivos, esfoliando por sua vez uma grande quantidade destas células. Entretanto, estas células são observadas em pequena quantidade nas efusões de cães e gatos com enfermidades inflamatórias diferentes (FOSSUM et al., 1992; COWELL et al., 1999). As células neoplásicas podem ser observadas em efusões que apresentam diversos tipos de neoplasias. Os carcinomas, adenocarcinomas, linfomas, mastocitomas, hemangiossarcomas e mesoteliomas, podem esfoliar células neoplásicas para o interior da cavidade peritoneal. A correta identificação destas células depende da habilidade do examinador no reconhecimento do tipo e dos critérios de malignidade (COWELL et al., 1999). 2.5 CLASSIFICAÇÃO DAS EFUSÕES Transudato Um líquido para ser classificado como transudato, deve possuir uma concentração protéica menor que 2,5g/dL e uma contagem total de células

24 12 nucleadas inferior a 1000/µL (MEYER et al., 1995). A citologia também tem a sua importância nesse critério de classificação, encontrando-se uma população celular pequena e constituída por uma reduzida quantidade de eritrócitos, neutrófilos, macrófagos, linfócitos e possivelmente células mesoteliais. Este líquido apresenta-se límpido a ligeiramente turvo (LARKIN, 1994). Essa efusão transudativa é causada primariamente pela diminuição da pressão coloidosmótica (PRASSE e DUNCAN, 1976). As condições que contribuem para a formação de um transudato são a hipoproteinemia, enfermidade hepática crônica, nefropatias, enteropatias, e má nutrição associada ao endoparasitismo (KING e GELENS, 1992; CARUSO et al., 2003) Transudato Modificado A caracterização do transudato modificado se dá por uma concentração protéica compreendida entre 2,5 e 7,5g/dL, e pela presença de 1000 a 7000 células/µl (COWELL et al., 1993). Na avaliação citológica observamos um grande número de eritrócitos, neutrófilos, linfócitos, macrófagos, células mesoteliais, e eventuais eosinófilos ou mastócitos. As células mesoteliais podem apresentar-se reativas, como resultado da irritação do revestimento seroso. Este líquido pode apresentar-se límpido, ligeiramente turvo ou turvo (LARKIN, 1994). Caso haja dúvida na classificação de um líquido em transudato e transudato modificado, deve-se considerar a concentração de proteínas do mesmo para a diferenciação (COWELL et al., 1999). A maioria dos transudatos modificados ocorre como resultado do aumento da pressão hidrostática, da permeabilidade vascular, ou em decorrência da obstrução na drenagem linfática (TYLER e COWELL, 1989). Esse tipo de líquido pode se desenvolver nos quadros de insuficiência cardíaca congestiva direita, tamponamento cardíaco e nas obstruções das veias cava caudal e hepática. Algumas neoplasias que comprimem os grandes vasos também estão envolvidas nesse processo (KING e GELENS, 1992).

25 Exsudato O exsudato contém elevada concentração protéica e alta contagem de células nucleadas. O teor de proteína total geralmente é superior a 3,0g/dL, enquanto a contagem celular encontra-se acima de 5000 células/µl (MEYER et al., 1995). Na avaliação citológica ocorre o predomínio de neutrófilos, com a presença de macrófagos e linfócitos em menor número. Usualmente, este fluido apresenta-se turvo e/ou sanguinolento (LARKIN, 1994). A presença de fluidos exsudativos usualmente indica uma resposta inflamatória generalizada do peritôneo. Essa inflamação é responsável pelo aumento da permeabilidade vascular com conseqüente vasculite, as quais são acompanhadas pela perda de líquido, proteína e células para o interior da cavidade peritoneal (KING e GELENS, 1992). Os fluidos que apresentam características mistas entre transudato modificado e exsudato, devem ser diferenciados pelo número total de células nucleadas (COWELL et al., 1999). Causas inflamatórias infecciosas e não infecciosas podem ser caracterizadas pelo exame microscópico, separando-se desta forma, os exsudatos em sépticos e não sépticos (MEYER e FRANKS, 1993). No exsudato séptico, a contagem de células nucleadas e de proteínas apresenta-se elevada, podendo o mesmo apresentar variações na coloração desde o branco, amarelo, amarelo-esverdeado ou vermelho. O predomínio de neutrófilos degenerados e bactérias localizadas intra e extracelularmente, são as características principais desse líquido. Outras células como os macrófagos e linfócitos podem ser observadas, porém em menor quantidade (PRASSE e DUNCAN, 1976). As efusões de caráter séptico desenvolvem-se como conseqüência de perfurações traumáticas, gastroenterite, abscessos internos envolvendo próstata e fígado, piometra e infecções fúngicas e parasitárias (BAKER e LUMSDEN, 2000; HOLMBERG et al., 2006; ISRAEL et al., 2002). No exsudato não séptico a contagem celular e a concentração protéica dessa efusão também encontram-se elevadas. Esse tipo de exsudato pode apresentar coloração branca, rosada ou vermelha, apresentando-se muitas vezes opaca. A presença de neutrófilos não degenerados ou a ausência de bactérias, caracterizam melhor esse exsudato. Uma quantidade variável de

26 14 macrófagos, linfócitos e eritrócitos estão usualmente presentes (PRASSE e DUNCAN, 1976). A migração parasitária, esteatite, presença de corpos estranhos na cavidade, processos hemorrágicos, ruptura da vesícula biliar e da bexiga, presença de neoplasias, como também a torção de vários órgãos, contribuem para a formação do exsudato não séptico (BAKER e LUMSDEN, 2000; MEYER e FRANKS, 1993; GANNON e MOSES, 2002; ARGYRES et al., 1998; KELCH e RABAUT, 1978; LARKIN, 1994). 2.6 CLASSIFICAÇÕES ESPECÍFICAS DAS EFUSÕES Efusão hemorrágica A efusão hemorrágica pode resultar de um trauma hepático direto, torção esplênica, alterações na coagulação, ou por compressão dos vasos sanguíneos através de neoplasia (LARKIN, 1994; MONGIL et al., 1995). A citologia resultante de uma efusão hemorrágica patológica, demonstra a presença de hemácias e leucócitos com morfologia e proporções semelhantes às encontradas no sangue periférico. A presença de plaquetas pode ser observada quando, no momento da coleta, ocorre acidente de punção (PRASSE e DUNCAN, 1976) Efusão quilosa Efusão quilosa é uma condição rara, que resulta no extravasamento do quilo para o interior da cavidade peritoneal ou pleural, sendo esta condição uma manifestação clínica de várias enfermidades. A ruptura de um vaso linfático mesentérico e a obstrução linfática, são fatores que podem levar a formação dessa efusão (FOSSUM et al., 1992). A coloração pode variar entre branco leitoso a amarelo ou rosa, dependendo da dieta ingerida e do número de eritrócitos presentes no fluido (COWELL et al., 1999). A análise citológica demonstra desde o predomínio de pequenos linfócitos nos estágios iniciais, até uma população de células mista com vários neutrófilos e macrófagos vacuolizados, quando o fluido se mantém por algum tempo na cavidade (SHELLY, 2003). A comparação entre as concentrações de triglicerídeos e

27 15 colesterol no fluido e no soro, confirmam esse tipo de efusão. Fluidos quilosos apresentam concentrações elevadas de triglicerídeos e baixas de colesterol em relação às do soro (TYLER e COWELL, 1989) Efusão biliar A ruptura do sistema biliar resulta em efusão biliar, podendo ocorrer espontaneamente, ou em decorrência de complicações associadas à enfermidades inflamatórias, alterações do trato biliar ou trauma (ARGYRES et al., 1998; KELCH e RABAUT, 1978; PARCKMAN e FLANDERS, 1990; WATKINS et al., 1983). O extravasamento de bile para o interior da cavidade abdominal pode causar peritonite asséptica, requerendo intervenção cirúrgica imediata (THOMPSON, 1981; BELENGER, 1973). Esse tipo de efusão pode apresentar coloração tipicamente amarelada, alaranjada ou esverdeada (TYLER e COWELL, 1989). A análise citológica revela pigmento biliar localizado extra ou intracelularmente, demonstrando variação na coloração de amarelo a azulesverdeado. A celularidade consiste principalmente de neutrófilos discretamente degenerados e macrófagos (MATTHIESEN e LAMMERDING, 1984). Quando suspeita-se de peritonite biliar, deve-se dosar a concentração de bilirrubina no fluido abdominal e no soro do paciente. Caso a concentração do fluido apresente-se bastante elevada em relação à do soro, confirma-se laboratorialmente esse quadro efusivo (COWELL et al., 1999) Uroperitônio O uroperitônio ou uroabdômen refere-se ao acúmulo de urina livre na cavidade abdominal, causado pelo extravasamento desse fluido através dos rins, ureteres, bexiga, e/ou uretra (GANNON e MOSES, 2002). De acordo com LARKIN (1994), esse fluido pode apresentar aspecto turvo e coloração avermelhada, como também pode assemelhar-se às características da urina. Os neutrófilos expostos à essa substância irritante podem evidenciar cariólise com bordos nucleares irregulares. Cristais urinários são encontrados em alguns casos na avaliação citológica, auxiliando no diagnóstico de uroperitônio (SHELLY, 2003). A mensuração de uréia e creatinina no fluido abdominal e

28 16 sangue periférico, deve ser realizada quando se suspeita desse tipo de efusão. O resultado esperado para a confirmação laboratorial é que as concentrações dessas substâncias estejam elevadas no fluido abdominal quando comparadas às do sangue periférico (COWELL et al., 1999) Efusão eosinofílica Uma efusão é definida como eosinofílica, quando um número 10% do número total de células nucleadas são eosinófilos. Esse tipo de efusão tem sido relatado com baixa freqüência em medicina veterinária, e quando presente, associa-se à dirofilariose, mastocitose sistêmica, granuloma eosinofílico disseminado e neoplasias. Fatores imunológicos devem ser levados em consideração nessa etiologia, devido ao fato de uma proporção relativamente alta de linfócitos serem encontrados algumas vezes no fluido abdominal (FOSSUM et al., 1993). Um estudo realizado por ALLISON et al. (2006), encontrou 88% de eosinófilos no fluido peritoneal de um cão com três meses de idade. Os achados da microscopia eletrônica foram consistentes com o diagnóstico de sarcocistose Efusão parasitária De acordo com pesquisa realizada por Caruso et al. (2003), a cestodíase abdominal causada pelo Mesocestoides sp foi relatada com mais freqüência como causa das efusões parasitárias. O fluido abdominal de quatro cães portadores de ascite apresentou coloração bege a rosa, aspecto ligeiramnte turvo e levemente viscoso. A contagem diferencial de células nucleadas consistiu em 84% de neutrófilos não degenerados, 4% de pequenos linfócitos, 8% de macrófagos e 4% de eosinófilos. O diagnóstico citológico foi compatível com infecção pelo Mesocestoides sp. Crosbie et al. (1998), avaliaram 11 cães com ascite. Os fluidos coletados demonstraram cestódeos móveis, e em nove desses cães os mesacestóides eram acefálicos. A técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada, para confirmação do diagnóstico de ascite por Mesocestoides sp.

