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- Gustavo Pinhal Gesser
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1 BIO-FLASH Toxo IgG testes BIO-FLASH Toxo IgG é um ensaio imunológico quimiluminescente de dois passos totalmente automatizado para a determinação quantitativa de anticorpos IgG anti-toxoplasma gondii em soro ou plasma humano com o instrumento BIO-FLASH. Sumário A toxoplasmose é uma doença infecciosa que afeta tanto a humanos como a animais, e é causada pelo protozoário Toxoplasma gondii. 1 A toxoplasmose adquirida é geralmente assintomática e benigna. 2 No entanto, em mulheres grávidas esta infecção é importante já que o parasita pode entrar na circulação do feto através da placenta e provocar toxoplasmose congênita. Diversos estudos têm demonstrado que o risco e a gravidade da toxoplasmose congênita são maiores quando se adquire durante os três primeiros meses de gestação. 3-6 As conseqüências da toxoplasmose congênita vão desde o aborto espontâneo e o nascimento prematuro a sintomas neurológicos e generalizados, que geralmente envolvem complicações oculares. Os recém-nascidos com toxoplasmose congênita também podem permanecer assintomáticos durante várias semanas depois do nascimento. Vários estudos têm indicado que a presença de certa concentração de IgG maternal anti-toxoplasma antes da gravidez protege o feto contra a infecção pelo parasita. Os exames sorológicos também podem servir para identificar uma gravidez de risco; as mulheres soronegativas no momento do diagnóstico da gravidez podem ser controladas durante o seu curso. A análise dos isotipos dos anticorpos específicos anti-toxoplasma gondii pode ajudar a determinar o momento em que foi contraída a infecção. 7,8 Desta forma é possível detectar uma infecção recente, tomar as medidas profiláticas necessárias e estabelecer o tratamento adequado. A detecção de IgM específica possibilita o seguimento da mulher grávida, já que as infecções por toxoplasma normalmente não são detectadas clinicamente. O monitoramento sorológico permite a detecção precoce de soro-conversão e, dependendo da gravidade da infecção congênita do feto, a decisão imediata sobre as medidas necessárias. A toxoplasmose pode ser fatal em pacientes imunocomprometidos (AIDS, transplante de órgãos). Nos pacientes com AIDS, a toxoplasmose aguda geralmente aparece como conseqüência da reativação de uma infecção latente prévia, ainda que também haja diagnósticos de infecções primárias. 9 Princípio Quando as micropartículas paramagnéticas de BIO-FLASH Toxo IgG são misturadas e incubadas com a amostra, se esta apresenta anticorpos específicos anti-toxoplasma, estes se combinam com os antígenos de toxoplasma que recobrem as micropartículas. Depois de uma separação magnética e lavagem para eliminar resíduos da amostra, se adiciona um traçador que consiste em um anticorpo monoclonal anti-igg humana marcado com isoluminol que se une aos anticorpos IgG anti-toxoplasma capturados pelas micropartículas. Depois de uma segunda incubação, separação magnética e lavagem, se adicionam os reagentes que ativam a reação quimiluminescente. O luminômetro do BIO-FLASH mede a luz emitida como unidades relativas de luz (URL) que são diretamente proporcionais à concentração de IgG anti-toxoplasma da amostra. O BIO-FLASH utiliza um método de redução de dados com ajuste a uma curva logística de 4 parâmetros (4PLC) para gerar uma Curva de Calibração Mestre (CCM). Esta curva vem predefinida, depende do lote e é guardada no instrumento através do código de barras do cartucho. Com a leitura dos calibradores (que se fornecem em um kit separado), a CCM predefinida se transforma em uma Curva de Calibração de Trabalho (CCT) nova e específica para o instrumento. As concentrações dos calibradores estão incluídas nos códigos de barras dos tubos dos calibradores. Esquema da reação: LER ALTERAÇÕES DESTACADAS Ativadores (Triggers) Activadores (Triggers) URL URL Partícula magnética Amostra Traçador Emissão de luz
