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- Judite Covalski Amarante
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1 BIO-FLASH Chagas testes BIO-FLASH Chagas é um ensaio imunológico quimiluminescente de dois passos, totalmente automatizado, para a determinação qualitativa de anticorpos IgG e IgM contra Trypanosoma cruzi em soro ou plasma humano com o instrumento BIO-FLASH. Sumário 1-4 A doença de Chagas é uma infecção parasitária crônica causada por um protozoário flagelado, o Trypanosoma cruzi. O parasita é transmitido a humanos ou a outros mamíferos por um inseto triatomíneo, da familia Reduviidae. A transmissão do T. cruzi também pode ser congênita ou por transfusão de sangue contaminado ou ainda por transplante de órgãos. A transmissão através de alimentos contaminados também está descrita na literatura. O ciclo de vida do parasita é longo e complexo, com várias etapas de desenvolvimento no inseto vetor e no hospedeiro vertebrado. A doença compreende tres etapas: uma fase aguda curta e uma fase crônica de longa duração, separadas por uma longa fase assintomática, chamada fase indeterminada. Na primeira e na terceira etapas diversos órgãos podem ser afetados e a doença pode ser fatal em ambas as etapas. Estima-se que até 30% das pessoas com a forma indeterminada da infeccão sofrerão dano cardíaco, digestivo ou neurológico no transcurso de um período entre 10 e 20 anos após a infecção. Os anticorpos aparecem pouco depois da infecção e alcançam níveis elevados, podendo persistir, junto com a infecção, durante muitos anos. O kit BIO-FLASH Chagas permite uma detecção específica e de alta sensibilidade dos anticorpos anti-t. cruzi nas fases aguda e crônica da enfermidade graças ao uso de antígenos recombinantes. A detecção da infecção por T. cruzi é importante para o diagnóstico da doença de Chagas, assim como para sua prevenção, tratamento e prognóstico dos indivíduos. Princípio Quando as micropartículas paramagnéticas de BIO-FLASH Chagas são misturadas e incubadas com a amostra, se esta apresentar anticorpos específicos contra T. cruzi, estes se combinarão com os antígenos específicos de T. cruzi que recobrem as micropartículas. Depois de uma separação magnética e lavagem para eliminar resíduos da amostra se adiciona um traçador que consiste em anticorpos anti-igg e anti-igm humanas marcados com isoluminol, que se unem aos anticorpos específicos T. cruzi capturados pelas micropartículas. Depois de uma segunda incubação, separação magnética e lavagem, adicionam-se os reagentes que ativam a reação quimiluminescente. O luminômetro do BIO-FLASH mede a luz emitida em unidades relativas de luz (URL) que são diretamente proporcionais à concentração de anticorpos específicos contra T. cruzi na amostra. O BIO-FLASH utiliza um método de redução de dados com ajuste a uma curva logística de 4 parâmetros (4PLC) para gerar uma Curva de Calibração Mestre (CCM). Esta curva vem predefinida, depende do lote e é guardada no instrumento através do código de barras do cartucho. Com a leitura dos calibradores (que se fornecem em um kit separado), a CCM predefinida se transforma em uma Curva de Calibração de Trabalho (CCT) nova e específica para o instrumento. As concentrações dos calibradores estão incluídas nos códigos de barras dos tubos dos calibradores. Esquema da reação: LER ALTERAÇÕES DESTACADAS Ativadores (Triggers) URL Partícula magnética Amostra Traçador Emissão de luz
2 Componentes Cartucho de reagentes O kit BIO-FLASH Chagas contém um cartucho de reagentes para 100 determinações (REF ). NOTA: O desenho do cartucho está protegido por patente (US D565,741 / Desenho CE ) Composição do cartucho de reagentes: O cartucho está composto por 3 frascos que contêm: A. 1 frasco cilíndrico de suspensão de micropartículas recobertas com antígenos recombinantes de T. cruzi purificados. Contém < 0,1% de azida sódica e 0,15% de Proclin 950. B. 1 frasco de tampão de ensaio. Contém < 0,1% de azida sódica e 0,05% de Triton-X 100. C. 1 frasco opaco de traçador que consiste em anticorpo monoclonal murino anti-igg humana e anti-igm humana marcado com isoluminol. Contém < 0,1% de azida sódica e 8,0% de etilenoglicol. D. 1 frasco vazio. Preparação Veja a figura seguinte. Cartucho: as micropartículas sedimentam durante o transporte e o armazenamento, por isso é preciso misturá-las para voltar a ressuspendê-las. Antes de utilizar o cartucho pela primeira vez, inverta-o suavemente 30 vezes evitando a formação de espuma (as bolhas podem fazer com que os sensores de líquido do instrumento dêem leituras errôneas). Comprove que as micropartículas estejam totalmente em suspensão. Se não for assim, continue invertendo o cartucho até que as micropartículas se ressuspendam totalmente. Se as micropartículas não se ressuspendem ou detecta que o pré-cinto dos reagentes está furado NÃO UTILIZE O CARTUCHO. Uma vez que as micropartículas estejam em suspensão, coloque o cartucho sobre uma superfície sólida e retire com cuidado a lingüeta vermelha de segurança para o transporte. Mantendo o cartucho sobre a superfície sólida, aperte as duas abas situadas nos dois lados da tapa perfurante (peça cinza) e pressione a parte superior do cartucho até que fique em posição de bloqueio. Uma vez em posição de bloqueio, as abas têm que ficar ocultas. Não inverta o cartucho aberto. Deixe o cartucho repousar durante 5 minutos antes de carregá-lo no instrumento. Uma vez carregado o cartucho, o instrumento mistura seu conteúdo de forma automática em intervalos periódicos.