29 Efusão neoplásica O termo efusão neoplásica, apenas pode ser utilizado para descrever quadros efusivos que contenham população de células neoplásicas identificadas no fluido (ALLEMAN, 2003). O reconhecimento das células neoplásicas fica mais dificultado, quando uma inflamação se faz presente. Isto se deve ao fato da displasia celular ser significativamente induzida por um processo inflamatório (COWELL et al., 1999). As efusões neoplásicas diagnosticadas com maior freqüência são os linfomas (CARTER et al., 1986; MADEWELL et al., 1988), mastocitomas (DE SOUZA et al., 2001), hemangiossarcomas (BROWN et al., 1985), e os mesoteliomas (DI PINTO et al., 1995; HARBISON e GODLESKI, 1983; SMITH e HILL, 1989; CRAIG et al., 1985; GENINET et al., 2003). 2.7 UTILIDADE DIAGNÓSTICA DA LACTATO DESIDROGENASE (LDH) NO FLUIDO ABDOMINAL. A lactato desidrogenase (LDH) é uma enzima tetramérica que apresenta cinco isoenzimas, que catalizam a conversão do lactato a piruvato em todos os tecidos. Essas isoenzimas são encontradas em concentrações variadas nesses tecidos. A atividade sérica de LDH não é bastante específica, entretanto, necrose muscular, hepática e hemólise, são as maiores causas da sua elevação (TURK e CASTEEL, 1997). Uma pesquisa realizada por Spak (1960), teve o objetivo de dosar as concentrações de LDH no soro e no fluido de 61 pacientes humanos portadores de efusão abdominal de causas diversas. Os pacientes portadores de neoplasias apresentaram concentrações elevadas de LDH no fluido abdominal e diminuídas no soro. Já os pacientes pertencentes ao grupo não neoplásico, apresentaram concentrações diminuídas desta enzima no fluido abdominal e elevadas no soro. A atividade sérica de LDH nesse estudo demonstrou um coeficiente de variação amplo, não podendo ser considerada como marcador para diferenciação das diversas enfermidades envolvidas no estudo. Porém, ao ser mensurada no fluido abdominal, demonstrou ser um

30 18 bom marcador bioquímico, separando os grupos neoplásicos dos não neoplásicos. Um avanço bastante importante para a diferenciação entre transudatos e exsudatos em seres humanos portadores de efusão pleural foi dado por Light et al. (1972). Esta pesquisa preconizou a coleta do fluido pleural e sangue de 150 pacientes, submetendo as respectivas amostras a análise de suas concentrações protéica e de LDH, para posterior relação entre os dados. As amostras que possuíam uma relação fluido/soro de proteína > 0,5, uma concentração de LDH no fluido > 200U.I, e uma relação fluido/soro de LDH > 0,6, foram classificadas como exsudato. Desta forma, o inverso ocorreu levando a classificação das outras amostras como transudatos. Baseando-se no estudo proposto por Light et al. (1972), alguns autores (BOYER et al., 1978) desenvolveram trabalho semelhante, utilizando fluido abdominal de seres humanos. As concentrações de LDH encontradas no fluido abdominal de pacientes portadores de doença hepática, não excederam o limite de 400 unidades sigma (US) estabelecido como critério do estudo. Quando avaliados os fluidos de origem neoplásica, pancreática e relacionados à tuberculose, os valores de LDH encontrados foram superiores a 500 US em sua maioria. Mesmo com esses dados, não se pôde estabelecer um diagnóstico diferencial entre ascite de cunho neoplásico, quando comparada à ascite de origem hepática, tendo em vista que alguns fluidos neoplásicos não excederam o limite de 400 US. Num estudo realizado por Attanasio et al. (1987), observou-se que a relação de LDH no fluido e no soro de 98 pacientes humanos não foi significativa, quando utilizada como critério de diferenciação das diversas categorias de fluidos abdominais. Olmos et al. (1990), avaliaram o fluido ascítico de 45 pacientes com hepatopatias crônicas, neoplasias e peritonite espontânea. As concentrações de LDH encontradas no fluido e a relação fluido/soro dessa enzima não foram significativas para diferenciar os fluidos classificados como neoplásicos, dos relacionados à hepatopatias crônicas. As atividades elevadas da enzima LDH no fluido abdominal relacionadas a neoplasias extra-hepáticas em humanos, demonstraram boa sensibilidade e

31 19 especificidade, possibilitando a diferenciação de fluidos atribuídos à cirrose e neoplasias hepáticas (SALERNO et al., 1990). Os valores de LDH encontrados no soro e no fluido peritoneal de mulheres com câncer de ovário, foram altamente significativos em relação aos encontrados em mulheres com tumor ovariano benigno ou outras neoplasias ginecológicas. Dessa forma, Schneider et al. (1997), concluíram que o LDH demonstrou ser um importante marcador bioquímico no diagnóstico do câncer ovariano. Em trabalho semelhante, as concentrações de LDH no fluido e sua relação fluido/soro demonstraram diferenças significativas entre pacientes com neoplasias ovarianas e pacientes com tumores ovarianos benignos (HALPERIN, 1999). Avaliando-se 104 casos de ascite no Estado do Qatar (Oeste da Ásia), concluiu-se que as concentrações de LDH no fluido abdominal de pacientes humanos com câncer, foram maiores do que as encontradas em pacientes com ascite relacionada à tuberculose (KHAN, 2007). A atividade da LDH avaliada no fluido abdominal e pleural de 61 pacientes humanos, demonstrou ser um bom marcador bioquímico para separação entre transudatos e exsudatos (PARAMOTHAYAN e BARRON, 2002). O primeiro e único estudo utilizando a determinação da LDH como marcador bioquímico na tentativa de diferenciar transudatos de exsudatos no fluido ascítico de cães, foi realizado na Alemanha por Hirchberger e Sauer (1991). Este estudo demonstrou valor limitado para tal separação. Porém, conseguiu provar que a LDH no fluido de cães é um importante parâmetro para diferenciar ascite de origem cardiovascular, infecciosa e neoplásica. 2.8 UTILIDADE DIAGNÓSTICA DA FOSFATASE ALCALINA (FA) NO FLUIDO ABDOMINAL. A fosfatase alcalina é uma enzima de indução sintetizada no fígado, osteoblastos, epitélios intestinal e renal e na placenta. Porém, os hepatócitos respondem pela maior parte da atividade sérica normal dessa enzima. A

32 20 elevação na sua produção e atividade sérica, pode ser notada em casos de maior atividade osteoblástica, colestase, indução por fármacos e várias doenças crônicas (THRALL et al., 2007). Ao realizar paracentese abdominal após infusão de solução salina na cavidade peritoneal de cães, Hunt (1980) determinou as atividades da amilase, bilirrubina e creatinina no fluido aspirado, detectando aumento dessa última substância. Esse autor sugere que o aumento nas concentrações de fosfatase alcalina, alanina aminotransferase, amilase e outras enzimas do fluido abdominal, deveria ser interpretado em relação aos valores das enzimas séricas. Experimento realizado por Bjorling et al. (1983), preconizou a lavagem peritoneal no pré e pós-operatório de cães submetidos a procedimentos cirúrgicos. As concentrações da fosfatase alcalina dos fluidos de lavagem peritoneal coletados nesses dois momentos, demonstraram variações. As atividades enzimáticas encontradas nos fluidos de lavagem peritoneal do préoperatório desses cães foram extremamente baixas. Em contraste, as concentrações enzimáticas avaliadas no fluido peritoneal do pós-operatório demonstraram aumento significativo, sendo esta elevação atribuída parcialmente a anestesia utilizada durante a cirurgia. A participação da inflamação não ficou elucidada por esses autores, como causa de um possível aumento na atividade da fosfatase alcalina. Numa pesquisa envolvendo 60 cavalos, dentre os quais dez eram do grupo controle e 50 portadores da síndrome cólica, concentrações de fosfatase alcalina foram aferidas no soro e fluido peritoneal (FROSCHER e NAGODE, 1981). As concentrações séricas de fosfatase alcalina não apresentaram alterações significativas nos dois grupos. Quando aferidas no fluido peritoneal, tais concentrações apresentaram-se elevadas apenas em 10 animais portadores de cólica, sendo associadas a origem granulocítica. Conclui-se nesse estudo, que a fosfatase alcalina encontrada no fluido peritoneal não pode ser considerada um bom indicador de cólica equina, devido a suas taxas elevadas encontrarem-se relacionadas apenas aos casos de origem granulocítica. Para diferenciar transudatos de exsudatos, Metintas et al. (1997), avaliaram as atividades da fosfatase alcalina no fluido pleural de seres

33 21 humanos, como também a relação fluido/soro de tal enzima. A atividade da enzima possibilitou a diferenciação proposta nos meios pesquisados. Quando analisadas as concentrações de fosfatase alcalina no fluido peritoneal de dez caprinos submetidos ao procedimento de enterotomia, constatou-se que houve aumento significativo de tal enzima após a cirurgia (NAZIFI et al., 1999). As concentrações de fosfatase alcalina total e de origem intestinal, foram mensuradas no soro e no fluido peritoneal de 126 cavalos com cólica. As atividades séricas de tais enzimas não foram significativas na classificação da severidade e do tipo da injúria intestinal. Quando aferidas no fluido peritoneal desses mesmos animais, as concentrações de fosfatase alcalina total e de origem intestinal apresentaram-se elevadas, associando-se à injúrias intestinais graves, como também ao aumento de intervenções cirúrgicas e a prognósticos desfavoráveis. Por fim, a fosfatase alcalina total no fluido peritoneal pode auxiliar na identificação das lesões intestinais isquêmicas ou inflamatórias em cavalos com cólica aguda (SAULEZ et al., 2004). Análises bioquímicas realizadas no fluido abdominal de 15 cães portadores de efusões abdominais, tentaram diferenciar os grupos neoplásicos dos não neoplásicos. A fosfatase alcalina não demonstrou ser um bom marcador bioquímico para a separação entre os dois grupos nesse estudo (NESTOR et al., 2004).

