Palavras-chave: Icterícia neonatal; icterícia neonatal, diagnóstico; hiperbilirrubinemia, prevenção e controle.

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1 Artigo Original Avaliação da variabilidade da dosagem transcutânea de bilirrubina pelo Bilicheck em neonatos Evaluation of variability in transcutaneous dosage of bilirubin by Bilicheck in newborn infants Fernando Perazzini Facchini 1 Resumo Objetivo: Determinar e comparar os coeficientes de variação das dosagens de bilirrubinemia transcutânea realizadas com o Bilicheck, com ou sem a troca da sua cápsula de calibração (Bilical ), com os coeficientes de variação das dosagens de bilirrubina pelo bilirrubinômetro Unistat-Leica, tomados como referência. Métodos: Estudo descritivo e comparativo dos coeficientes de variação de dosagens de bilirrubina por três métodos (Bilicheck, com e sem troca do Bilical, e bilirrubinômetro Unistat-Leica ), em diferentes faixas de bilirrubinemia. Os dados obtidos foram avaliados por análise de variância para medidas repetidas, teste de comparações múltiplas de Tukey, teste de perfil por contrastes e por análise de variância simples. Resultados: Os coeficientes de variação, com e sem troca do Bilical, foram significativamente maiores do que os obtidos com as dosagens feitas com o bilirrubinômetro. Não houve diferença significativa entre os coeficientes de variação com e sem troca do Bilical. Conclusões: A variabilidade das dosagens de bilirrubina pelo Bilicheck sugere que este equipamento seja usado apenas como método de rastreamento da bilirrubinemia indireta. A reutilização das cápsulas Bilical não altera a variabilidade. Seu reaproveitamento permite baixar substancialmente o custo da triagem transcutânea de hiperbilirrubinemia indireta no período neonatal. Palavras-chave: Icterícia neonatal; icterícia neonatal, diagnóstico; hiperbilirrubinemia, prevenção e controle. Abstract Objective: To get and compare the coefficients of variation of transcutaneous bilirubin levels verified by a non-invasive bilirubin analyzer (BiliCheck ) with and without calibration capsules (BiliCal ) and the coefficients of variation obtained by the Unistat-Leica bilirubinometer, used as reference. Methods: This descriptive and comparative study of coefficients of variation of bilirubin tests was carried out with three different methods (BiliCheck with and without BiliCal change and Unistat-Leica bilirubinometer) in different bilirubinemia ranges. Data were analyzed using analyses of variance for repetitive measures, Tukey multiple comparison test, contrast profile test and simple analysis of variance. Results: The coefficients of variation with and without the change of BiliCal were significantly higher than those obtained with the bilirubinometer. No significant difference was noted in the coefficients of variability with and without the change of the calibration capsules. Conclusions: BiliCheck variability suggests that this method should be used only to screen hyperbilirubinemia in jaundiced neonates. The reutilization of the BiliCal capsules does not alter the variability of the measures. Their reuse reduces the cost of the exam. Key-words: Neonatal jaundice; neonatal jaundice, diagnosis; hyperbilirubinemia, prevention and control. 1 Professor-doutor-assistente do Departamento de Pediatria da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) Endereço para correspondência Fernando P. Facchini Rua Coronel Quirino 910, apto. 101 CEP Campinas (SP) Recebido em: 9/11/200 Aceito em: 2/3/2006 Rev Paul Pediatria 2006;24(2):

2 Avaliação da variabilidade da dosagem transcutânea de bilirrubina pelo Bilicheck em neonatos Introdução As dosagens de bilirrubina são, sem sombra de dúvida, os exames subsidiários mais utilizados nos serviços de neonatologia em todo o mundo. No entanto, a dificuldade de adotar padrões adequados de calibração e a variabilidade intrínseca de equipamentos e métodos fazem com que estas dosagens sejam objeto de permanente preocupação em tais serviços (1), dificultando a troca de informações entre os mesmos. Além disso, as dosagens invasivas demandam coleta de sangue, com uma série de inconvenientes como dificuldade técnica, espoliação de sangue, possibilidade de infecção, demora na obtenção de resultados e desconforto