MOEMA CORTIZO BELLINTANI

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1 MOEMA CORTIZO BELLINTANI ESTUDO DA PROPAGAÇÃO IN VITRO E EX VITRO DE Neoregelia mucugensis LEME, Orthophytum mucugense WAND. e CONCEIÇÃO e O. albopictum PHILCOX. ESPÉCIES DE BROMELIACEAE ENDÊMICAS DA BAHIA. FEIRA DE SANTANA BAHIA 2006

2 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA ESTUDO DA PROPAGAÇÃO IN VITRO E EX VITRO DE Neoregelia mucugensis LEME, Orthophytum mucugense WAND. e CONCEIÇÃO e O. albopictum PHILCOX ESPÉCIES DE BROMELIACEAE ENDÊMICAS DA BAHIA. MOEMA CORTIZO BELLINTANI Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Botânica da Universidade Estadual de Feira de Santana como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Botânica. ORIENTADOR: PROFA. DRA. ANA LÚCIA CUNHA DORNELLES CO-ORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ RANIERE FERREIRA DE SANTANA FEIRA DE SANTANA BA 2006

3 3 Ficha Catalográfica Bellintani, Moema Cortizo. Estudo da propagação in vitro e ex vitro de Neoregelia mucugensis Leme, Orthophytum mucugense Wand. e Conceição e Orthophytum albopictum Philcox, espécies de Bromeliaceae endêmicas da Bahia / Moema Cortizo Bellintani. Feira de Santana: Universidade Estadual de Feira de Santana, p.:il. Tese (Doutorado em Botânica) Departamento de Ciências Biológicas Universidade estadual de feira de Santana, BA, 2006.

4 4 BANCA EXAMINADORA Dra. Ana Lúcia Cunha Dornelles (UFRRJ) Dra. Claudinéia Regina Pelacani (UEFS) Dra. Fernanda Vidigal Duarte Souza (EMBRAPA) Dra. Janay Almeida dos Santos-Serejo (EMBRAPA) Dr. Renato Paiva (UFLA) Feira de Santana BA 2006

5 5 A Antonio, meu amor, companheiro para a vida; Aos meus pais, responsáveis pela fascinação, respeito e admiração que nutro pela natureza e pela vida acadêmica; Aos meus irmãos pela cumplicidade, amizade e alegria.

6 6 AGRADECIMENTOS Agradeço a todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho. A Ana Lúcia Cunha Dornelles, pela orientação, respeito e confiança, mas principalmente pelo exemplo de vida; A José Raniere Ferreira de Santana, pelas sugestões, disponibilidade e orientação que tiveram grande importância para a conclusão deste trabalho; A José Geraldo de Aquino Assis, Ana Lúcia Pires Cotias de Oliveira, Ervene Barreto, João Paulo Loyola e demais membros da equipe do Laboratório de Citogenética Vegetal da UFBA, pelo auxílio e por disponibilizar a estrutura do laboratório e os equipamentos para a realização das análises histológicas; A Claudinéia Pelacani, pelas sugestões e disponibilidade, principalmente durante a primeira etapa deste trabalho; Ao Projeto Sempre-Viva e à sua equipe, pelo excelente trabalho que vêm realizando em Mucugê e pela força e incentivo, essenciais para a realização deste trabalho; A FAPESB, por ter apoiado o projeto que resultou neste trabalho; A Maria das Graças Lapa Wanderley, pela identificação taxonômica das espécies aqui estudadas; A equipe de professores, funcionários e estudantes do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais e demais laboratórios do Horto Florestal, pela convivência e colaboração ao longo dos últimos quatro anos. Ana Paula Sampaio, Ana Paula