34 22 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 ANIMAIS E LOCAL DO ESTUDO O presente estudo utilizou 16 cães (Canis familiaris Linnaeus 1758) adultos, machos ou fêmeas, de variadas raças, com idade compreendida entre três e 14 anos, e variações no peso de 2 a 36kg. Esses animais foram provenientes dos atendimentos ambulatoriais realizados pelo Hospital Universitário de Medicina Veterinária Firmino Mársico Filho da Universidade Federal Fluminense (HUMVFMF UFF), e demais clínicas veterinárias (CTI, INPA e VETMAR) situadas nos municípios de Niterói e do Rio de Janeiro (RJ). O processamento de todo material incluído nessa pesquisa, foi realizado no Laboratório Clínico Veterinário do HUMVFMF UFF. 3.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO Para o envolvimento nessa pesquisa, os cães portadores de efusão abdominal (ascite) foram atendidos pelo serviço de clínica médica de pequenos animais, não encontrando-se sob tratamento clínico. O exame físico foi realizado aferindo-se as freqüências cardíaca e respiratória, pulsações por minuto, temperatura corporal, tempo de preenchimento capilar, percussão abdominal e estado geral, segundo Darke (2000). As avaliações ultrassonográficas e/ou radiográficas do abdômen, também foram procedimentos adotados para confirmação do quadro efusivo (STEYN e WITTUM, 1993; KRUTH, 2004).

35 23 Por fim, um termo de consentimento livre e esclarecido foi utilizado, sendo assinado pelos proprietários abordados e pelos médicos veterinários responsáveis pelo atendimento clínico do paciente (ANEXO 1). 3.3 COLETA DE SANGUE Cada cão foi contido manualmente, procedendo-se a coleta de 3mL da amostra sangüínea a partir da veia jugular em momento único, utilizando-se seringa descartável de 5mL e agulha hipodérmica 21G. Essa amostra foi transferida para um tubo de ensaio sem anticoagulante, para a realização das provas bioquímicas. A amostra foi mantida em temperatura ambiente durante 30 minutos, para que ocorresse a coagulação da mesma (THRALL et al., 2007). Em seguida, foi encaminhada ao Laboratório Clínico Veterinário do HUMVFMF UFF, para posterior centrifugação e obtenção do soro. A centrifugação da amostra foi realizada na velocidade de 1500g, durante 10 minutos, em centrífuga TDL 80 2B da marca Centribio, para separação do soro sanguíneo. Com o auxílio de um pipetador automático de volume fixo, acondicionou-se uma alíquota do soro em frasco de polietileno tipo Eppendorff, armazenando-a em um freezer a 20ºC, até o momento do processamento (SERAKIDES, 1996). 3.4 COLETA DE FLUIDO ABDOMINAL Para esse procedimento, os cães foram colocados em decúbito lateral e contidos adequadamente. Foi realizada tricotomia do abdômen ventral, e posterior antissepsia com povidine para o preparo cirúrgico da pele (SHELLY, 2003; BOOTHE, 1998). O sítio de coleta foi delimitado três centímetros caudalmente e a direita da cicatriz umbilical, sendo colocado um cateter intravenoso (20G) inicialmente no tecido subcutâneo (Figura 1), e introduzido em movimento angular para o interior da cavidade abdominal. O cateter foi acoplado logo em seguida a uma seringa descartável de 20mL, onde iniciou-se a remoção do fluido (Figura 2) (BJORLING et al., 1983; MEYER et al., 1995; MARKS, 2002). A amostra coletada (13mL) foi acondicionada em dois tubos de

36 24 ensaio, um contendo o anticoagulante (EDTA-10%) e outro sem anticoagulante, destinado a realização das provas bioquímicas e citologia (COWELL et al., 1999). Este material foi encaminhado para processamento no Laboratório Clínico Veterinário do HUMVFMF UFF. A amostra de fluido abdominal contida no tubo sem anticoagulante, foi centrifugada na velocidade de 400g, durante 5 minutos em centrífuga TDL 80 2B da marca Centribio, para separação do sobrenadante. Através de uma pipeta automática, uma alíquota do sobrenadante foi acondicionada e armazenada, de maneira similar à utilizada com o soro sanguíneo, até o momento do processamento (ALLEMAN, 2003). Figura 1: Cão, Macho, 13 anos. Tricotomia e antissepsia do abdômen ventral (A, B) com povidine. Introdução de cateter 20G no tecido subcutâneo (C, D). Niterói RJ, UFF, 2008.

37 25 Figura 2: Cão, Macho, 13 anos. Cateter 20G inclinado para subseqüente introdução na cavidade abdominal (E). Paracentese abdominal (F, G). Fluido removido - 225mL (H). Niterói RJ, UFF, GRUPOS EXPERIMENTAIS Grupo I (GI): Foram incluídos nesse grupo, quatro cães com efusão abdominal que apresentaram características de transudato. Nesse caso, a concentração protéica do líquido foi inferior a 2,5g/dL, e a contagem de células nucleadas por microlitro (µl) menor que Citologicamente, observamos nesse grupo uma população celular mista contendo eritrócitos, neutrófilos, macrófagos, linfócitos e células mesoteliais (SHELLY, 2003; KOLATA, 1976) Grupo II (GII): Nesse grupo foram incluídos oito cães com efusão abdominal, que apresentaram características de transudato modificado. O líquido desse grupo apresentou concentração protéica 2,5g/dL, e a contagem total de células nucleadas variou entre 1000 e 5000 células por microlitro (µl). Ao exame microscópico, observamos uma população celular de eritrócitos,

38 26 neutrófilos, linfócitos, macrófagos, células mesoteliais, e em algumas situações, eosinófilos e mastócitos (SHELLY, 2003; LARKIN, 1994) Grupo III (GIII): Pertenceram a esse grupo, quatro cães com efusão abdominal que apresentaram características de exsudato. O líquido desse grupo foi caracterizado por concentração protéica > 3,0g/dL, e contagem de células nucleadas superior a 5000 células por microlitro (µl), sendo composta predominantemente por neutrófilos degenerados e não-degenerados, e um menor número de macrófagos e linfócitos (SHELLY, 2003). 3.6 ANÁLISE LABORATORIAL Avaliação físico química do fluido abdominal O volume foi estimado na seringa de acordo com a coleta, sendo acondicionados três ml do líquido no tubo com EDTA, e 10mL no tubo sem anticoagulante (PARRY, 1997). A cor foi diferenciada pela observação macroscópica da amostra, a exemplo do amarelo-claro, amarelo-escuro, vermelho e marrom, dependendo dos componentes que estavam presentes nas amostras avaliadas (TYLER e COWELL, 1989). O aspecto da amostra foi visualmente classificado como límpido, ligeiramente turvo e turvo (TYLER e COWELL, 1989; PARRY, 1997). A densidade foi mensurada através da refratometria, após a colocação de uma gota do sobrenadante do líquido sem EDTA no prisma do refratômetro RTP-20ATC, com posterior leitura da escala correspondente (GEORGE, 2001). Mencionava-se a presença ou não de coágulo, pelo fato da presença do mesmo interferir na análise do fluido, principalmente na contagem total e diferencial de células nucleadas (ALLEMAN, 2003). A concentração de proteínas foi inicialmente mensurada na tira de urina reagente Combur 10 Test até 2+ (100mg/dL). A partir de 3+ (500mg/dL), quantificou-se a concentração protéica do fluido no tubo sem EDTA, através da refratometria (BRAUN et al., 2001; GEORGE & O`NEILL, 2001). As amostras que apresentaram turvação ou presença de sangue, foram centrifugadas na

39 27 centrífuga TDL 80-2B, da marca Centribio por 5 minutos a 400g, e a partir do sobrenadante realizou-se a determinação protéica, evitando assim interferências na avaliação (COWELL et al., 1999). Para determinação do ph, da concentração de glicose e sangue oculto, realizou-se a imersão da tira de urina reagente Combur 10 Test na amostra do líquido sem anticoagulante, aguardando-se 60 segundos para efetuar a leitura, comparando sempre as cores de reação das áreas de teste com as do rótulo. Essa metodologia é semelhante à empregada no exame químico da urina (GARCIA-NAVARRO, 1996) Contagem global de células nucleadas do fluido abdominal Foi obtida de forma semelhante à contagem de leucócitos no sangue. O líquido coletado foi acondicionado em tubo com EDTA para evitar a presença de coágulo, que quando ocorre reduz a contagem celular. Utilizou-se uma pipeta automática previamente conectada a uma ponteira, para adicionar 20µL do líquido em um tubo de ensaio preparado com 0,4mL de ácido acético. Nesse caso, as membranas citoplasmáticas foram lisadas mantendo apenas partículas nucleadas. Após o processo de homogeneização e incubação apropriadas, uma alíquota da amostra foi transferida para um hemocitômetro. O hemocitômetro foi observado em microscópio binocular, modelo ITMBB 200, utilizando-se para contagem a objetiva de 10x. Dessa forma, a contagem de células nucleadas da amostra foi feita nos quatro conjuntos de 16 quadrados encontrados nos quatro extremos do hemocitômetro, sendo esse valor multiplicado por 50 (GARCIA-NAVARRO e PACHALY, 1994; THRALL et al., 2007) Contagem de hemácias do fluido abdominal Os líquidos foram avaliados quanto ao aspecto da amostra para determinar a necessidade de diluição em solução fisiológica. Dessa forma, uma alíquota da amostra foi transferida para o hemocitômetro, que foi observado em microscópio binocular, modelo ITMBB 200, utilizando-se