2 Componentes Cartucho de reagentes O kit BIO-FLASH Toxo IgG contém um cartucho de reagentes para 50 determinações (REF ). Nota: O desenho do cartucho está protegido por patente (US D565,741 / Desenho CE ) Composição do cartucho de reagentes: O cartucho está composto por 4 frascos que contêm: A. 1 frasco cilíndrico de suspensão de micropartículas recobertas com antígeno de Toxoplasma em tampão fosfato. Contém < 0,1% de azida sódica. B. 1 frasco de tampão de ensaio. Contém < 0,1% de azida sódica. C. 1 frasco opaco de traçador que consiste em anticorpo monoclonal murino anti-igg humana marcado com isoluminol. Contém < 0,1% de azida sódica. D. 1 frasco vazio. Preparação Veja a figura seguinte. Cartucho: as micropartículas sedimentam durante o transporte e o armazenamento, por isso é preciso misturá-las para voltar a ressuspendê-las. Antes de utilizar o cartucho pela primeira vez, inverta-o suavemente 30 vezes evitando a formação de espuma (as bolhas podem fazer com que os sensores de líquido do instrumento dêem leituras errôneas). Comprove que as micropartículas estejam totalmente em suspensão. Se não for assim, continue invertendo o cartucho até que as partículas se ressuspendam totalmente. Se as micropartículas não se ressuspendem ou detecta que o pré-cinto dos reagentes está furado, NÃO UTILIZE O CARTUCHO. Uma vez que as micropartículas estejam em suspensão, coloque o cartucho sobre uma superfície sólida e retire com cuidado a lingüeta vermelha de segurança para o transporte. Mantendo o cartucho sobre a superfície sólida, aperte as duas abas situadas nos dois lados da tapa perfurante (peça cinza) e pressione a parte superior do cartucho até que fique em posição de bloqueio. Uma vez em posição de bloqueio, as abas têm que ficar ocultas. Não inverta o cartucho aberto. Deixe o cartucho repousar durante 5 minutos antes de carregá-lo no instrumento. Uma vez carregado o cartucho, o instrumento mistura seu conteúdo de forma automática em intervalos periódicos.
3 Precauções Os reagentes BIO-FLASH são para diagnóstico IN VITRO. Uso exclusivo para profissionais. A azida sódica pode reagir com encanamentos e ralos de chumbo ou cobre originando azidas metálicas altamente explosivas. Ao eliminar os restos de reagentes, fazê-lo em abundante volume de água. ATENÇÃO: MATERIAL DE RISCO BIOLÓGICO. Descartar todos os materiais usados em recipientes adequados para material bio-contaminante. Por favor, não reutilize nem reintroduza reagentes nos cartuchos ou frascos. Classe de perigo Não classificado. Advertências de perigo Nenhuma. Recomendações de prudência P280: Usar luvas de proteção/vestuário de proteção/proteção ocular/proteção facial. P : SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: enxaguar cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contato, retire-as, se tal lhe for possível. Continuar a enxaguar. Coleta e conservação das amostras Usar soro fresco (também se pode utilizar tubos com gel separador de soro) ou plasma (EDTA, Li-heparina, Li-heparina em tubo com gel separador, Na-heparina e Na-citrato). Outros anticoagulantes devem ser comprovados antes de utilizar-se. Os anticoagulantes líquidos como o Na-citrato exercem um efeito de diluição e podem reduzir a concentração de amostras de pacientes. As amostras não devem ser inativadas por calor. As partículas em suspensão devem ser eliminadas por centrifugação. Nas diretrizes CLSI H18-A3 e H21-A5 encontrará mais informação sobre o manuseio, o transporte, o processamento e a conservação das amostras. Soro As amostras de soro podem ser conservadas a 2-8 C durante 8 dias. Para um período de tempo mais longo, devem ser congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20 C. As amostras podem congelar-se/descongelar-se no máximo 3 vezes. Misturá-las bem depois de descongelar. Comprove que não haja bolhas nas amostras e, em caso contrário, elimine-as todas antes da análise. Plasma As amostras de plasma podem ser conservadas a 2-8 C durante 8 dias. Para um período de tempo mais longo, devem ser congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20 C. Descongelar o plasma a 37 C. Descongelar as amostras somente uma vez. Misturá-las bem depois de descongelar. Comprove que não haja bolhas nas amostras e, em caso contrário, elimine-as todas antes da análise. Volume de amostra O volume de amostra necessário para realizar um único teste com BIO-FLASH Toxo IgG varia em função do tipo de recipiente que se utilize. Um teste requer ao menos 15 µl mais o volume morto, que é de 200 µl se é utilizada a copa de amostra recomendada (REF ). Outros materiais Os seguintes materiais não são fornecidos com o cartucho de reagentes e devem ser comprados por separado. REF REF BIO-FLASH Toxo IgG Calibrators (Calibradores) BIO-FLASH Toxo IgG Controls (Controles) Leia com atenção as instruções correspondentes se deseja mais informação. Não utilize outros calibradores. A informação que necessita o instrumento BIO-FLASH para calibrar o ensaio BIO-FLASH Toxo IgG está incluída nos códigos de barras dos tubos. Utilizar controles de outros fabricantes pode dar lugar a resultados imprevistos. Assegure-se de que no instrumento BIO-FLASH haja uma quantidade suficiente dos seguintes consumíveis antes de processar amostras, calibradores ou controles: REF BIO-FLASH Cuvettes (Cubetas) Nota: O desenho das cubetas está protegido por patente (US D560,816 / Desenho CE ). REF BIO-FLASH Triggers (Ativadores) REF REF BIO-FLASH System Rinse (Solução do sistema) BIO-FLASH Sample Diluent (Diluente das amostras)