7 7 Rios, Ana Carolina, Cristina, Janilza, José Roberto, Magnólia, Noeli, Sandra, Solange, Vânia e Dona Zezé, muito obrigada; A Alone Brito, pela força, pelas indispensáveis contribuições e principalmente pela serenidade, convívio e amizade; A Carolina Cerqueira, pela alegria e pela participação na montagem, acompanhamento e avaliação de muitos experimentos deste trabalho; A Sheila Resende, pela amizade e zelo, e também pelas discussões e pela assistência, essenciais em muitos momentos; As amigas Lia Miranda e Manuela Rodrigues, pelo companheirismo e carinho; A Léa Lopes, pelo grande apoio e aprendizado, mas principalmente pela amizade; A Lázaro Benedito da Silva, pelas boas e acolhedoras conversas; A Andréa Karla, pela disponibilidade e ajuda com as exsicatas; A Adriana Estrela, pela dedicação ao curso de Pós-Graduação; As queridas amigas Ana Maria Almeida e Roberta Damasceno, pela revisão dos abstracts; A Leila Cruz, Leonardo Pacheco, Raymundo Sá Neto, Sílvia Passos e Tiana Baqueiro, porque, próximos ou distantes, são sempre grandes amigos; Aos meus alunos, que me possibilitam aprender e crescer a cada dia.

8 8 SUMÁRIO AGRADECIMENTOS RESUMO 1 ABSTRACT 3 INTRODUÇÃO GERAL 5 CAPÍTULO 1 19 Germinação e crescimento inicial de Neoregelia mucugensis Leme e Orthophytum mucugense Wand. e Conceição. Bromélias endêmicas da Bahia Brasil. CAPÍTULO 2 38 Estabelecimento in vitro de Neoregelia mucugensis Leme e Orthophytum mucugense Wand. e Conceição. Bromélias endêmicas da Chapada Diamantina, Bahia - Brasil. CAPÍTULO 3 57 Resposta regenerativa in vitro de explantes caulinares de Neoregelia mucugensis Leme, Orthophytum mucugense Wand. e Conceição e Orthophytum albopictum Philcox. Bromélias endêmicas da Chapada Diamantina - Brasil, submetidas a diferentes concentrações de BAP e ANA. CAPÍTULO 4 78 Efeito da ventilação in vitro na aclimatização de plantas micropropagadas de Orthophytum mucugense Wand. e Conceição, uma bromélia endêmica da Bahia - Brasil. CONCLUSÕES GERAIS 99 APÊNDICES 105 Quadros de análise de variância

9 1 RESUMO Orthophytum albopictum, Orthophytum mucugense e Neoregelia mucugensis são bromélias endêmicas da Chapada Diamantina, com grande potencial ornamental e relevante importância ecológica. Têm distribuição restrita, sendo importante a realização de trabalhos de conservação. O cultivo in vitro de bromélias é muito utilizado para fins comerciais e na preservação de espécies raras ou ameaçadas de extinção. Os objetivos desse trabalho foram: (1) avaliar a influência do substrato na germinação e crescimento ex vitro de O. mucugense e N. mucugensis; (2) avaliar a influência da composição do meio de cultura na germinação e no crescimento in vitro de O. mucugense e N. mucugensis; (3) desenvolver um protocolo eficiente de regeneração in vitro para O. albopictum, O. mucugense e N. mucugensis utilizando explantes caulinares na presença de benzilaminopurina (BAP) e ácido naftalenoacético (ANA) e (4) avaliar a influência da forma de fechamento dos tubos e de diferentes concentrações de sacarose na aclimatização de plantas da espécie O. mucugense propagadas in vitro. Os percentuais de emergência (%E), foram maiores para N. mucugensis (91,2 96,5%) do que para O. mucugense. (58 77,5%). Em O. mucugense os maiores valores para %E foram observados nos substratos terra vegetal (T) (77,5%) e vermiculita + terra (V+T) (76%). O índice de velocidade de emergência e o tempo médio de emergência para as duas espécies não diferiram significativamente entre os três substratos. Aos 120 dias, os substratos T e V+T foram mais efetivos na incorporação de matéria seca que o substrato V para O. mucugense. Enquanto para N. mucugensis, o substrato V+T proporcionou um ganho quase duas vezes maior que o substrato T. Aos 300 dias, a incorporação de matéria seca foi maior no substrato T para as duas espécies. Nos experimentos in vitro, as sementes de N. mucugensis germinam bem em ágar e em MS/2, já a espécie O. mucugense teve uma boa germinação apenas no ágar. Os meios de cultura MS e MS/2 podem ser utilizados para o cultivo in vitro de N. mucugensis e O. mucugense. A presença de carvão ativado favoreceu o crescimento da parte aérea de O. mucugense e do sistema radicular de ambas espécies, sendo aconselhável a sua utilização na fase de pré-aclimatização. Em geral O. albopictum e N. mucugensis têm maior capacidade para regenerar brotos que O. mucugense. Os brotos de O. albopictum apresentaram maior ganho de massa que as demais espécies. Quanto