40 28 objetiva de 40x. A contagem das hemácias foi realizada nos cinco grupos dos 25 quadrados menores situados no centro do hemocitômetro (GARCIA- NAVARRO e PACHALY, 1994). Quando diluídos, os resultados obtidos foram multiplicados pelo fator de diluição (SHELLY, 2003) Citologia do fluido abdominal A amostra do tubo sem EDTA foi centrifugada no aparelho TDL 80-2B, da marca Centribio por 5 minutos, a uma velocidade de 400g. Em seguida, o sobrenadante foi desprezado, ficando apenas uma pequena quantidade do mesmo em contato com o sedimento. Ocorreu o processo de homogeneização e uma gota do material foi colocada em uma lâmina para microscopia limpa, a frente da superfície fosca. Outra lâmina foi sobreposta à primeira, sendo realizada a compressão e o deslizamento entre elas (squash), espalhando o material sobre a primeira lâmina (TYLER et al., 1999). O material contido na lâmina foi seco ao ar e fixado em álcool metílico P.A (95%), durante cinco minutos (MOTA e OLIVEIRA, 1999), sendo corado em seguida pelo método de Romanowsky (Giemsa) por 30 minutos (ELSE e SIMPSON, 1988; JÖRUNDSSON et al.,1999). Por fim, a citologia foi realizada em microscópio binocular, modelo ITMBB 200, em aumento de 40x a 100x (CLINKENBEARD e COWELL, 1994) Determinação da Atividade Enzimática da FA e LDH no Soro e Fluido Abdominal Em um período não superior a 48 horas (FARIA, 2000), uma alíquota de soro e outra do sobrenadante do fluido abdominal foram retiradas do freezer, esperando o descongelamento a temperatura ambiente, para determinação da atividade da fosfatase alcalina (FA) e da lactato desidrogenase (LDH), utilizando-se os kits da marca Bioclin. O método colorimétrico foi utilizado para determinar a atividade da FA, sendo o método cinético escolhido para avaliar a atividade da LDH nas respectivas amostras. Essas determinações foram feitas em analisador bioquímico semi-automático, modelo BIO 200-F

41 29 (Figura 3). A tabela 1 descreve os valores de referência da fosfatase alcalina (FA) e da lactato desidrogenase (LDH) no soro de cães saudáveis, utilizados para comparação dos resultados desse trabalho. Tabela 1: Valores de referência da Fosfatase Alcalina (FA) e Lactato Desidrogenase (LDH) no soro de cães saudáveis. Niterói RJ, UFF, VR REFERÊNCIA Fosfatase Alcalina U/L Kaneko et al., 1997 Lactato Desidrogenase U/L Kaneko et al., 1997 Figura 3: Analisador bioquímico semi-automático, modelo BIO F. Niterói RJ, UFF, 2008.

42 ANÁLISE ESTATÍSTICA Os dados coletados foram analisados pelo programa SPSS (Statistical Package for the Social Science), versão Todas as discussões foram realizadas ao nível de 5% (p-valor<0,05%) de significância (ARANGO, 2005). Para comparar as atividades da FA e LDH no soro e no fluido, como também na relação fluido/soro dos três grupos (transudato, transudato modificado e exsudato), optou-se pelo teste de Kruskall-Wallis. Os testes de Mann-Whitney e Post-Hoc Student Newman-Keuls, foram utilizados para comparar a média de dois grupos independentes (transudato / transudato modificado, transudato / exsudato e transudato modificado / exsudato), para verificar a existência de diferenças nas atividades de LDH e FA no soro e no fluido, como também na relação fluido/soro dessas enzimas. Para avaliar a dependência de duas variáveis categóricas (x= classificação dos fluidos e y= condição neoplásica ou não neoplásica), foi utilizado o teste Qui-Quadrado. O teste de Mann-Whitney foi utilizado também para verificar diferenças significativas nas atividades da FA e LDH, na celularidade e na relação fluido/soro dessas enzimas, que possibilitassem a diferenciação dos grupos neoplásicos e não neoplásicos.

43 31 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO A literatura veterinária encontra-se com um número bastante reduzido de trabalhos relacionados aos marcadores bioquímicos, principalmente quando se trata da atividade das enzimas fosfatase alcalina (FA) e lactato desidrogenase (LDH) no soro, no fluido abdominal e na relação fluido/soro para auxiliar como critério de diferenciação dos fluidos classificados como transudato, transudato modificado e exsudato. Desta forma, a literatura humana referente a esse assunto serve como fonte de pesquisa para o desenvolvimento de novos trabalhos na medicina veterinária. Sendo assim, serão apresentados a seguir, os resultados da atividade das enzimas fosfatase alcalina e lactato desidrogenase no soro, no fluido e na relação fluido/soro dos cães envolvidos nessa pesquisa, como também a relação com a celularidade dos grupos neoplásicos e não neoplásicos. Os resultados da avaliação físico-química (volume, cor, aspecto, densidade, coagulação, concentração de proteínas, ph, glicose e sangue oculto), da contagem de hemácias e células nucleadas realizadas no fluido abdominal dos animais dos grupos transudato, transudato modificado e exsudato, encontram-se representados no Anexo 2. A presença de algumas alterações observadas no exame citológico encontram-se na Figura 4.

44 Figura 4: A e B Grande quantidade de neutrófilos exibindo moderado grau de degeneração 100X e 200X; C Células epiteliais displásicas formação acinar (seta branca) 400X; D Células mesoteliais reativas (seta branca) e displásicas (seta preta) em grupos ou isoladas 400X; E e F Linfoblastos anisocitose, basofilia, e microvacuolização citoplasmática, multinucleação (seta preta) e nucléolos evidentes 400X. Niterói RJ, UFF,

45 LACTATO DESIDROGENASE SÉRICA E DO FLUIDO ABDOMINAL Ao analisar os resultados da LDH no soro do grupo transudato, o menor valor foi de 176U/L, obtendo-se atividade máxima de 641U/L. A x da atividade de LDH no soro foi de 398,25U/L 196,41U/L. Constatou-se que nos fluidos classificados como transudato, o valor mínimo encontrado foi de 16U/L e o máximo de 40 U/L. No fluido abdominal a x da atividade dessa enzima foi bem menor, de apenas 30,00U/L 10,07U/L. O coeficiente de variação (C.V.) por sua vez foi igual a 0,49 para os valores obtidos no soro e 0,34 para os do fluido. Nesse caso, pode-se afirmar que a distribuição da concentração de LDH nos meios pesquisados apresenta alta variabilidade (Tabela 2). A relação fluido/soro de LDH também foi avaliada nesse grupo, apresentando valor mínimo de 0,06U/L e máximo de 0,09U/L. A x dessa relação foi de 0,08U/L 0,01U/L, com coeficiente de variação (C.V.) igual a 0,12. No grupo classificado como transudato modificado (Tabela 2), a atividade sérica de LDH variou de 120U/L a 585U/L, apresentando também alta variabilidade. A x foi de 321,12U/L 141,21U/L com C.V.= 0,44. A atividade de LDH no fluido desse grupo apresentou alta variabilidade, com valores compreendidos entre 40U/L e 641U/L. A x encontrada foi de 207,12U/L 212,40U/L, resultando num coeficiente de variação igual a 1,03. Quando avaliada a relação fluido/soro de LDH nesse grupo, o valor mínimo encontrado foi de 0,10U/L e o máximo de 2,16U/L. A x dessa relação foi de 0,68U/L 0,71U/L, com coeficiente de variação (C.V.) igual a 1,04. A alta variabilidade nos valores das amostras coletadas, também foi verificada no grupo dos animais cujos fluidos foram classificados como exsudato (Tabela 2). A atividade sérica da enzima variou de 176U/L a 1667U/L, e no fluido de 112U/L a 1804U/L. O C.V. na distribuição dos valores do soro foi de 0,77 e nos dados coletados no fluido foi de 1,21. As x foram de 949,75U/L 728,69U/L e 649,25U/L 785,75U/L respectivamente. A relação fluido/soro de LDH nesse grupo apresentou valor mínimo de 0,07U/L e máximo de 2,73U/L. A x dessa relação foi de 1,10U/L 1,19U/L, com coeficiente de variação (C.V.) igual a 1,08.

46 34 A variabilidade observada nas concentrações séricas de LDH dos diversos grupos, pode ter ocorrido devido à inespecificidade dessa enzima ou por uma lesão hepática pré-existente nos animais envolvidos na pesquisa (TURK e CASTEEL, 1997). A atividade sérica de LDH também apresentou coeficiente de variação amplo em pesquisa realizada por Spak (1960), onde demonstrou não ser um bom marcador bioquímico na diferenciação de várias enfermidades. Tabela 2: Resultados das análises da Lactato Desidrogenase (LDH) nos grupos transudato, transudato modificado e exsudato. Niterói RJ, UFF, Número Soro Fluido Relação Fluido/Soro Transudato , , , ,09 x 398,25 30,00 0,08 s 196,41 10,07 0,01 C.V. 0,49 0,34 0,12 Transudato Modificado , , , , , , , ,16 x 321,12 207,12 0,68 s 141,21 212,40 0,71 C.V. 0,44 1,03 1,04 Exsudato , , , ,22 x 949,75 649,25 1,10 s 728,69 785,75 1,19 C.V. 0,77 1,21 1,08 A Figura 5 exibe em colunas, as medianas das concentrações de LDH no soro e no fluido. As barras vão do mínimo ao máximo valor obtido nas análises.