4 Instrumento / realização do ensaio No Manual do Usuário do BIO-FLASH encontrará as instruções completas para realizar o ensaio. Calibração O código de barras do cartucho contém uma Curva de Calibração Mestre (CCM) que é válida para o lote de reagentes. No entanto, para todos os reagentes se necessita uma Curva de Calibração de Trabalho (CCT), que é específica para cada lote e válida até a data de validade do lote. É preciso obter uma nova CCT quando os resultados dos controles saiam fora do intervalo de aceitação ou quando se tenha realizado ajustes no instrumento. Leia com atenção o Manual do Usuário do BIO-FLASH para configurar uma CCT. Controle de qualidade Para realizar um programa completo de controle de qualidade é recomendável passar três níveis de controles. Os controles BIO-FLASH Toxo IgG negativo, positivo e positivo alto foram desenhados para tal programa. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça a sua própria média e desvio padrão e um programa de controle de qualidade para monitorizar seus resultados. Os controles devem ser analisados ao menos cada 24 horas por dia de utilização. Se os controles estão fora do intervalo pode ser necessário recalibrar o instrumento. No Manual do Usuário do instrumento encontrará mais informação. Para a identificação e resolução de situações anormais de controle de qualidade, consulte Westgard et al. 10 Conservação e estabilidade Os reagentes que não tenham sido abertos se mantêm estáveis até a data de validade indicada no rótulo do cartucho se forem conservados a 2-8 C em posição vertical. Uma vez aberto, a estabilidade do cartucho carregado no instrumento BIO-FLASH ou guardado a 2-8 C é de 11 semanas. Rastreabilidade de calibradores e controles Os valores são expressos em UI/mL e foram estabelecidos por meio de múltiplos ensaios com o instrumento BIO-FLASH utilizando lotes específicos de reagentes, com referência a padrões internos referenciados ao standard internacional da OMS para soro Ig Anti-Toxoplasma (código NIBSC: TOXM). Interpretação de resultados A quantidade de analito em cada amostra se determina a partir da luz emitida (URL), por interpolação na Curva de Calibração de Trabalho guardada. A determinação quantitativa das IgG anti-toxoplasma com o ensaio BIO-FLASH Toxo IgG ajuda a determinar o estado imunitário do paciente: As amostras com uma concentração < 8,0 UI/mL são consideradas não reativas (negativas). As amostras com uma concentração 8,0 e < 10,0 UI/mL são consideradas indeterminadas (zona cinza). As amostras que se interpretem como indeterminadas deverão re-analisadas. Se ao repetir se obtém um resultado indeterminado, se deve reportar como tal e deve ser realizado outro ensaio com um método alternativo ou obter e testar uma segunda amostra. As amostras com uma concentração 10,0 UI/mL são consideradas reativas (positivas). Em pacientes com suspeita de soro-conversão, deve-se colher uma segunda amostra de soro entre 2 e 4 semanas depois da primeira e avaliar ambas de forma conjunta para anticorpos IgG anti-toxoplasma. Um aumento significativo na concentração de anticorpos IgG anti-toxoplasma entre a primeira e a segunda amostra de soro pode ser considerado como indicativo de soro-conversão devido a infecção recente. Se há suspeita de uma infecção recente, é muito recomendável analisar a amostra para anticorpos IgM anti-toxoplasma. Os anticorpos IgM se detectam em pessoas que adquiriram a infecção recentemente, mas podem persistir por até 18 meses depois da infecção. 11 Um resultado negativo de IgG anti-toxoplasma não descarta uma infecção recente. Dado que os anticorpos IgG anti-toxoplasma podem aparecer ligeiramente mais tarde que os anticorpos IgM, se recomenda analisar igualmente os anticorpos IgM anti-toxoplasma durante o monitoramento sorológico de mulheres grávidas. O ensaio BIO-FLASH Toxo IgM REF é adequado para este fim. Limitações O resultado de uma única amostra não é suficiente para diagnosticar uma infecção primária por toxoplasma. Portanto, além dos resultados de BIO-FLASH Toxo IgG é preciso ter em conta outros dados como, por exemplo, a sintomatologia, a historia clínica, os resultados de outras provas, e toda a informação adicional relevante.
