AÇÃO HEMATOTÓXICA DO SULFATO DE VINCRISTINA SOBRE A CELULARIDADE SANGÜÍNEA CENTRAL E PERIFÉRICA EM CÃES

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1 ARS VETERINARIA, Jaboticabal, SP, Vol. 20, nº 2, , ISSN AÇÃO HEMATOTÓXICA DO SULFATO DE VINCRISTINA SOBRE A CELULARIDADE SANGÜÍNEA CENTRAL E PERIFÉRICA EM CÃES (HEMATOTOXIC ACTION OF VINCRISTINE SULPHATE ON THE PERIPHERAL AND CENTRAL BLOOD CELLULARITY IN DOGS) (ACCIÓN HEMATOTÓXICA DEL SULFATO DE VINCRISTINA SOBRE LA CELULARIDAD SANGUÍNEA CENTRAL Y PERIFÉRICA EN CANINOS) M. F. R. SOBREIRA 1 ; A. E. SANTANA 2 ; M. A. DIAS 1 ; L. F. R. SOBREIRA 3 ; F. G. V. GAMA 4 ; P. P. V. DINIZ 5 RESUMO No presente estudo foi utilizado o sulfato de vincristina, um agente antineoplásico amplamente empregado no tratamento de tumores de células redondas, cuja ação citostática não seletiva pode induzir a um estado de anemia aplástica, impedindo a formação de um fuso mitótico funcional e interrompendo, assim, a proliferação celular na metáfase. O referido estudo teve como escopo principal avaliar os efeitos hematotóxicos do sulfato de vincristina, em cães sadios. Para tanto, dez cães adultos, sem raça definida, machos ou fêmeas e clinicamente sadios foram divididos em dois grupos de tratamento que receberam oito aplicações, a intervalos semanais, de dois diferentes níveis de dosagens de sulfato de vincristina: grupo T1 (0,010mg/kg de peso corporal) e grupo T2 (0,025mg/kg de peso corporal). O estudo do quadro hematológico periférico deu-se a cada 7 dias e do quadro hematológico central, no final de cada uma das três etapas experimentais, assim caracterizadas: etapa 1 obtenção dos valores controle (M0), etapa 2 aplicação da droga (M1) e etapa 3 avaliação da reversibilidade das alterações durante 35 dias (M2). Os resultados obtidos, sob as condições experimentais testadas, revelam que houve alterações hematológicas, central e periférica, especialmente nos animais submetidos à maior dosagem de vincristina (0,025mg/kg de PC), evidenciando, portanto, que a droga tem ação hematotóxica. Além disso, que a menor dosagem empregada (0,010mg/kg de PC) foi capaz de estimular a atividade trombopoética, quando em dosagem única ou em duas aplicações. As alterações hematológicas induzidas pela administração de vincristina revelam-se dose e tempo dependentes e de caráter reversível. PALAVRAS-CHAVE: Sulfato de vincristina. Cães. Hematotoxicidade. SUMMARY Several cytostatic drugs used in the therapy of neoplasias, such as busulphan, doxorubicin, vincristine sulphate (VCR) and methotrexate, have also been employed as causal agent for bone marrow aplasia models. All of these drugs are characterized by an extraordinary non-seletive cytostatic effect. Their cytopenic actions can be pointed out with relation to the rapid renewal cell system such as the hematopoietic and epithelial tissues. In the present study, VCR, antineoplastic 1 Médica Veterinária - Doutoranda - Unesp Jaboticabal - Via de acesso Prof. Paulo Donato Castellane, km 5 - DCCV - Jaboticabal (SP) - CEP Médico Veterinário - Prof. Adjunto - Unesp Jaboticabal 3 Médica Veterinária - Prof. Doutora - Centro Universitário Moura Lacerda. 4 Médica Veterinária - Mestranda - Unesp Jaboticabal 5 Médico Veterinário - Residente Unesp Jaboticabal 169

2 agent used in the treatment of round cell tumors, was used aiming at evaluating its cytostatic action, by monitoring central and peripheral blood celularity. For such healthy mongrel adults dogs were divided into two treatment groups of five animals, which were treated with eigth applications of two different levels of VCR, at weekly intervals: Group T1 (0.010 mg/ kg of weight) and Group T2 (0.025 mg/kg of weight). Studies of erythroid, leukocytic and thrombometric parameters from peripheral and central levels were carried out. The results obtained for the peripheral and central features, under the tested experimental conditions, showed that VCR produced hematotoxic effects in animals treated with the higher dose (0.025 mg/ kg). The lower dose of VCR (0.010 mg/kg) showed efficiency in the stimulation of