3 Precauções Os reagentes BIO-FLASH são para diagnóstico IN VITRO. Uso exclusivo para profissionais. Os componentes contêm azida sódica < 0,1%, Triton-X 100 (o tampão de ensaio), 8,0% de etilenoglicol (o traçador) e ProClin 950 (as micropartículas). Nocivo por ingestão (R 22). Em caso de ingestão, consultar imediatamente o médico e mostrar-lhe a embalagem ou o rótulo (S46). Nocivo para os organismos aquáticos, podendo causar efeitos nefastos a longo prazo no ambiente aquático (R52/53). A azida sódica pode reagir com encanamentos e ralos de chumbo ou cobre originando azidas metálicas altamente explosivas. Ao eliminar os restos de reagentes, fazê-lo em abundante volume de água. ATENÇÃO: MATERIAL DE RISCO BIOLÓGICO. Descartar todos os materiais usados em recipientes adequados para material bio-contaminante. Por favor, não reutilize nem reintroduza reagentes nos cartuchos ou frascos. Coleta e conservação das amostras Usar soro fresco (também se pode utilizar tubos com gel separador de soro) ou plasma (Li-heparina, Na-heparina, Na-citrato, EDTA e ACD). Outros anticoagulantes devem ser comprovados antes de utilizar-se. Os anticoagulantes líquidos como Na-citrato exercem um efeito de diluição e podem reduzir a concentração nas amostras dos pacientes. As amostras não devem ser inativadas por calor. As partículas em suspensão devem ser eliminadas por centrifugação. Nas diretrizes CLSI H18-A3 e H21-A5 encontrará mais informação sobre o manuseio, o transporte, o processamento e a conservação das amostras. Soro As amostras de soro podem ser conservadas a 2-8 C durante 8 dias. Para um período de tempo mais longo, devem ser congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20 C. As amostras podem ser congeladas/descongeladas no máximo 3 vezes. Misturá-las bem depois de descongelar. Comprove que não haja bolhas nas amostras e, em caso contrário, elimine-as todas antes da análise. Plasma As amostras de plasma podem ser conservadas a 2-8 C durante 8 dias. Para um período de tempo mais longo, devem ser congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20 C. Descongelar o plasma a 37 C. Descongelar as amostras somente uma vez. Misturá-las bem depois de descongelar. Comprove que não haja bolhas nas amostras e, em caso contrário, elimine-as todas antes da análise. Volume de amostra O volume de amostra necessário para realizar um único teste com BIO-FLASH Chagas varia em função do tipo de recipiente que se utilize. Um teste requer ao menos 10 µl mais o volume morto, que é de 200 µl se é utilizada a copa de amostra recomendado (REF ). Outros materiais Os seguintes materiais não são fornecidos com o cartucho de reagentes e devem ser comprados por separado. REF REF BIO-FLASH Chagas Calibrators (Calibradores) BIO-FLASH Chagas Controls (Controles) Leia com atenção as instruções correspondentes se deseja mais informação. Não utilize outros calibradores. A informação que necessita o instrumento BIO-FLASH para calibrar o ensaio BIO-FLASH Chagas está incluída nos códigos de barras dos tubos. Utilizar controles de outros fabricantes pode dar lugar a resultados imprevistos. Assegure-se de que no instrumento BIO-FLASH haja uma quantidade suficiente dos seguintes consumíveis antes de processar amostras, calibradores ou controles: REF BIO-FLASH Cuvettes (Cubetas) Nota: O desenho da cubeta está protegido por patente (US D560,816 / Desenho CE ) REF REF BIO-FLASH Triggers (Ativadores) BIO-FLASH System Rinse (Solução do sistema) Instrumento / procedimento do ensaio No Manual do Usuário do BIO-FLASH encontrará as instruções completas para realizar o ensaio.