provocado pela dor. No início da década de 1980, surgiu, no campo da Neonatologia, a possibilidade de se realizarem dosagens não invasivas, transcutâneas e que contornariam os inconvenientes acima relatados. O primeiro equipamento desenvolvido, o Minolta Bilirubinometer (Minolta Camera Co, Japan) (2), avaliava apenas a cor amarela da pele, sofrendo interferência de uma série de fatores, como a quantidade de melanina, de hemoglobina e tecido conjuntivo. Tais substâncias absorvem energia na mesma faixa da bilirrubina, falseando os resultados. A hemoglobina circula através dos capilares cutâneos e varia com a hemoglobinemia dos recém-natos. A quantidade de melanina e de tecido conjuntivo varia em função da raça e da idade gestacional dos pacientes. Outros aparelhos foram subsequëntemente desenvolvidos, como o Chromatics Colormate III (Chromatics Color Sciences International Inc. New York, NY) (3) e o Bilicheck (SpectRx Inc, Norcross, GA), cuja concepção (4) anularia a interferência dos fatores anteriormente citados e permitiria, segundo alguns autores (4,), obter resultados equiparáveis à dosagem obtida com a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), considerada o padrão-ouro das dosagens de bilirrubina. Entretanto, não foi possível encontrar na literatura científica qualquer trabalho que houvesse avaliado a variabilidade intrínseca dos métodos laboratoriais recomendados (6). Os fabricantes do Bilicheck determinam que a cada nova dosagem seja usada uma nova cápsula de calibração (Bilical ). Tal procedimento torna a dosagem dispendiosa, visto o valor de US$,40 de cada cápsula, em nosso meio. O fabricante informa que a não substituição a cada nova dosagem pode levar a testes inexatos. Existe, entretanto, na literatura, relato de que a reutilização da cápsula é possível (7), sem comprometimento dos resultados. Desta forma, os objetivos do presente estudo foram: Estabelecer a variabilidade intrínseca das dosagens de bilirrubina transcutânea (Bilicheck ), em três níveis de bilirrubinemia. Comparar a variabilidade das dosagens de bilirrubina feitas pelo Bilicheck e pelo bilirrubinômetro. Determinar se a reutilização das cápsulas de calibração do Bilicheck ocasiona modificações significativas na variabilidade das dosagens. Métodos O estudo foi realizado em recém-nascidos, em alojamento conjunto, nascidos no Serviço de Neonatologia do CAISM/ Unicamp, tendo sido aprovado pelas Comissões de Pesquisa e Ética em Pesquisa do referido hospital. Trata-se de investigação descritiva e comparativa (os grupos foram avaliados em três níveis de bilirrubinemia progressivamente maiores). Foram selecionados 1 neonatos com valores de bilirrubinemia total previamente conhecidos, obtidos pelo bilirrubinômetro Leica, sendo cinco pacientes com hiperbilirrubinemia compatível com cada faixa de bilirrubinemia selecionada ( a <10, 10 a 1 e >1 mg/dl). A finalidade de adotar três diferentes faixas de bilirrubinemia foi verificar se a variabilidade das medidas obtidas com os diferentes métodos poderia sofrer influência dos vários níveis do pigmento. Os recém-nascidos participantes do presente trabalho foram escolhidos aleatoriamente, desde que se enquadrassem nos níveis previamente definidos e com a concordância explicita de seu responsável. Cada recém-nascido foi submetido à dosagem transcutânea por 1 vezes (6) na região frontal, trocando-se as cápsulas calibradoras a cada dosagem. A seguir, foram feitas mais 1 avaliações com o mesmo Bilical. As dosagens foram efetuadas de forma seqüencial, com intervalo suficiente para recalibrar o aparelho (aproximadamente 10 segundos). A calibração do Bilicheck foi efetuada conforme as recomendações do fabricante. Cada dosagem demandou cerca de 20 segundos para ser completada. A variabilidade das dosagens obtidas com o Bilicheck, com e sem a troca do Bilical, foram comparadas com a obtida por meio do equipamento em uso no serviço, o Bilirrubinômetro Unistat-Leica (Leica Inc., Buffalo NY, USA). Para testar este último, foram preparadas amostras com valores de bilirrubina situados entre e <10, 10 e 1 e >1 mg/dl, a partir de um soro-padrão elaborado de acordo com as normas estabelecidas pelo Comitê Conjunto das Agências de Saúde Americanas e pela Aca- 10 Rev Paul Pediatria 2006;24(2):149-4.