5 Resultados esperados Aproximadamente um terço da população mundial possui anticorpos anti-toxoplasma, mas há diferenças importantes entre países e inclusive dentro de um mesmo país quanto à sua prevalência. Na Inglaterra e Gales a prevalência aumenta com a idade 0,5% - 1,0% ao ano até alcançar ao redor de 30% em indivíduos de 40 anos. Já na França, 80% - 90% da população dá positivo para anticorpos a essa idade. 12 Em um estudo multicêntrico levado a cabo em mais de amostras de soro de mulheres grávidas em Barcelona (Espanha), 28,6% apresentavam anticorpos anti-toxoplasma. Foram detectados anticorpos específicos IgM em 2,2% das mulheres com anti-toxoplasma. 13 Em um estudo realizado na Noruega entre 1992 e 1994 do qual participaram grávidas, 10,9% eram positivas de anticorpos anti-toxoplasma antes do início da gravidez. Entre as mulheres não infectadas previamente, 0,17% demonstraram evidência de infecção primária durante a gestação. 14 Características funcionais NOTA: os seguintes dados são representativos; os resultados em experimentos isolados podem variar respeito a estes dados. Comparação de métodos BIO-FLASH Toxo IgG foi avaliado em estudos comparativos com outros ensaios comerciais. Avaliação interna Foi analisado com BIO-FLASH Toxo IgG um painel de amostras de variada procedência que incluía soros positivos e negativos de anticorpos IgG anti-toxoplasma e os resultados foram comparados com os obtidos com um método de EIA Toxo IgG comercial. Os resultados indeterminados não foram considerados para os cálculos. Método de referência BIO-FLASH Toxo IgG IND NEG POS Total IND NEG POS Total Foram obtidos os seguintes resultados iniciais de sensibilidade e especificidade relativas e concordância global: Sensibilidade relativa Especificidade relativa Concordância global ,8% 94,9% a 99,3% 100,0% 98,1% a 100,0% 98,8% 97,2% a 98,6% O painel foi provado com outros métodos comerciais de Toxo IgG e as amostras discrepantes foram resolvidas. O resumo dos resultados de consenso, excluindo as 6 amostras indeterminadas com BIO-FLASH Toxo IgG e as 4 amostras para as quais não se chegou a um consenso, se apresenta na seguinte tabela: Consenso BIO-FLASH Toxo IgG NEG POS Total NEG POS Total Em relação ao consenso foram obtidos os seguintes resultados de sensibilidade, especificidade e concordância global: Sensibilidade vs. consenso Especificidade vs. consenso Concordância vs. consenso ,0% 98,3% a 100,0% 100,0% 98,1% a 100,0% 100,0% 99,1% a 100,0% Avaliação externa Foi realizada uma avaliação externa no Servei de Microbiologia do Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona (Espanha). As amostras foram caracterizadas mediante outro método comercial, MEIA Toxo IgG, e analisadas com BIO-FLASH Toxo IgG. Os resultados indeterminados não foram considerados para os cálculos.