thrombopoiesis, after one or two applications. At least, 35 days after the discontinuation of the injections of VCR the average values obtained for the hematological parameters reached basal levels, attesting the reversibility of the hematotoxic effects of the used cytostatic drug. KEY-WORDS: Vincristine sulphate. Dogs. Hematotoxicity. RESUMEN En el presente estudio fue utilizado el sulfato de vincristina, un agente antineoplásico ampliamente empleado en el tratamiento de tumores de células redondas, cuya acción citostática no selectiva pode inducir un estado de anemia aplástica, impidiendo la formación de un huso mitótico funcional e interrumpiendo la proliferación celular en la metafase. O objetivo principal del estudio fue evaluar los efectos hematotóxicos del sulfato de vincristina en perros sanos. Para tal fin, diez perros adultos, mestizos, machos o hembras y clínicamente sanos, fueron distribuidos en dos grupos de tratamiento, que recibieron ocho aplicaciones, con intervalos semanales, de dos dosis diferentes de sulfato de vincristina: grupo T1 (0,010 mg/kg de peso corporal) y grupo T2 (0,025 mg/kg de peso corporal). El estudio del cuadro hematológico periférico fue realizado a cada 7 días y el del cuadro hematológico central al final de cada una de las tres etapas experimentales caracterizadas de la siguiente manera: etapa 1- obtención de los valores control (M0), etapa 2- aplicación del fármaco (M1) y etapa 3- evaluación de la reversibilidad de las alteraciones durante 35 días (M2). Los resultados obtenidos con las condiciones experimentales testadas revelan que hubo alteraciones hematológicas centrales y periféricas, especialmente en los animales sometidos a la dosis mayor de vincristina (0,025 mg/kg). De esta forma se evidenció que el fármaco tiene acción hematotóxica y, adicionalmente, que la menor dosis usada (0,010 mg/kg) fue capaz de estimular la actividad trombopoyética, cuando usada en dosis única o en dos aplicaciones. Las alteraciones hematológicas inducidas por la administración de vincristina se revelaron dosis y tiempo dependientes y de carácter reversible. PALABRAS CLAVE: Sulfato de vincristina. Perros. Hematotoxicidad. INTRODUÇÃO Uma contribuição importante para o desenvolvimento da hematologia veterinária vem sendo obtida pelo estudo dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos nos distúrbios hematológicos, como anemia aplástica, mielofibrose e leucemias. Sabe-se que tais mecanismos estão relacionados com lesão das célulastronco (ou stem cells) hematopoéticas e/ou do microambiente hematopoético indutivo (SANTANA, 1988). Recentemente, várias drogas citostáticas utilizadas na terapia de diferentes modalidades de neoplasias, como busulfan, doxorubicina, sulfato de vincristina e o metotrexato, entre outras, estão sendo empregadas em modelos de hipoplasia sangüínea quimicamente induzida (SANTANA, 1988; DIAS, 1998). Tais drogas são caracterizadas por apresentarem um extraordinário efeito citostático não seletivo, sendo que suas ações citopênicas ocorrem principalmente nos chamados sistemas celulares de renovação rápida, como o hematopoético, espermatogênico e tecido epitelial. O sulfato de vincristina, alcalóide derivado da planta Vinca rosea, é amplamente utilizado como droga citostática e atua em células que se encontram no ciclo celular, interrompendo sua divisão mitótica na metáfase através da dissolução do fuso mitótico (ROSENTHAL, 1981). Clinicamente, o sulfato de vincristina possui um amplo espectro de ação e induz poucas alterações na medula óssea, sendo a trombocitose um dos seus importantes efeitos (MADEL et al., 1977; WOLF, 1983). Por outro lado, MORSE e STOHLMAN (1960) mostraram o efeito supressivo da referida droga mais evidenciado 170