4 Calibração O código de barras do cartucho contém uma Curva de Calibração Mestre (CCM) que é válida para o lote de reagentes. No entanto, para todos os reagentes se necessita uma Curva de Calibração de Trabalho (CCT), que é específica para cada lote e válida até a data de validade do lote. É preciso obter uma nova CCT quando os resultados dos controles saiam fora do intervalo de aceitação ou quando se tenha realizado ajustes no instrumento. Leia com atenção o Manual do Usuário do BIO-FLASH para configurar uma CCT. Controle de qualidade Para realizar um programa completo de controle de qualidade é recomendável passar dois controles. Os controles BIO-FLASH Chagas negativo e positivo foram desenhados para esse programa. Os controles devem ser analisados ao menos uma vez cada 24 horas por dia de utilização. Assegure-se de que os resultados dos controles se encontram dentro dos limites de aceitação já que, se não for assim, pode ser indicativo de resultados não válidos, ante os quais o usuário deverá tomar medidas corretivas. Nesse caso, verifique todos os resultados obtidos desde a última comprovação de controle de qualidade aceitável do analito em questão. Pode ser necessário recalibrar o instrumento. No Manual do Usuário do instrumento encontrará mais informação. Para identificação e resolução de situações anormais de controle de qualidade, consulte Westgard et al. 5 Conservação e estabilidade Os reagentes que não tenham sido abertos se mantêm estáveis até a data de validade indicada no rótulo do cartucho se forem conservados a 2-8 C em posição vertical. Uma vez aberto, a estabilidade do cartucho carregado no instrumento BIO-FLASH ou guardado a 2-8 C é de 14 semanas. Interpretação de resultados A quantidade de analito em cada amostra se determina a partir da luz emitida (URL), por interpolação na Curva de Calibração de Trabalho guardada. Os resultados obtidos com o BIO-FLASH Chagas são expressos em S/CO (Sinal da amostra/valor de corte). Como o ensaio é qualitativo, o valor numérico do resultado só é indicativo da quantidade de anticorpo presente. A determinação de anticorpos anti-trypanosoma cruzi utilizando o ensaio BIO-FLASH Chagas é interpretada como segue: As amostras com resultado < 0,90 S/CO são consideradas não reativas (negativas). As amostras com resultado 0,90 e < 1,00 S/CO são consideradas indeterminadas (zona cinza). As amostras com resultado 1,00 S/CO são consideradas reativas (positivas). Amostras com resultado inicialmente reativo ou indeterminado devem ser reanalisadas por duplicado. Se na repetição ambos os valores são inferiores a 0,90, a interpretação final do ensaio é de resultado negativo para anti- T. cruzi. Se algum dos resultados é positivo ou indeterminado, a amostra deve ser investigada com um teste suplementar para confirmar o resultado. Um resultado repetidamente positivo é indicativo de infecção pelo T. cruzi. Amostras com concentração de anti-t. cruzi acima de 400,00 S/CO são informadas como > 400,00 S/CO. Limitações O resultado de uma única amostra não é suficiente para diagnosticar a doença de Chagas. Portanto, os resultados do BIO-FLASH Chagas devem ser utilizados em conjunção com outros dados como, por exemplo, a sintomatologia, a historia clínica, os resultados de outras provas e toda a informação adicional relevante. Um resultado negativo não exclui a possibilidade de exposição ou infecção por T. cruzi. Como em todos os ensaios imunológicos sensíveis, existe a possibilidade de obter resultados positivos que não se repitam. Resultados esperados A doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, é endêmica na América Latina. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) estima-se que atualmente cerca de 10 milhões de pessoas estão infectadas com o T. cruzi, 25 milhões estão em risco de serem infectadas e mais de morrem a cada ano. As taxas de prevalência de anticorpos contra o T. cruzi variam muito nas diferentes áreas endêmicas. Em 2005, as taxas variaram desde 0,01% no Equador e 0,09% na Costa Rica, dois países que reportam os resultados obtidos utilizando testes confirmatórios, até 8,61% na Bolívia. As taxas de prevalência têm diminuindo ao longo do tempo em todos os países endêmicos. No entanto, devido à intensa mobilidade da população e à migração de pessoas para a Europa (principalmente Espanha e Portugal) e América do Norte, a doença de Chagas se espalhou e agora é global. 4 Características funcionais NOTA: Os dados a seguir são representativos; os resultados em experimentos isolados podem variar respeito a estes dados.