47 35 Figura 5: Medianas das atividades da Lactato Desidrogenase (LDH) no soro e fluido dos grupos classificados como transudato, transudato modificado e exsudato. Niterói RJ, UFF, Ao comparar a atividade sérica de LDH nos três grupos, o p-valor obtido pelo teste de Kruskall Wallis foi de 0,451. Daí conclui-se que não há diferença significativa na atividade dessa enzima no soro dos animais dos grupos classificados como transudato, transudato modificado e exsudato, ficando de acordo com os resultados da pesquisa realizada por Spak (1960), que demonstrou que a LDH sérica não pode ser considerada importante marcador bioquímico, devido a ampla distribuição do coeficiente de variação nos resultados obtidos. Nos dados coletados no fluido, o teste de Kruskall Wallis indicou que existe pelo menos um grupo que apresenta diferença significativa (p-valor= 0,008) na atividade da enzima LDH. Através do teste de Mann-Whitney verificou-se que o grupo transudato, apresentou no fluido abdominal atividades de LDH significativamente diferentes em relação aos outros grupos (p-valor= 0,008 com o grupo transudato modificado e p-valor=0,020 com o grupo exsudato). Convêm lembrar, que o grupo transudato apresentou valores de LDH (Tabela 2) bem menores em relação aos encontrados no transudato modificado e exsudato. Entretanto, vale ressaltar que não há diferença significativa entre as concentrações do transudato modificado e exsudato (pvalor= 0,126).

48 36 Alguns trabalhos utilizando o LDH como marcador bioquímico nos fluidos pleural e abdominal de humanos (LIGHT et al., 1972; PARAMOTHAYAN e BARRON, 2002), conseguiram realizar a separação entre transudatos e exsudatos. Em cães, a utilização de LDH para esta classificação demonstrou valor restrito, apenas diferenciando a origem de alguns quadros efusivos (HIRCHBERGER e SAUER, 1991). Embora os fluidos classificados como transudato modificado e exsudato não tenham sido separados como citado anteriormente, o LDH demonstrou ser um bom marcador bioquímico para diferenciar os transudatos dos demais grupos. As relações fluido/soro dos três grupos (transudato, transudato modificado e exsudato) foram comparadas pelo teste de Kruskall Wallis, obtendo p-valor=0,039. Através do teste Post-Hoc Student Newman-Keuls ficou demonstrado que o grupo transudato apresenta relação fluido/soro significativamente diferente em relação aos outros grupos (p-valor= 0,016 com o grupo transudato modificado e p-valor=0,037 com o grupo exsudato). A relação fluido/soro não demonstrou diferença significativa entre o grupo transudato modificado e exsudato (p-valor=1,00). De acordo com os critérios propostos por Light et al. (1972), houve separação entre o grupo transudato e exsudato através da relação fluido/soro de LDH. Na nossa pesquisa, a relação fluido/soro conseguiu separar o grupo transudato do grupo transudato modificado e exsudato FOSFATASE ALCALINA SÉRICA E DO FLUIDO ABDOMINAL. Ao analisar os resultados da fosfatase alcalina no soro dos pacientes do grupo transudato, constatou-se valor mínimo de 21U/L e máximo de 408U/L. A x nesse caso foi de 209,00U/L 162,00U/L, com C.V=0,78. Os resultados da atividade dessa enzima no fluido desse grupo, oscilaram de 1 a 35U/L. A x encontrada foi de 11,00U/L 16,06U/L, com C.V=1,46. A distribuição destes dados demonstrou-se muito heterogênea, tanto no soro quanto no fluido (Tabela 3). A relação fluido/soro de FA avaliada nesse grupo, apresentou valor mínimo de 0,01U/L e máximo de 0,08U/L. A x dessa relação foi de 0,04U/L 0,03U/L, com coeficiente de variação (C.V) igual a 0,75.

49 37 Tabela 3: Resultados das análises da Fosfatase Alcalina (FA) nos grupos transudato, transudato modificado e exsudato. Niterói RJ, UFF, Número Soro Fluido Relação Fluido/Soro Transudato , , , ,01 x 209,00 11,00 0,04 s 162,00 16,06 0,03 C.V. 0,78 1,46 0,75 Transudato Modificado , , , , , , , ,78 x 82,25 34,87 0,45 s 98,13 52,72 0,25 C.V. 1,19 1,51 0,55 Exsudato , , , ,56 x 55,75 29,75 0,42 s 55,84 33,36 0,17 C.V. 1,00 1,12 0,40 Os dados da fosfatase alcalina mensurados no soro do grupo transudato modificado, variaram de 14 a 315U/L, com x de 82,25U/L 98,13U/L e C.V=1,19. A atividade da FA mensurada no fluido desse mesmo grupo, variou de 1 a 163U/L. A x nesse caso foi de 34,87U/L 52,72U/L, com C.V=1,51 (Tabela 3). As distribuições dos resultados da FA no soro e fluido apresentaram-se com maior variabilidade ainda, do que aquela medida no grupo transudato. Quando avaliada a relação fluido/soro da FA nesse grupo, o valor mínimo encontrado foi de 0,01U/L e o máximo de 0,78U/L. A x dessa relação foi de 0,45U/L 0,25U/L, com coeficiente de variação (C.V) igual a 0,55. A fosfatase alcalina encontrada no soro e no fluido dos animais do grupo exsudato (Tabela 3), também apresentou alta dispersão. Os valores

50 38 encontrados no soro variaram de 13U/L a 132U/L. A x nesse caso foi de 55,75U/L 55,84U/L com C.V= 1,00. Em relação aos valores encontrados no fluido, houve variação de 3 a 74U/L, com x igual a 29,75U/L 33,36U/L e C.V=1,12. A relação fluido/soro de FA nesse grupo também foi avaliada, apresentando valor mínimo de 0,23U/L e máximo de 0,59U/L. A x dessa relação foi de 0,42U/L 0,17U/L, com coeficiente de variação (C.V) igual a 0,40. Nos três grupos podemos analisar que as médias da fosfatase alcalina no fluido encontram-se elevadas, quando comparadas com as médias das atividades enzimáticas de FA mensuradas no fluido peritoneal do pósoperatório de cães, no trabalho realizado por Bjorling et al. (1983), que apesar de atribuírem essa elevação parcialmente ao procedimento anestesiológico utilizado durante a cirurgia, não deixaram claro que o processo inflamatório pudesse levar a esse aumento. Trabalhos envolvendo outras espécies (caprinos e eqüinos), também demonstram aumento dessa enzima no fluido quando ocorre alguma injúria orgânica (NAZIFI et al., 1999; SAULEZ et al., 2004). A Figura 6 exibe em colunas, as medianas das concentrações de fosfatase alcalina no soro e no fluido. As barras vão do mínimo ao máximo valor obtido nas análises. Figura 6: Medianas das atividades da FA no soro e fluido dos grupos classificados como transudato, transudato modificado e exsudato. Niterói RJ, UFF, 2008.

51 39 Ao comparar as atividades da fosfatase alcalina nos três grupos pelo teste de Kruskall Wallis, obteve-se p-valor de 0,258 para o teste nas concentrações séricas, e p-valor de 0,443 no teste envolvendo as concentrações no fluido. A análise desses resultados revelou que não há diferença significativa nas atividades da fosfatase alcalina no soro e no fluido abdominal, impossibilitando a separação entre os grupos, discordando desta forma da pesquisa realizada por Metintas et al. (1997). Quando comparadas as relações fluido/soro nos três grupos (transudato, transudato modificado e exsudato), obteve-se p-valor=0,05. Através do teste de Mann-Whitney demonstrou-se que o grupo transudato apresentou relação fluido/soro significativamente diferente quando comparado aos outros grupos (p-valor= 0,041 com o grupo transudato modificado e p- valor=0,021 com o grupo exsudato). Não houve diferença significativa na relação fluido/soro entre o grupo transudato modificado e exsudato (pvalor=1,00). Metintas et al. (1997), também utilizaram a relação fluido/soro de fosfatase alcalina para separação dos transudatos e exsudatos em humanos, conseguindo estabelecer valores no grupo exsudato com diferença significativa em relação ao grupo transudato. Desta forma, foi possível dentro da nossa classificação, separar os transudatos das demais categorias, utilizando a relação fluido/soro da fosfatase alcalina. 4.3 LACTATO DESIDROGENASE E FOSFATASE ALCALINA NOS FLUIDOS NEOPLÁSICOS E NÃO-NEOPLÁSICOS. Dos 16 fluidos avaliados, 5 deles eram neoplásicos. A Tabela 4 traz a distribuição de freqüências destes fluidos de acordo com as classificações entre transudato, transudato modificado e exsudato. O teste Qui-Quadrado revela que esta classificação é independente do estado neoplásico do animal (p-valor= 0,063). Os fluidos considerados neoplásicos, foram diagnosticados citologicamente como carcinoma (n=2), linfoma (n=2) e neoplasia maligna indiferenciada (n=1). Os critérios científicos que permitiram este diagnóstico encontram-se descritos na Figura 4.