3 nas populações de células eritróides do que em granulócitos e no sistema megacariocitário. A dosagem, o intervalo entre as aplicações e o tempo de exposição à vincristina são fatores importantes em relação à ocorrência de efeitos citopênicos indesejáveis, que podem repercutir desfavoravelmente em sistemas celulares de renovação rápida. CAMACHO e LAUS (1987) relatam a não ocorrência de diferenças significativas entre os valores médios de eritrogramas em cães portadores de tumor venéreo transmissível (TVT), considerando-se as fases de pré e pós-tratamento com monoquimioterapia de vincristina (0,025 mg/kg de peso corpóreo), semanalmente, durante quatro semanas. Os referidos autores verificaram diminuição dos valores absolutos de leucócitos decorrente de neutropenia no pré-tratamento e na quarta aplicação, porém ainda dentro dos limites fisiológicos normais. Por outro lado, a administração intravenosa (IV) de vincristina, 0,025 mg/kg de peso corpóreo, induziu alterações citológicas mais notáveis, especialmente em relação à linhagem de células eritróides (DINESH et al, 1993). Tais anormalidades incluíam aumento no número de células em mitose (primariamente na metáfase), configurações nucleares anormais e núcleos fragmentados. Além disso, 12 a 24 horas após o tratamento, a relação M:E (mielóide:eritróide) estava aumentada, cujo aumento atribui-se à diminuição no número de células eritróides (ALLEMAN & HARVEY, 1993). De acordo com O keefe e Harris (1990), doses mais elevadas de vincristina (0,06mg/ kg de peso corpóreo), em cães, levam ao aparecimento de anemia, leucopenia e elevação das atividades séricas das transaminases. Doses de 0,75mg/m 2 induzem a ocorrência de mielossupressão que declina em quatro dias. O regime terapêutico fundamentado em dosagens pequenas e repetidas de vincristina, a intervalos de nove dias, geralmente não causa danos às células hemopoéticas e permite sua regeneração e repovoamento (RICCARDI et al., 1980; RICCARDI et al., 1981). Deste ponto de vista, considerando-se que as diferentes linhagens de células sangüíneas constituem sistemas celulares de renovação rápida (turnover acelerado) e considerando-se, de outra parte, que a extensa família de drogas antineoplásicas (inclusive a vincristina) exerce seus efeitos citostáticos de forma não seletiva, os diferentes estágios desenvolvimentais replicantes e não replicantes, das linhagens celulares leucocitária, plaquetária e eritrocitária podem ser reversível ou irreversivelmente lesados pela ação das drogas antineoplásicas. Em decorrência do fato da magnitude do efeito citostático da vincristina ser proporcional à atividade proliferativa celular, os eritroblastos são mais afetados do que as células mielóides e linfóides medulares (FREI et al., 1964, RICCARDI et al., 1980; RICCARDI et al., 1981). Deve ser relembrado que o grau de mielossupressão é afetado por vários fatores, mas está diretamente relacionado a dose empregada, bem como tempo de exposição à droga. A vincristina, geralmente, não causa mielossupressão irreversível quando usada em doses terapêuticas (DINESH et al, 1993), pois as células-tronco pluripotenciais encontram-se na fase de repouso (G 0 ), fora do ciclo celular, protegidas da ação citotóxica da vincristina, assim, o recrutamento de tais células para dentro do ciclo celular permite o repovoamento da medula óssea após a suspensão da quimioterapia (O KEEFE & HARRIS, 1990). Ademais, o estado geral de cada paciente pode, também, influenciar o grau de mielossupressão. Dessa forma, animais submetidos a protocolos quimioterápicos prévios, ou aqueles com neoplasias envolvendo a medula óssea, podem desenvolver citopenias mais graves em resposta a terapia anticâncer com vincristina. Além disso, a incapacidade funcional e metabólica do paciente, com conseqüente retardo na metabolização e excreção da droga, podem, também, aumentar a sua ação tóxica geral TABELA 1 Valores médios obtidos para eritrócitos, hemoglobina, hematócrito e plaquetas em cães expostos a diferentes doses de sulfato de vincristina (T1: 0,010mg/kg and T2: 0,025mg/kg), em oito aplicações a intervalos semanais. Jaboticabal (SP) M0: Valores médios obtidos no período controle -M1: Valores médios obtidos no período de administração da droga -M2: Valores médios obtidos no período de avaliação da reversibilidade das alterações (1): médias de uma mesma coluna seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem entre si (p< 0,05).