3 Fernando Perazzini Facchini demia Americana de Pediatria, em 1962 (8). A escolha pela solução padrão deveu-se a: Caso fossem feitas as 1 dosagens em sangue de recémnascido, seria necessário um volume razoável de sangue, levando à dificuldade de obtenção (punção venosa), espoliação e desconforto. A composição da solução-padrão é quimicamente igual ao plasma dos recém-nascidos ictéricos, uma vez que é preparada com plasma de recém-nascidos, com ajuste de ph e concentração protéica e usa bilirrubina pró-análise, com pureza previamente testada (9). A solução-padrão é utilizada em métodos de laboratório como referência de equivalência com as amostras de plasma e as possíveis interferências com o método são idênticas no padrão e na amostra. Segundo planejado, foram feitas 1 dosagens sucessivas com a mesma amostra (recém-nascido ou solução-padrão), para permitir calcular de forma adequada o desvio padrão, a média aritmética das dosagens e, finalmente, a variabilidade de cada método [quociente de variação=desvio-padrão / média aritmética das dosagens] (6). Para descrever os valores obtidos em cada método e em cada faixa de bilirrubinemia, foram usadas técnicas estatísticas descritivas (com medidas de posição e dispersão) dos valores de bilirrubina, assim como o coeficiente de variação intra-indivíduo (entre as 1 dosagens de cada amostra). Para analisar a variabilidade intra-indivíduo das medidas de bilirrubina e para comparar os valores obtidos com os três métodos, foi utilizada a análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas. Para identificar as diferenças dos valores obtidos com os métodos foi aplicado o teste de comparações múltiplas de Tukey e para analisar a variabilidade entre as medidas intra-indivíduo, foi empregado o teste de perfil por contrastes. Foram feitas análises separadas para cada uma das três faixas definidas (-10 mg/dl; 10-1 mg/dl; 1 mg/dl). Finalmente, para comparar os coeficientes de variação entre os métodos, foi utilizada a análise de variância simples (ANOVA Oneway), com transformação por ranks/postos. O nível de significância adotado para os testes estatísticos foi de %, ou seja, p 0,0. Resultados A estatística descritiva dos valores médios e dos coeficientes de variação das dosagens de bilirrubina para cada método é mostrada nas Tabelas 1 e 2. Para visualizar a variabilidade das medidas segundo o método, para cada faixa de bilirrubinemia, foram elaborados desenhos esquemáticos (boxplots Figura 1). Para nenhuma das faixas de bilirrubinemia houve diferença significante dos coeficientes de variação entre as 1 medidas. Os resultados pela ANOVA simples nos postos para comparar os coeficientes de variação entre os três métodos são apresentados na Tabela 3. Em todas as faixas de bilirrubinemia, encontraram-se diferenças significantes. Os coeficientes de variação com e sem troca do Bilical foram maiores em relação ao padrão e não houve