52 40 Tabela 4: Distribuição de freqüências dos fluidos neoplásicos e não neoplásicos nos grupos transudato (T), transudato modificado (TM) e exsudato (E). Niterói RJ, UFF, T TM E Total Não neoplásico Neoplásico Total Na Tabela 5, estão apresentados os valores de média e desvios-padrão dos dois grupos. O teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparar esses grupos (neoplásicos e não neoplásicos). Foram verificadas diferenças significativas entre as concentrações de LDH no fluido (p-valor=0,015), entre a relação fluido/soro de LDH (p-valor=0,036) e entre a celularidade (pvalor=0,009) dos grupos estudados. Tabela 5: Valores das médias e desvios-padrão das concentrações de Lactato Desidrogenase (LDH) e Fosfatase Alcalina (FA) no fluido, soro e na relação fluido/soro encontrados nos grupos neoplásicos e não neoplásicos. Niterói RJ, UFF, Grupo Não Neoplásico (n=11) Grupo Neoplásico (n=5) LDH-Soro (U/L) 465,91 430,32 567,2 516,64 LDH-Fluido (U/L) 105,45 115,98 642,8 685,28 FA-Soro (U/L) ,65 72,8 48,54 FA-Fluido (U/L) 26,54 46, ,41 Relação F/S LDH 0,32 0,39 1,35 1,09 Relação F/S FA 0,30 0,24 0,46 0,30 Celularidade 2.832, , ,01 Concordando com estes resultados, vários trabalhos (SPAK, 1960; SALERNO et al., 1990; HIRCHBERGER e SAUER, 1991; SCHNEIDER et al., 1997; HALPERIN, 1999; KHAN, 2007) demonstraram que as concentrações de LDH no fluido e a sua relação fluido/soro quando elevadas nos grupos neoplásicos, diferenciaram-se significativamente dos grupos não neoplásicos. Esses mesmos autores relatam que os tecidos neoplásicos têm atividade glicolítica elevada e, portanto pode-se esperar um aumento concomitante na atividade enzimática de LDH no fluido e na relação fluido/soro de pacientes portadores de enfermidades neoplásicas. Entretanto, esta relação não foi significativa quando avaliada por outros autores (ATTANASIO et al., 1987; OLMOS, et al.,1990). Isto se deve ao fato das neoplasias estudadas não apresentarem potencial agressivo, a ponto de não aumentar o processo de

53 41 glicólise, não apresentando assim, níveis de destruição celular elevados que justifiquem o aumento da atividade enzimática de LDH no fluido e na relação fluido/soro. A separação dos grupos pela celularidade está de acordo com o proposto por Cowell et al. (1999), quando relatam que a esfoliação de células neoplásicas para o interior da cavidade peritoneal, aumenta a contagem celular em relação aos fluidos não neoplásicos. Em contraste, uma pesquisa desenvolvida por Salerno et al. (1990), demonstrou maior celularidade no fluido abdominal de humanos com cirrose não complicada, em relação ao fluido de pacientes portadores de neoplasias hepáticas e extra-hepáticas. Tal fato ocorreu pelo caráter não esfoliativo apresentado pelas neoplasias envolvidas no trabalho. As neoplasias envolvidas na nossa pesquisa (carcinoma, linfoma e neoplasia de origem indiferenciada), apresentaram características esfoliativas já conhecidas, possibilitando o aumento significativo na celularidade do grupo neoplásico, e como conseqüência disso, diferenciaram-se citologicamente do grupo não neoplásico. Sob o ponto de vista estatístico, não houve diferença significativa na concentração da fosfatase alcalina encontrada no soro (p-valor=0,455), nem na sua relação fluido/soro (p-valor=0,282), discordando da pesquisa realizada por Metintas et al. (1997), que demonstrou diferenças significativas na separação de fluidos pleurais neoplásicos, dos relacionados à tuberculose e outros exsudatos. Também não foi encontrada diferença significativa da fosfatase alcalina (p-valor=0,496) entre os fluidos neoplásicos e não neoplásicos, concordando com trabalho realizado por Nestor et al. (2004). 4.4 ASSOCIAÇÃO DA LACTATO DESIDROGENASE E FOSFATASE ALCALINA PARA CLASSIFICAÇÃO DO FLUIDO ABDOMINAL. Embora os resultados tenham revelado diferenças significativas na maioria das mensurações das atividades enzimáticas de LDH nos meios pesquisados, a associação entre esses resultados pode trazer vantagens na classificação das efusões.

54 42 Os resultados inferenciais e os valores máximos de LDH-F no grupo transudato e mínimos nos grupos transudato modificado e exsudato, traz evidências de que se a concentração de LDH no fluido abdominal for abaixo ou igual a 40U/L, então o fluido será um transudato. Quando LDH-F>40U/L ele pode ser transudato modificado ou exsudato. Contudo, pôde-se observar que neste grupo de animais com LDH-F>40U/L e 88U/L, o fluido será um transudato modificado. Através de tabela de freqüência (tabela 6) pôde-se observar também que se LDH-F>88U/L e a fosfatase alcalina for menor ou igual a 12U/L, o fluido será um exsudato. Quando a LDH-F>88U/L, a fosfatase alcalina for maior que 12U/L e se o fluido for neoplásico, a classificação também será de exsudato. Caso o fluido não seja neoplásico, a classificação será de um transudato modificado (Figura 7). Tabela 6: Valores de Lactato Desidrogenase (LDH) e Fosfatase Alcalina (FA) mensurados no fluido dos grupos neoplásicos e não neoplásicos. Niterói RJ, UFF, Número LDH (F) FA(F) Neoplasia Classificação Não neoplásico T Não neoplásico T Não neoplásico T Não neoplásico T Não neoplásico TM Não neoplásico TM Não neoplásico TM Neoplásico TM Não neoplásico TM Não neoplásico TM Não neoplásico TM Neoplásico TM Não neoplásico E Neoplásico E Neoplásico E Neoplásico E Dentro desta regra classificatória todos os animais estudados se enquadram perfeitamente na classificação atribuída aos fluidos cavitários, ou seja, esta regra tem sensibilidade e especificidade de 93,75% nos dados encontrados (somente um fluido, nº 7 não se enquadra nesta classificação, por ter LDH-F=40U/L e não ser um transudato). Contudo não podemos generalizar e fazer desta regra (baseada apenas em análise descritiva) uma regra definitiva, pois dispomos de uma amostra pequena para uma variável que tem

55 43 distribuição não normal. Além disso, o tamanho amostral também afeta indiretamente as significâncias dos testes de dependência associados (Quiquadrado) a estas freqüências. Estudos futuros com amostras maiores podem gerar resultados mais significativos. Figura 7 Associação da Lactato Desidrogenase e Fosfatase Alcalina para classificação do fluido abdominal. Niterói RJ, UFF, 2008.

56 44 5 CONCLUSÕES A determinação da lactato desidrogenase (LDH) no fluido abdominal de cães, como também a sua relação fluido/soro pode ser utilizada para diferenciar transudato de transudato modificado e exsudato. A lactato desidrogenase (LDH) mensurada no fluido abdominal de cães, sua relação fluido/soro e a celularidade, diferenciam grupos neoplásicos e não neoplásicos. A atividade sérica de LDH não varia em cães com efusões classificadas como transudato, transudato modificado e exsudato. A relação fluido/soro da fosfatase alcalina (FA) pode ser utilizada para diferenciar transudato de transudato modificado e exsudato. A determinação da FA no soro e no fluido abdominal de cães, não possibilta diferenciação entre transudato, transudato modificado e exsudato, como também não separa os grupos neoplásicos e não neoplásicos através destes meios e da sua relação fluido/soro. A associação entre os valores de LDH e FA encontrados no fluido abdominal de cães é um método sensível e específico para classificação das efusões abdominais.

57 45 6 BIBLIOGRAFIA ALLEMAN, A. R. Abdominal, Thoracic, and Pericardial Effusions. The Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, v. 33, n. 1, p , ALLISON, R.; WILLIAMS, P.; LANSDOWNE, J. et al. Fatal Hepatic Sarcocystosis in a Puppy with Eosinophilia and Eosinophilic Peritoneal Effusion. Veterinary Clinical Pathology, v. 35, n. 3, p , ARANGO, G. H. Bioestatística: teórica e computacional. 2ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005, 423p. ARGYRES, M. I.; PORTER, J.; RIZEQ, M.N. Diagnosis of Clinically Unsuspected Gallblader Rupture by Peritoneal Fluid Cytology. Acta Cytologica, v. 42, n. 4, p , ATTANASIO, A.; CASTELLARO, I.; ZAPPALÀ, G. et al. L esame Chimico e Citologico nella Diagnosi Differenziale Dell Ascite. Minerva Medica, v. 78, p , BAKER, R.; LUMSDEN, J. H. Pleural and Peritoneal Fluids. In:. Color Atlas of Cytology of the Dog and Cat. Philadelphia: Mosby, p. cap. 9, p BANSAL, S.; KAUR, K.; BANSAL, A. K. Diagnosing Ascitic Etiology on a Biochemical Basis. Hepato-Gastroenterology, v. 45, p , BAUER, N.; MORITZ, A. Flow Cytometric Analysis of Effusions in Dogs and Cats with the Automated Haematology Analyzer ADVIA 120. The Veterinary Record, v. 156, n. 21, p , 2005.

58 46 BELFORD, C.; LUMSDEN, J. H. Citopatología. In: DAVIDSON, M.; ELSE, R.; LUMSDEN, J. Manual de patología clínica en pequeños animales. Madrid: Harcourt, p. cap. 7, p BELLENGER, C. R. Surgery for Bile Duct Rupture and Obstruction in the Dog. Australian Veterinary Journal, v. 49, n. 6, p , BJORLING, D. E.; LATIMER, K.S.; ROWLINGS, C. A. et al. Diagnostic Peritoneal Lavage Before and After Abdominal Surgery in Dogs. American Journal of Veterinary Research, v. 44, n. 5, p , BOOTHE, H. W. Antiseptics and Disinfectants. The Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, v. 28, n. 2, p , BOYER, T. D.; KAHN, A. M..; REYNOLDS, T. B. Diagnostic Value of Ascitic Fluid Lactic Dehydrogenase, Protein and WBC Levels. Archives of Internal Medicine, v. 138, n. 7, p , BRAUN, J. P.; GUELFI, J. F.; PAGES, J. P. Comparison of four methods for determination of total protein concentrations in pleural and peritoneal fluid from dogs. American Journal of Veterinary Research, v. 62, n. 3, p , BRIGHT, J. M. Peripheral edema. In: ETTINGER, S. J.; FELDMAN, E.C. Textbook of Veterinary Internal Medicine. 4. ed. Philadelphia: Saunders, 1995, p BROWN, N. O.; PATNAIK, A. K.; MACEWEN, G. Canine Hemangiosarcoma: Retrospective Analysis of 104 Cases. Journal of American Veterinary Medical Association, v. 186, n. 1, p , CARTER, R. F.; VALLI, V. E. O.; LUMSDEN, J. H. The Cytology, Histology and Prevalence of Cell Types in Canine Lymphoma Classified According to the National Cancer Institute Working Formulation. Canadian Journal of Veterinary Research, v. 50, n. 2, p , CARUSO, K. J.; JAMES, M. P.; FISCHER, D. et al. Cytologic Diagnosis of Peritoneal Cestodiasis in Dogs Caused by Mesocestoides sp. Veterinary Clinical Pathology, v. 32, n. 2, p , 2003.