4 TABELA 2 Valores médios obtidos para leucócitos, neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos em cães expostos a diferentes doses de sulfato de vincristina (T1: 0,010mg/kg and T2: 0,025mg/kg), em oito aplicações a intervalos semanais. Jaboticabal (SP). -M0: Valores médios obtidos no período controle -M1: Valores médios obtidos no período de administração da droga -M2: Valores médios obtidos no período de avaliação da reversibilidade das alterações (1): médias de uma mesma coluna seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem entre si (p< 0,05). TABELA 3 Valores médios dos parâmetros do mielograma obtidos em cães expostos a diferentes doses de sulfato de vincristina (T1: 0,010mg/kg and T2: 0,025mg/kg), em oito aplicações a intervalos semanais. Jaboticabal (SP). -M0: Valores médios obtidos no período controle -M1: Valores médios obtidos no período de administração da droga -M2: Valores médios obtidos no período de avaliação da reversibilidade das alterações (1): médias de uma mesma coluna seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem entre si (p< 0,05). (O KEEFE & HARRIS, 1990). No presente estudo, o sulfato de vincristina foi empregado com o objetivo principal de avaliar seus efeitos citostáticos nos elementos figurados do sangue. MATERIAL E MÉTODOS Para tanto, dez cães adultos, sem raça definida, machos ou fêmeas, com peso médio de 10kg e clinicamente sadios foram divididos em dois grupos de tratamento, que receberam oito aplicações, a intervalos semanais, de dois diferentes níveis de dosagens de sulfato de vincristina: Grupo T1 (0,010 mg/kg de peso corporal - PC) e Grupo T2 (0,025 mg/kg de PC). O estudo do quadro hematológico periférico (hemograma e plaquetograma) deu-se a cada sete dias, sendo as amostras obtidas por punção da veia jugular, envasadas em frasco plástico contendo EDTA (hemograma) ou citrato de sódio a 3,8% (plaquetograma) e processadas logo após a colheita em contador automático de células. Já as amostras de material medular foram obtidas por punção biópsia aspirativa de crista ilíaca sob anestesia geral de curta duração. Posteriormente, foram confeccionados esfregaços de material medular e corados com corante May-Grunwald-Giemsa. Assim, a avaliação do quadro hematológico central (mielograma) foi realizada no final de cada uma das três etapas experimentais, assim caracterizadas: etapa 1 obtenção dos valores controle com duração de 35 dias (M0-média de seis colheitas), etapa 2 aplicação da droga (M1- média de sete aplicações) e etapa 3 avaliação da reversibilidade das alterações (M2 - média de seis colheitas). Os resultados obtidos para as diferentes características estudadas e para os diferentes grupos de tratamento foram analisados estatisticamente de acordo com o delineamento em parcelas subdivididas, considerando-se como tratamentos principais os níveis de dosagem e como tratamentos secundários os momentos de colheita. As médias consideradas estatisticamente significativas pelo teste F foram então comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade (PIMENTEL GOMES, 1987). 172

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos para os parâmetros eritrocitários, leucocitários e trombométricos estão configurados nas Tabelas 1 e 2 e aqueles obtidos para o mielograma, na Tabela 3, a seguir. Os achados, periféricos e centrais, obtidos no presente experimento para a série eritrocitária revelam que o sulfato de vincristina induz a diminuição da proliferação celular da linhagem eritróide, mais evidente no grupo T2, observada pelos valores médios obtidos para a contagem global de eritrócitos, teor de hemoglobina e PCV (p<0,05) que foram inferiores àqueles do momento controle (M0), confirmando os achados de MORSE e STOHLMAN (1960), FREI et al. (1964), ALLEMAN e HARVEY (1993) e DINESH et al. (1993) e, por outro lado, contrariando aqueles de CAMACHO e LAUS (1987), que não observaram diferenças significativas nos valores médios dos eritrogramas após a utilização da referida droga em cães com TVT. A significante redução dos parâmetros eritrocitários nos referidos animais reflete um estado de anemia hipoplástica, confirmado pela hipocelularidade relacionada aos estádios evolutivos dos compartimentos eritróides medulares (eritroblasto basofílico e policromatofílico) no grupo T2. Por outro lado, com relação à série leucocitária, verifica-se que houve uma diminuição estatisticamente significativa (p<0,05) nas contagens globais de leucócitos, mais acentuada no grupo T2, mas os achados referentes aos precursores granulocitários medulares revelam uma supressão reversível da atividade granulopoética. Tais observações corroboram com aquelas relatadas por CAMACHO e LAUS (1987) que