diferença entre os coeficientes com e sem troca do Bilical. Usando o método ANOVA Oneway, calculou-se o poder do teste para cada faixa de medida da bilirrubinemia (9,10). O poder do Tabela 1 Análise descritiva dos valores médios das 1 medidas de bilirrubina por grupo Bilirrubinemia Grupo Número Média DP Mínima Mediana Máxima >1 mg/dl Padrão 17,24 0,26 16,87 17,28 17,1 C/Troca 16,87 0,60 16,23 17,02 17,61 S/Troca 18,0 1,30 1,88 18,2 19, mg/dl Padrão 11,69 0,12 11,9 11,6 11,89 C/Troca 13,34 1,8 11,0 13,06 1,4 S/Troca 13,46 2,04 11,13 13,93 1,82-10 mg/dl Padrão 6,80 0,10 6,66 6,79 6,93 C/Troca 9,40 1,22 8,34 9,12 11,49 S/Troca 9,72 1,6 7,87 9,23 11,1 Padrão: solução de bilirrubina em plasma de RN, obtida a partir de uma solução usada como teste de confiabilidade do bilirrubinômetro C/Troca: resultado obtido por 1 dosagens sucessivas realizadas no mesmo recém-nascido, trocando-se o Bilical a cada nova dosagem S/Troca: resultado de 1 dosagens sucessivas realizadas no mesmo recém-nascido utilizando o mesmo Bilical em todas as dosagens Rev Paul Pediatria 2006;24(2):

4 Avaliação da variabilidade da dosagem transcutânea de bilirrubina pelo Bilicheck em neonatos teste foi altamente significativo para cada uma das três faixas de bilirrubinemia: poder de 99,7% para a faixa de a <10 mg/dl; poder de 99,9% para a faixa de 10 a 1 mg/dl e para a faixa >1 mg/dl, dispensando aumento do número de avaliações. Tabela 2 Análise descritiva dos coeficientes de variação por grupo Bilirrubinemia Grupo Número Média DP Mínima Mediana Máxima >1 mg/dl Padrão 2,1 0,41 1,3 2,32 2, C/Troca 8,10 2,9 4,84 8,8 11,7 S/Troca,04 1,78 3,43 4,4 7, mg/dl Padrão 1, 0,43 1,1 1,49 2,20 C/Troca 9,9 2,78 6,90 9,4 14,02 S/Troca 6,77 2,04 4,6 6,0 9,96-10 mg/dl Padrão 2,67 1,02 1,18 2,66 3,84 C/Troca 9,4 2,93 4,42 10,24 11,71 S/Troca 7,40 1,30,36 7,62 8,6 Padrão: solução de bilirrubina em plasma de recém-nascido, obtida a partir de uma solução usada como teste de confiabilidade do bilirrubinômetroessivas realizadas no mesmo recém-nascido utilizando o mesmo Bilical em todas as dosagens Bilirrubina (mg/dl) Bilirrubina (mg/dl) Bilirrubina (mg/dl) bilirrubinemia -10 mg/dl bilirrubinemia 10-1 mg/dl bilirrubinemia >1 mg/dl Figura 1 Variabilidade das 1 medidas de bilirrubina em cada um dos cinco pacientes testados ou nas cinco amostras de solução-padrão, segundo o método de avaliação para cada faixa de bilirrubinemia Tabela 3 Resultados da análise de variância simples para a comparação do coeficiente de variação entre métodos Dosagem Comparação entre métodos Diferenças significativas Grupo Posto médio N >1 mg/dl p<0,0001 Padrão C/ Troca S/ Troca-padrão 12,20 8,80 3, mg/dl p<0,0001 Padrão C/ Troca S/ Troca-padrão 12,20 8,80 3,00-10 mg/dl p=0,0002 Padrão C/ Troca S/ Troca-padrão 12,00 9,00 3,00 Valores de p referentes às comparações entre métodos, pela análise de variância Oneway nos postos 12 Rev Paul Pediatria 2006;24(2):149-4.