6 Método de referência BIO-FLASH Toxo IgG IND NEG POS Total IND NEG POS Total Foram obtidos os seguintes resultados iniciais de sensibilidade e especificidade relativas e concordância global: Sensibilidade relativa Especificidade relativa Concordância global ,7% 98,2% a 100,0% 100,0% 99,0% a 100,0% 99,8% 99,1% a 100,0% A amostra discrepante foi analisada com um método ELFA Toxo IgG comercial e foi resolvida como negativa a favor de BIO-FLASH Toxo IgG. Depois do ensaio adicional foram obtidos os seguintes resultados finais de sensibilidade, especificidade e concordância global: Sensibilidade final Especificidade final Concordância global final ,0% 98,8% a 100,0% 100,0% 99,0% a 100,0% 100,0% 99,4% a 100,0% Painel SeraCare-BBI Foi analisado o painel comercial de BBI anti-toxo mixed titer panel PTT201, composto de 25 amostras caracterizadas. Os resultados do ensaio BIO-FLASH Toxo IgG concordaram em todos os casos com o consenso de resultados da maioria de fabricantes. Painel CDC O painel de soros humanos Toxoplasma 1998 do CDC composto por 70 amostras de soro positivas e 30 amostras de soro negativas foi analisado com o ensaio BIO-FLASH Toxo IgG com um resultado de sensibilidade e especificidade de 100,0%. Precisão A precisão intra-ensaio e total (ensaio a ensaio e dia a dia) foram avaliadas em múltiplos ensaios, conforme as diretrizes CLSI EP05-A. Os resultados estão resumidos na tabela seguinte: Média (UI/mL) CV% (Intra-ensaio) CV% (Total) Controle negativo 2,8 4,7 6,3 Controle positivo 50,4 4,1 5,7 Controle positivo alto 279,4 6,4 10,5 Ao redor do valor de corte 9,1 3,6 5,3 Reprodutibilidade Foi avaliada a reprodutibilidade entre réplicas, entre lotes e entre instrumentos. Os resultados se apresentam na tabela seguinte: Pendente Intersecção R Réplica 2 vs. Réplica ,00 0,98 a 1,03-0,01-0,47 a 0,48 0,99 0,99 a 1,00 Lote 2 vs. Lote ,97 0,93 a 1,02 0,76 0,10 a 1,89 0,98 0,97 a 0,99 Instrumento 2 vs. Instrumento ,05 1,03 a 1,07 0,09-0,27 a 0,64 1,00 1,00 a 1,00 Interferências Estudos segundo as diretrizes CLSI EP7-A demonstraram que as seguintes substâncias potencialmente interferentes não alteram os resultados de BIO-FLASH Toxo IgG:
7 Substância potencialmente interferente Concentração % Interferência Hemoglobina 500 mg/dl 10 Bilirrubina indireta 18 mg/dl 10 Bilirrubina direta 18 mg/dl 10 Triglicérides 1300 mg/dl 10 Fator reumatóide 800 UI/mL 10 Reatividade cruzada Quando foram analisadas 120 amostras com potencial de produzir reação cruzada com o ensaio BIO-FLASH Toxo IgG e os resultados foram comparados com ensaios comerciais de Toxo IgG foi obtida a seguinte concordância: Reação cruzada potencial Concordância IgG contra rubéola 9/9 Anti-CMV IgG (anticorpos contra citomegalovírus) 16/16 Anti-HIV (anticorpos contra o vírus da imunodeficiência humana) 6/6 HAMA (anticorpo humano anti-murino) 5/5 SLE (Lupus eritematoso sistêmico) 3/3 ANA (anticorpos anti-nucleares) 10/10 Anti-EBV (anticorpos contra o vírus Epstein-Barr) 6/6 Anti-PV B19 (anticorpos contra Parvovírus B19) 6/6 Anti-HSV 1 (anticorpos contra o vírus Herpes simplex tipo 1) 5/5 Anti-VZV (anticorpos contra o vírus da Varicela Zoster) 5/5 Paraproteinas IgG e IgM 6/6 IgG e IgM elevadas 5/5 Anticorpos heterófilos 5/5 RF (Fator Reumatóide) 10/10 Mulheres grávidas (multíparas incluídas) 22/22 Limite de detecção O limite de detecção (LD), determinado segundo as diretrizes CLSI EP17-A, se situa em 0,9 UI/mL. Limite de quantificação O limite de quantificação (LQ), determinado segundo as diretrizes CLSI EP17-A, se situa em 0,9 UI/mL. Linearidade O ensaio BIO-FLASH Toxo IgG é linear entre 0,9 e 500 UI/mL segundo as diretrizes CLSI EP6-A. No entanto, a linearidade pode ser ampliada até 7500 UI/mL por diluição se a opção de re-run automático for ativada. Consulte o Manual do Usuário do BIO-FLASH para ativar a opção de re-run automático.
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