59 47 CHEVILLE, N. F. Distúrbios do Equilíbrio Hídrico e do Volume Sanguíneo. In:. Introdução à Patologia Veterinária. 2. ed. São Paulo: Roca, p. cap. 7. p CLINKENBEARD, K. D.; COWELL, R. L. Características citológicas de las neoplasias malignas. Waltham Focus, v. 4, n. 3, p. 2-8, CLINKENBEARD, K. D. et al. Diagnostic Cytology: Bacterial Infections. The Compendium, v. 17, n. 1, p , COWELL, R. L.; TYLER, R. D.; MEINKOTH, J. H. Abdominal and Thoracic Fluid. In:. Diagnostic Cytology and Hematology of the Dog and Cat. 2. ed. St. Louis: Mosby, p. cap. 12, p COWELL, R. L.; TYLER, R. D.; MEINKOTH, J. H. Abdominal and Thoracic Fluid. In: COWELL, R. L.; TYLER, R. D. Diagnostic Cytology of the Dog and Cat. California: American Veterinary Publications, p. cap. 13, p CRAIG, J, A.; HELMAN, R. G.; WALKER, M. Costal Bone Changes Similar to Hypertrophic Osteopathy Associated with Pulmonary and Abdominal Mesothelioma in a Dog. Journal of American Veterinary Medical Association, v. 186, n. 10, p , CROSBIE, P. R.; BOYCE, W.M.; PLATZER, E. G. et al. Diagnostic Procedures and Treatment of Eleven Dogs with Peritoneal Infections Caused by Mesocestoides spp. Journal of American Veterinary Medical Association, v. 213, n. 11, p , CUNNINGHAM, J. G. Os Capilares e as Trocas de Líquidos. In:. Tratado de Fisiologia Veterinária. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. cap. 22, p DARKE, P. G.; BONAGURA, J. D.; KELLY, D. F. O Exame Clínico. In:. Atlas Ilustrado de Cardiologia Veterinária. São Paulo: Manole, p. cap. 3, p

60 48 DE SOUZA, M. L.; TORRES, L. F.; ROCHA, N. S. et al. Peritoneal Effusion in a Dog Secondary to Visceral Mast Cell Tumor. Acta Cytologica, v. 45, n. 1, p , DI PINTO, M. N.; DUNSTAN, R. W.; LEE, C. Cystic, Peritoneal Mesothelioma in a Dog. Journal of the American Animal Hospital Association, v. 31, n. 5, p , DJALDETTI, M.; SALMAN, H.; BERGMAN, M. et al. Simple Method for Evaluation of Latex Phagocytosis by Rat Peritoneal Macrophages. Acta Haematologica, v. 98, n. 1, p , ELSE, R. W.; SIMPSON, J. W. Diagnostic Value of Exfoliative Cytology of Body Fluids in Dogs and Cats. The Veterinary Record, v. 123, n. 3, p , ETTINGER, S. J.; BARRET, K. A. Ascites, Peritonitis and other causes of Abdominal Distention. In: ETTINGER, S. J.; FELDMAN, E. C. Textbook of Veterinary Internal Medicine. 4. ed. Philadelphia: Saunders, 1995, p FARIA, E. P. Influência da Armazenagem de Amostras de Sangue nas Dosagens Bioquímicas e Hormonais. Cadernos Técnicos de Veterinária e Zootecnia, n. 31, p , FELDMAN, D.B. Examination of Body Fluids: A discussion of examination of the serous body cavities, as well as synovial and cerebrospinal fluid analysis. Modern Veterinary Practice, p , FOSSUM, T. W.; HAY, W. H.; BOOTHE, H. W. et al. Chylous Ascites in Three Dogs. Journal of American Veterinary Medical Association, v. 200, n. 1, p , FOSSUM, T. W.; WELLMAN, M.; RELFORD, R. L. et al. Eosinophilic Pleural or Peritoneal Effusions in Dogs and Cats: 14 cases ( ). Journal of American Veterinary Medical Association, v. 202, n. 11, p , FROSCHER, B. G.; NAGODE, L. A. Origin and Importance of Increased Alkaline Phosphatase Activity in Peritoneal Fluids of Horses with Colic. American Journal of Veterinary Research, v. 42, n. 5, p , 1981.

61 49 GARCIA-NAVARRO, C. E. K.; PACHALY, J. R. Técnicas Hematológicas. In:. Manual de Hematologia Veterinária. São Paulo: Varela, p. cap. 9, p GARCIA-NAVARRO, C. E. K. Manual de Urinálise Veterinária. São Paulo: Varela, p. GANNON, K. M.; MOSES, L. Uroabdomen in Dogs and Cats. The Compendium, v. 24, n. 8, p , Disponível em: < ME2/dirmod.asp>. Acesso em 07 de outubro de GENINET, C.; BERNEX, F.; RAKOTOVAO, F. et al. Sclerosing Peritoneal Mesothelioma in a Dog A Case Report. Journal of Veterinary Medicine, v. 50, n. 8, p , GEORGE, J. W. The Usefulness and Limitations of Hand-held Refractometers in Veterinary Laboratory Medicine: An Historical and Technical Review. Veterinary Clinical Pathology, v. 30, n. 4, p , GEORGE, J. W.; O`NEILL, S. L. Comparison of Refractometer and Biuret Methods for Total Protein Measurement in Body Cavity Fluids. Veterinary Clinical Pathology, v. 30, n. 1, p , HALPERIN, R.; HADAS, E.; BUKOVSKY, I. et al. Peritoneal Fluid Analysis in the Differentiation of Ovarian Cancer and Benign Ovarian Tumor. European Journal of Gynaecological Oncology, v. 20, n. 1, p , HARBISON, M. L.; GODLESKI, J. J. Malignant Mesothelioma in Urban Dogs. Veterinary Pathology, v. 20, n. 5, p , HIRSCHBERGER, J.; SAUER, U. G. Klinisch-chemische Untersuchung von Körperhöhlenergüssen. Tierärztliche Praxis, v. 19, n. 4, p , HOLMBERG, T. A.; VERNAU, W.; MELLI, A. C. et al. Neospora Caninum Associated with Septic Peritonitis in an Adult Dog. Veterinary Clinical Pathology, v. 35, n. 2, p , HUNT, C. A. Diagnostic Peritoneal Paracentesis and Lavage. The Compedium, v. 2, n. 6, p , 1980.

62 50 HYATT, R. E.; SMITH, J. R. The Mechanism of Ascites. American Journal of Medicine, v. 6, p , ISRAËL, N. V.; KIRBY, B. M.; MUNRO, E. A. C. Septic Peritonitis secondary to unilateral pyometra and ovarian bursal abscessation in a dog. Journal of Small Animal Practice, v. 43, n. 10, p , JONES, T. C.; HUNT, R. D.; KING, N. W. Disturbances of Circulation. In:. Veterinary Pathology. 6. ed. Pensilvania, p. cap. 6, p JÖRUNDSSON, E.; LUMSDEN, J. H.; JACOBS, R. M. Rapid Staining Techniques in Cytopathology: A Review and Comparison of Modified Protocols for Hematoxylin and Eosin, Papanicolaou and Romanowsky Stains. Veterinary Clinical Pathology, v. 28, n. 3, p , KELCH, W. J.; RABAUT, S. M. Traumatic Rupture of the Bile Duct in a Dog. Veterinary Medicine: Small Animal Clinician, v. 73, n. 6, p , KHAN, F. Y. Ascites in the State of Qatar: Aetiology and Diagnostic Value of Ascitic Fluid Analysis. Singapore Medical Journal, v. 48, n. 5, p , KING, L. G.; GELENS, H. C. J. Ascites. Compendium Continuing Education for the Practicing Veterinarian, v. 14, n. 8, p , KOLATA, R. J. Diagnostic Abdominal Paracentesis and Lavage: Experimental and Clinical Evaluations in the Dog. Journal of American Veterinary Medical Association, v. 168, n. 8, p , KRUTH, S. A. Distensão Abdominal, Ascite e Peritonite. In: ETTINGER, S. J.; FELDMAN, E. C. Tratado de Medicina Interna Veterinária: Doenças do Cão e do Gato. 5. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. cap. 39, v. 1, p KUMAR, V.; COTRAN, R. S.; ROBBINS, S. L. Distúrbios do Fluxo Vascular e Choque. In:. Patologia Básica. 5. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. cap. 4, p

63 51 LARKIN, H. A. Collection and Examination of Body Cavity Fluids in Animals. Veterinary Cytology, v. 47, p , LIGHT, R. W.; MACGREGOR, M. I.; LUCHSINGER, P. C. et al. Pleural Effusions: The Diagnostic Separation of Transudates and Exsudates. Annals of Internal Medicine, v. 77, p , MADEWELL, B. R.; JAIN, N. C.; PADRID, P. et al. Bizarre Lymphoid Cells in Serous Effusion of a Dog with Mediastinal Lymphoma. Journal of Comparative Pathology, v. 99, n. 2, p , MAHAFFEY, M. B.; BARBER, D. L. The Peritoneal Space. In: THRALL, D. E. Textbook of Veterinary Diagnostic Radiology. 3. ed. Philadelphia: Saunders, p. cap. 37, p MARKS, S. L. Condutas em Emergência e Terapia Intensiva. In: TILLEY, L. P.; GOODWIN, J. K. Manual de Cardiologia para cães e gatos. 3. ed. São Paulo: Roca, p. cap. 20, p MATTHIESEN, D. T.; LAMMERDING, J. Gallblader Rupture and Bile Peritonitis Secondary to Cholelithiasis and cholecystitis in a dog. Journal of American Veterinary Medical Association, v. 184, n. 10, p , MEGNER, W. J.; TRUMP, B. Distúrbios Hemodinâmicos. In: RUBIN, E.; FABER, J. L. Patologia. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002, p METINTAS, M.; ALATAS, Ö.; ALATAS, F. et al. Comparative Analysis of Biochemical Parameters for Differentiation of Pleural Exsudates from Transudates Light s Criteria, Cholesterol, Bilirubin, Albumin Gradient, Alkaline Phosphatase, Creatine Kinase, and Uric Acid. Clinica Chimica Acta, v. 264, n. 2, p , MEYER, D. J. Obtenção e Manuseio das Amostras para Exame Citológico. In: RASKIN, R. E.; MEYER, D. J. Atlas de Citologia de Cães e Gatos. São Paulo: Roca, p. cap. 1, p