5 Fernando Perazzini Facchini Discussão O Serviço de Neonatologia da Unicamp utiliza, na rotina, a dosagem de bilirrubina pela espectofotometria direta. O equipamento utilizado é o Bilirrubinômetro Unistat- Leica, amplamente empregado em todo o mundo e com mais de 1000 unidades vendidas, segundo seu fabricante. Seu desempenho já foi testado em relação à HPLC, considerado o padrão-ouro na avaliação da bilirrubina e julgado adequado (11). A HPLC, embora seja o padrão-ouro, não é realizada de rotina, em função da dificuldade de execução e alto custo. Dessa forma, como em nosso serviço o Bilirrubinômetro Unistat-Leica é a dosagem de referência para a tomada de decisões (fototerapia ou exsangüinotransfusões), achamos válido comparar o desempenho do Bilicheck com este equipamento. Vários trabalhos têm comparado o Bilicheck com a HPLC e outros métodos usados na rotina de várias instituições. Enquanto alguns desses trabalhos julgam o Bilicheck capaz de substituir os métodos invasivos pela quase identidade de resultados obtidos (4,), outros acreditam que possa ser usado apenas como um bom método de rastreamento, necessitando de confirmação por métodos convencionais, principalmente quando se observam valores mais elevados de bilirrubina (12-14). Todos esses trabalhos têm procurado comparar a correlação e/ou a identidade entre os resultados do Bilicheck e de algum método invasivo. A variabilidade intrínseca do Bilicheck tem sido testada em duplicata ou triplicata (4,,14), embora se recomende 1 a 20 determinações para cálculo do desvio-padrão de um teste laboratorial (6). Os coeficientes de variação desejáveis ou recomendados para um teste laboratorial são inferiores a 0,0 (11). A decisão de utilizar uma solução-padrão, em vez de amostras de sangue de recém-nascidos ictéricos, decorreu do fato de a mesma ser elaborada com: plasma humano como solvente (no caso, de recém-nascidos), bilirrubina p.a. de pureza comprovada e ph e nível de proteínas ajustados. Tal soro-padrão apresenta características químicas exatamente iguais às do plasma de recém-nascidos humanos ictéricos, tanto assim que é utilizado como referência nos métodos de dosagem da bilirrubinemia. Desta forma, evita-se colher sangue dos recém-nascidos avaliados de forma transcutânea e suas conseqüências, como dificuldades na coleta venosa, desconforto e espoliação. Como este estudo visava verificar a variabilidade de cada método e não a identidade de valores determinados pelos dois métodos, esta escolha pareceu adequada. A presente investigação vem demonstrar que os coeficientes de variação do Bilicheck são significativamente mais elevados que os do Bilirrubinômetro Unistat-Leica, para quaisquer níveis de bilirrubinemia. Tais coeficientes, em média superiores a %, indicam que, devido à grande variabilidade intrínseca do Bilicheck, este equipamento não deve ser utilizado em substituição aos métodos invasivos. Sua grande utilidade é como rastreador de hiperbilirrubinemia. A detecção de valores elevados deverá ser confirmada por métodos invasivos para a tomada de decisão a respeito de condutas terapêuticas. O ponto de corte adotado para indicar a confirmação dos resultados do Bilicheck por métodos invasivos varia muito (7,8,13-1) e deve ser determinado por cada serviço em particular. Um dos resultados mais importantes da presente pesquisa resulta da observação que a reutilização das ponteiras de calibração (BiliCal ), pelo menos por 1 dosagens sucessivas, não leva a aumento da variabilidade dos resultados, tal qual já assinalado por Lodha et al, em 2000 (7). Este fato pode resultar em significativa redução dos custos de utilização do Bilicheck, uma vez que em nosso meio, o alto custo das