verificaram diminuição dos valores absolutos de leucócitos decorrente de neutropenia no pré-tratamento e na quarta aplicação. Os resultados obtidos no presente estudo confirmam a ação distinta da VCR nos elementos do eixo megacariócito-plaquetário relacionada à alteração quantitativa de plaquetas. Como pode ser observado, a VCR induz diminuição tanto de plaquetas como de megacariócitos. Tais achados supressores da megacariocitopoiese, concordam com os relatos de CAMACHO et al. (1992) e WOLF (1983). Conforme nossos resultados, a trombocitopenia induzida parece estar relacionada a uma ação direta do fármaco em plaquetas e megacariócitos. Dessa forma, podemos sugerir que a trombocitopenia induzida pela VCR pode ser devida a dois processos, por toxicidade direta em plaquetas circulantes, diminuindo seu tempo de sobrevivência, e por diminuição da produção plaquetária decorrente da ação da VCR em megacariócitos, induzindo megacariocitopenia. Como pode ser observado na Tabela 3, os valores encontrados para a relação M:E mostraram-se significativamente aumentados no grupo T2, decorrente de uma supressão mais acentuada da eritropoese e não do aumento das células mielóides, achado este também relatado por ALLEMAN e HARVEY (1993). É importante ressaltar que as alterações quantitativas induzidas pela VCR nos elementos figurados do sangue são reversíveis, como pode ser verificado nos resultados apresentados. A recuperação aos números iniciais provavelmente deveu-se ao repovoamento medular por precursores que se encontravam fora do ciclo celular e que, provavelmente, foram pouco afetados pela VCR. Segundo O KEEFE e HARRIS (1990) as célulastronco pluripotenciais encontram-se protegidas da ação citostática da VCR por estarem fora do ciclo celular. Com o repovoamento medular das linhagens celulares, há um conseqüente restabelecimento da hematopoiese e do volume dos elementos circulantes. CONCLUSÕES O sulfato de vincristina produz efeitos citostáticos nos elementos figurados do sangue dose-dependentes que se mostram reversíveis após a suspensão da droga. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a CAPES e a FAPESP pelo auxílio financeiro e ao Hospital Veterinário Governador Laudo Natel da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária (FCAVJ UNESP), em especial ao Laboratório de Patologia Clínica Prof. Dr. Joaquim Ferreira Neto, pelo auxílio técnico essencial e pela cessão das instalações. ARTIGO RECEBIDO: Julho/2002 APROVADO: Novembro/2003 REFERÊNCIAS ALLEMAN, A.R.; HARVEY, J.W. The morphologic effects of vincristine sulfate on canine bone marrow cells. Veterinary Clinical Pathology, v.22, n.2, p , CAMACHO, A.A.; LAUS, J.L. Estudo sobre a eficiência da Vincristina no tratamento de cães com tumor venéreo transmissível. Ars Veterinaria, v.3, n.1, p.37-42,

6 DIAS, M.A. Estudo de um modelo animal de hipoplasia sangüínea induzida pelo agente antineoplásico doxorubicina (AdriblastinaÒ). Jaboticabal, SP p. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista. DINESH, N.M., FORST, D.; CRAMER, R. Effect of vincristine sulphate on canine transmissible veneral tumours - haematological and biochemical studies. Indian Veterinary Journal, v.70, n.8, p , FREI, E. 3rd; WHANG, J.; SCOGGINS, R. B.; VANSCOTT, E. J.; RALL, D. P. The stathmokinetic effect of vincristine. Cancer Research, v.24, p , MADEL, M.; BESSLER, H.; DJALDETTI, M. Effect of low dose vincristine on platelet production in mice. Experimental Hematology, v.5, p , MORSE, B.S.; STOHLMAN, F. Jr. Regulation of the erythropoiesis XVIII. The effect of vincristine and erythropoietin on bone marrow. Journal of Clinical Investigation, v.45, p , O KEEFE, D.A.; HARRIS, C.L. Toxicology of oncologic drugs. Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice, v.20, n.2, p , PIMENTEL GOMES, F. Curso de estatística experimental. 12 ed. São Paulo: Livraria Nobel S.A., p. RICCARDI, A.; MONTECUCCO, C. M.; CRESCI, R.; TRAVERSI, E.; PERUGINI, S. Effect of Vincristine on the Bone Marrow Cells of patients with multiple myeloma: a cytomorphologic study. Tumori, v.66, p , RICCARDI, A.; MARTINOTTI, A.; MONTECUCCO, C. M.; MAZZINI, G.; GIORDANO, P. Effect of Vincristine on Bone Marrow Cells of patients with multiple myeloma: a cytokinetic study. Virchows Archieves B. Cell Pathology., v.35, p , ROSENTHAL, R.C. Clinical applications of Vinca alkaloids. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.179, n. 11, p , SANTANA, A.E. Benzenismo experimental: desenvolvimento da medula óssea ectópica. Ribeirão Preto, SP p. Tese (Doutorado) Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. WOLF, A.M. Vincristine therapy of chronic thrombocytopenia in the dog. Southwestern Veterinarian, v.35, n.3, p ,