64 52 MEYER, D. J.; COLES, E. H.; RICH, L. J. Avaliação das Efusões. In:. Medicina de Laboratório Veterinária: Interpretação e Diagnóstico. São Paulo: Roca, p. cap. 11, p MEYER, D. J.; FRANKS, P. T. Effusion: Classification and Cytologic Examination. In:. Veterinary Laboratory Medicine: In Practice, The Compendium collection. New Jersey, 1993, p MONGIL, C. M.; DROBATZ, K. J.; HENDRICKS, J. C. Traumatic Hemoperitoneum in 28 Cases: A Retrospective Review. Journal of the American Animal Hospital Association, v. 31, n. 3, p , MOTA, E. F. F.; OLIVEIRA, S. R. Diagnóstico Citológico em Medicina Veterinária. Cadernos Técnicos de Veterinária e Zootecnia, n. 30, p , NAZIFI, S.; DEHGHANI, S.; BARZEGAR, M. R. Evaluation of Cellular and Biochemical Parameters of Blood and Peritoneal Fluid Following Enterectomy in the Goat. Small Ruminant Research, v. 37, n. 1-2, p , NESTOR, D. D.; McCULLOUGH, S. M.; SCHAEFFER, D. J. Biochemical Analysis of Neoplastic Versus Nonneoplastic Abdominal Effusions in Dogs. Journal of the American Animal Hospital Association, v. 40, n. 5, p , NETTO, M. B.; SANTOS, J. L.; MONTENEGRO, M. R. Perturbações Circulatórias. In: MONTENEGRO, M. R.; FRANCO, M. Patologia: Processos Gerais. 4. ed. São Paulo: Atheneu, p. cap. 5, p OLMOS, M.; MARINEZ, A.; RAFFO, C. et al. Valoracion de la Utilidad del Estudio FisicoQuimico del Liquido Ascitico en Pacientes con Hepatopatias Cronicas, Neoplasias y Peritonitis Espontanea. Acta Gastroenterológica Latinoamericana, v. 20, p , PARAMOTHAYAN, N. S.; BARRON, J. New Criteria for the Differentiation between Transudates and Exsudates. Journal of Clinical Pathology, v. 55, p , 2002.

65 53 PARCHMAN, M. B.; FLANDERS, J. A. Extrahepatic Biliary Tract Rupture Evaluation of the Relationship between the Site of Rupture and the Cause of Rupture in 15 Dogs. The Cornell Veterinarian, v. 80, n. 3, p , PARRY, B. W. Miscellaneous Laboratory Techniques. In: PRATT, P. W. Laboratory Procedures for Veterinary Technicians. 3. ed. St. Louis: Mosby, p. cap. 12, p PRASSE, K. W.; DUNCAN, J. R. Laboratory Diagnosis of Pleural and Peritoneal Effusions. The Veterinary Clinics of North America: Symposium on Clinical Laboratory Medicine, v. 6, n. 4, p , ROCHA, A.; SILVA, A. M. Distúrbios da Circulação. In: FILHO, G. B.; PITTELLA, J. E. H.; PEREIRA, F. E. L. et al. Patologia. 5. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. cap. 6, p ROGERS, K. S.; BARTON, C. L.; HABRON, J. M. Cytology During Surgery. The Compendium, v. 18, n. 2, p , SALERNO, F.; RESTELLI, B.; INCERTI, P. et al. Utility of Ascitic Fluid Analysis in Patients with Malignancy-Related Ascites. Scandinavian Journal of Gastroenterology, v. 25, n. 3, p , SAULEZ, M. N.; CEBRA, C. K.; TORNQUIST, S. J. The Diagnostic and Prognostic Value of Alkaline Phosphatase Activity in Serum and Peritoneal Fluid from Horses with Acute Colic. Journal of Veterinary Internal Medicine, v. 18, n. 4, p , SCHNEIDER, D.; HALPERIN, R.; LANGER, R. et al. Peritoneal Fluid Lactate Dehydrogenase in Ovarian Cancer. Gynecologic Oncology, v. 66, n. 3, p , SERAKIDES, R. Colheita e Remessa de Material para Exames Laboratoriais. Cadernos Técnicos de Veterinária e Zootecnia, n. 16, p , SHIBATA, S. J.; HIRAMATSU, Y.; KASEDA, M. et al. The Time Course of Lymph Drainage from the Peritoneal Cavity in Beagle Dogs. The Journal of Veterinary Medical Science, v. 68, n. 11, p , 2006.

66 54 SHELLY, S. M. Fluidos de Cavidades Corporais. In: RASKIN, R. E.; MEYER, D. J.; Atlas de Citologia de Cães e Gatos. São Paulo: Roca, p. cap. 6, p SMITH, D. A.; HILL, F. W. G. Metastatic Malignant Mesothelioma in a Dog. Journal of Comparative Pathology, v. 100, n. 1, p , SMITH, H. A.; JONES, T. C.; HUNT, R. D. Disturbances of Circulation. In:. Veterinary Pathology. 4. ed. Philadelphia: Lea & Febiger, p. cap. 5, p SPAK, I. On the Clinical Value of Chemical Analysis of Ascites: A study of the Main Proteins and Some Enzymes in Ascites of Differing Etiology. Acta Chirurgica Scandinavica. Suppl. 261, 128 p. cap. 7, p , STEYN, P. F.; WITTUM, T. E. Radiographic, epidemiologic, and clinical aspects of simultaneous pleural and peritoneal effusions in dogs and cats: 48 cases ( ). Journal of American Veterinary Medical Association, v. 202, n. 2, p , THOMPSON, S. M. R. Biliary Tract Surgery in the Dog: A review. Journal of Small Animall Practice, v. 22, n. 7, p , THRALL, M. A.; BAKER, D. C.; CAMPBELL, T. W. et al. Tecnologia Laboratorial em Medicina Veterinária. In:. Hematologia e Bioquímica Clínica Veterinária. São Paulo: Roca, p. cap 1, p THRALL, M. A.; BAKER, D. C.; CAMPBELL, T. W. et al. Coleta e Processamento de Amostras e Análise das Opções de Serviços Laboratoriais. In:. Hematologia e Bioquímica Clínica Veterinária. São Paulo: Roca, p. cap. 2, p THRALL, M. A.; BAKER, D. C.; CAMPBELL, T. W. et al. Interpretação da Resposta Leucocitária nas Doenças. In:. Hematologia e Bioquímica Clínica Veterinária. São Paulo: Roca, p. cap. 12, p THRALL, M. A.; BAKER, D. C.; CAMPBELL, T. W. et al. Avaliação Laboratorial do Fígado. In:. Hematologia e Bioquímica Clínica Veterinária. São Paulo: Roca, p. cap. 23, p

67 55 TURK, J. R.; CASTEEL, S. W. Clinical Biochemistry in Toxicology. In: KANEKO, J. J.; HARVEY, J. W.; BRUSS, M. L. Clinical Biochemistry of Domestic Animals. 5. ed. California: Academic Press, p. cap. 23, p TYLER, R. D.; COWELL, R. L. Evaluation of Pleural and Peritoneal Effusions. The Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, v. 19, n. 4, p , TYLER, R. D.; COWELL, R. L.; BALDWIN, C. J. et al. Introduction. In: COWELL, R. L.; TYLER, R. D.; MEINKOTH, J. H. Diagnostic Cytology and Hematology of the Dog and Cat. 2 ed. St. Louis: Mosby, p. cap. 1, p WATKINS, P. E.; PEARSON, H.; DENNY, H. R. Traumatic Rupture of the Bile Duct in the Dog: A Report of Seven Cases. Journal of Small Animall Practice, v. 24, p , 1983.

68 ANEXOS 56

69 57 ANEXO 1 UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS FACULDADE DE VETERINÁRIA PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Eu, Francisco Ferreira Lima Júnior, Médico Veterinário (CRMV-RJ 8419), encontrando-me regularmente matriculado no curso de Mestrado com área de concentração em Clínica e Reprodução Animal, na Faculdade de Veterinária da Universidade Federal Fluminense sob o número M , informo que realizo uma pesquisa para minha dissertação de final de curso sobre efusão abdominal. O presente estudo pretende identificar e analisar diversos perfis bioquímicos no soro e no sobrenadante do fluido de cães, portadores da condição efusiva supracitada. Para isto, venho respeitosamente solicitar a autorização do proprietário do paciente, como também do colega Médico Veterinário que atende e é responsável pelo caso clínico, para proceder as coletas referentes ao fluido cavitário e sangue, inserindo desta forma os dados do referido paciente na pesquisa. Os procedimentos de coleta, bem como as análises laboratoriais não terão custo adicional ao proprietário, por se tratar de um instrumento de pesquisa. Os resultados serão disponibilizados ao proprietário e ao Médico Veterinário responsável pelo caso. Todos os procedimentos ambulatoriais e laboratoriais serão rigorosamente os mesmos que se utilizam como conduta profissional de rotina frente a esses casos. Nenhuma das informações obtidas será divulgada de forma a permitir sua identificação. Pretendo como resultado desta pesquisa, colaborar expressivamente para o estudo das efusões cavitárias. Esta pesquisa está sendo supervisionada e orientada pelo professor Dr. Nayro Xavier de Alencar, da Universidade Federal Fluminense. Agradeço sua participação e estou a sua disposição para esclarecer quaisquer dúvidas sobre a pesquisa. Francisco Ferreira Lima Júnior limacardio@vm.uff.br / Tel.: Declaramos que nos sentimos suficientemente esclarecidos sobre os objetivos da pesquisa e concordamos em autorizar. Assinatura do Proprietário Assinatura e carimbo do Médico Veterinário Niterói, / /20.