cápsulas Bilical pode inviabilizar sua aplicação. Pelo exposto, concluí-se ser o Bilicheck um equipamento muito útil no rastreamento da hiperbilirrubinemia, reduzindo sensivelmente a necessidade de dosagens invasivas e a um custo perfeitamente razoável, desde que as cápsulas Bilical sejam reutilizadas. Agradecimentos Desejamos expressar nossos agradecimentos à Helymar C. Machado e Cleide M. Silva, do setor de Estatística da Comissão de Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas/Unicamp, pela análise estatística dos resultados. Nossos agradecimentos ao Dr. Daniel Garros da Enfermaria Coleen Gresiuk da Unidade de Cuidados Intensivos do Stollery Children s Health Centre, Edmonton, Canadá, pelas sugestões e pela revisão da tradução para o inglês, colocada à disposição da SPSP. Desejamos manifestar ainda nossa profunda gratidão à Professora-Doutora Maria Aparecida Mezzacappa, nossa colega do Serviço de Neonatologia da Unicamp, pela preciosa ajuda na revisão final deste trabalho. Rev Paul Pediatria 2006;24(2):

6 Avaliação da variabilidade da dosagem transcutânea de bilirrubina pelo Bilicheck em neonatos Referências bibliográficas 1. Vreman HJ, Verter J, Oh W, Fanaroff AA, Wright LL, Lemons JA, et al. Interlaboratory variability of bilirubin measurements. Clin Chem 1996;42: Yamanouchi I, Yamauchi Y, Igarashi I. Transcutaneous bilirubinometry: preliminary studies on non-invasive transcutaneous bilirubin meter in the Okayama National Hospital. Pediatrics 1980;6: Tayaba R, Gribetz D, Gribetz I, Holzman IR. Non-invasive estimation of serum bilirubin. Pediatrics 1998;102:E Bhutani VK, Gourley GR, Adler S, Kreamer B, Dalin C, Johnson LH. Noninvasive measurement of total bilirubin in a multiracial predischarge newborn population to assess the risk of severe hyperbilirubinemia. Pediatrics 2000;106:E17.. Rubaltelli FF, Gourley GR, Loskamp N, Modi N, Roth-Kleiner M, Sender A, et al. Transcutaneous bilirubin measurement: a multicenter evaluation of a new device. Pediatrics 2001;107: Copeland BE. Statistical tools in clinical pathology. In: Davidsohn I, Henry JB, editors. Clinical diagnosis by laboratory methods. 14 th ed. Philadelphia: Saunders; 1969, p Lodha R, Deorari AK, Jatana V, Paul VK. Non-invasive estimation of total serum bilirubin by multi-wavelength spectral reflectance in neonates. Indian Pediatr 2000;37: Joint Committee of AAP, CAP, AACC, NIH. Recommendation on a uniform bilirubin standard. Clin Chem 1962;8: Miliken GA, Johnson DE. Analysis of messy data. Volume I: designed experiments, New York: Van Nostrand Reinhold; Montgomery DC. Design and analysis of experiments. 3 rd ed. New York: Wiley; Gourley G, Bhutani V, Johnson L, Kreamer B, Kosorok M, Dalin C. Measurement of serum bilirubin in newborn infants: common clinical laboratory methods versus high performance liquid chromatography (HPLC). Pediatr Res 1998;43:260A. 12. Wong CM, van Dijk PJ, Laing IA. A comparison of transcutaneous bilirubinometers: SpectR(X) BiliCheck versus Minolta Air Shields. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 2002;87:F Engle WD, Jackson GL, Sendelbach D, Manning D, Frawley WH. Assessment of a transcutaneous device in the evaluation of neonatal hyperbilirubinemia in a primarily Hispanic population. Pediatrics 2002;110: Bertini G, Rubaltelli FF. Non-invasive bilirubinometry in neonatal jaundice. Semin Neonatol 2002;7: Robertson A, Kazmierczak S, Vos P. Improved transcutaneous bilirubinometry: Comparison of SpectR(X) BiliCheck and Minolta Jaundice Meter JM-102 for estimating total serum bilirubin in a normal newborn population. J Perinatol 2002;22: Rev Paul Pediatria 2006;24(2):149-4.

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