5 Especificidade A avaliação de especificidade foi baseada no teste de 6576 amostras de doadores de sangue incluindo soro e plasma-edta de dois bancos de sangue amostras eram do Banc de Sang i Teixits de Catalunya (Espanha), das quais 1000 eram de doadores originários de países endêmicos e 1799 eram de doadores não selecionados por país de origem amostras foram estudadas no Hemocentro Colsan de São Paulo (Brasil) com doadores de rotina. Além disso, foram também analisadas 300 amostras de soro não selecionadas, da rotina de um laboratório hospitalar em Barcelona (Espanha). As amostras repetidamente reativas foram reanalisadas usando dois métodos comerciais. A especificidade foi então calculada, obtendo-se os resultados mostrados na tabela seguinte: Amostras testadas Inicialmente reativas (IR) Repetidamente reativas (RR) RR Confirmadas positivas Especificidade n n n n % Doadores de países endêmicos (Banc de Sang i Teixits de Catalunya, Espanha) Doadores não selecionados (Banc de Sang i Teixits de Catalunya, Espanha) Doadores de sangue do Hemocentro Colsan de São Paulo (Brasil) Amostras de rotina laboratório hospitalar (Barcelona, Espanha) , , , ,0 Sensibilidade A sensibilidade foi comprovada em duas avaliações: amostras positivas para Chagas de diferentes Centros de Saúde de Barcelona, de pacientes originários de países endêmicos (Guatemala, Honduras, México, Nicarágua, Argentina, Bolívia e Brasil). - Um painel de 300 amostras, das quais 191 eram positivas e 109 eram negativas para anticorpos de Chagas foi avaliado no PNCQ (Programa Nacional de Controle de Qualidade, Rio de Janeiro, Brasil). As amostras eram originárias do Brasil e da Bolivia. Os resultados de sensibilidade são mostrados na tabela seguinte: Amostras analizadas Positivas Indeterminadas Negativas Sensibilidade n n n n % Primeira avaliação ,0 Segunda avaliação ,0 Precisão A precisão intra-ensaio e a total (ensaio a ensaio e dia a dia) foram avaliadas em múltiplos ensaios, conforme as diretrizes CLSI EP05-A2. Os resultados estão resumidos na tabela seguinte: Média (S/CO) Intra-ensaio Total Controle negativo 0,30 0,01 SD 0,01 SD Controle positivo 2,86 2,5% CV 3,1% CV Amostra negativa 0,48 0,02 SD 0,04 SD Amostra próxima do valor de corte 0,85 5,7% CV 7,4% CV Amostra positiva 3,99 3,7% CV 3,9% CV
6 Reprodutibilidade A repetibilidade entre lotes e entre instrumentos foi avaliada utilizando-se 50 amostras. Os resultados estão resumidos na tabela seguinte: Pendente Intersecção R N Valor IC de 95% Valor IC de 95% Valor IC de 95% Lote 2 vs. Lote ,943 0,927 a 0,959-0,242-0,658 a -0,075 0,998 0,997 a 0,999 Instrumento 2 vs. Instrumento ,041 1,027 a 1,053 0,012-0,010 a -0,604 0,999 0,998 a 0,999 Interferências Estudos conduzidos segundo as diretrizes CLSI EP7-A demonstraram que os resultados do BIO-FLASH Chagas não são afetados pelas seguintes substâncias potencialmente interferentes: Substância potencialmente interferente Concentração % Interferência Hemoglobina 500 mg/dl 10 Bilirrubina indireta 18 mg/dl 10 Bilirrubina direta 18 mg/dl 10 Triglicérides 1300 mg/dl 10 Fator reumatóide 800 UI/mL 10 Reatividade cruzada Foram analisadas com o ensaio BIO-FLASH Chagas 150 amostras positivas para condições que potencialmente poderiam produzir reação cruzada. Considera-se que ocorre uma reação cruzada quando o diagnóstico muda de positivo a negativo ou vice-versa. As amostras reativas foram comparadas com um ensaio de referência para o qual não foi observada reação cruzada com as substâncias potencialmente interferentes. Os resultados estão resumidos na tabela seguinte: Reação cruzada potencial Concordância ANA (anticorpos antinucleares) 15/15 anti-hcv (vírus da hepatite C) 15/15 anti-e.coli 10/10 anti-htlv (vírus linfotrópico T humano) 15/15 anti-hbc (anticorpos contra o antígeno core da hepatite B) 14/15 anti-hiv-1 (vírus da imunodeficiência humana) 15/15 Malária 24/24 Leishmania 10/11 Sífilis 15/15 Crithidia lucilliae 14/15 Sensibilidade analítica A sensibilidade analítica obtida foi < 0,20 UI/mL. A mesma foi determinada por interpolação do valor de corte do ensaio na reta de regressão obtida ao analisar diluições seriadas do 1º padrão internacional da OMS para anticorpos de Chagas (TcII) em plasma humano (NIBSC referência: 09/186) e do 1º padrão internacional da OMS para anticorpos de Chagas (TcI) em plasma humano (NIBSC referência: 09/188). Os resultados obtidos, utilizando dois lotes diferentes de reagentes, foram 0,13 e 0,14 UI/mL, respectivamente.
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