10 2 à capacidade dos explantes em regenerar brotos, N. mucugensis e O. albopictum apresentaram percentuais significativamente mais altos que O. mucugense. O percentual de explantes formando calos foi maior para O. albopictum que para as outras duas espécies. Para induzir a formação de brotos in vitro recomenda-se a utilização das combinações de 2,22 ou 4,44µM BAP + 1,3µM de ANA para N. mucugensis, 2,22µM de BAP + 0,65µM ANA para O. mucugense e 1,11µM de BAP + 0,65µM ANA para O. albopictum. O selamento dos recipientes de cultura com algodão reduziu a perda de água em 50% e possibilitou o desenvolvimento da parede celular lignificada de células da epiderme adaxial e abaxial. A concentração de sacarose não influenciou de forma significativa à sobrevivência de plantas procedentes de tubos fechados com algodão. A restrição de sacarose no meio de cultura prejudicou a sobrevivência de plantas provenientes de tubos fechados com PVC.

11 3 ABSTRACT Neoregelia mucugensis, Orthophytum mucugense and Orthophytum albopictum are endemic bromeliads from Chapada Diamantina, Bahia, Brazil, and they have great ornamental potential and ecological relevance. They have restricted occurrence in Mucugê, Bahia Brazil, vindicating conservation studies about them. In vitro culture of bromeliads is widely used for commercial purposes and for preservation of rare or endangered species. The purposes of the present study were to: (1) to evaluate the effects of substrates at the ex vitro germination and initial development of N. mucugensis and O. mucugense; (2) to evaluate the effects of culture medium composition in the germination and growth of N. mucugensis and O. mucugense; (3) develop an efficient protocol for in vitro regeneration from stem explants of Orthophytum albopictum, Orthophytum mucugense and Neoregelia mucugensis in the presence of benzylaminopurine (BAP) e naphthaleneacetic acid (NAA) and (4) to evaluate the influence of different tubes closing forms and the effect of sucrose in the acclimatization of micropropagated O. mucugense shoots. The emergence percentage (%E) were higher for N. mucugensis ( %) than for O. mucugense. ( %). For O. mucugense the highest values of %E were observed in the substrates T (77.5%) and V+T (76%). The emergence velocity index and the average period of emergence, for both species, did not show significant differences between the three substrates. At day 120, the substrates T and V+T were more efective concerning dry weight incorporation than the substrate V for the O. mucugense. The substrate V+T promoted a gain almost twice times greater than the substrate T for N. mucugensis. After 300 days, the dry weight incoporation was greater in the substrate T for both. In the in vitro experiments, seeds of N. mucugensis had a good germination ratio in agar and in MS/2, but O. mucugense seeds had a better germination ratio in agar. MS or MS/2 culture media can be used for the N. mucugensis and O. mucugense in vitro culture. As the presence of activated charcoal favoured leaf growth of O. mucugense and the root system growth of both species, thus its use is recommended in the pre-acclimatization phase. In general, O. albopictum e N. mucugensis had better capacity to regenerate shoots and more responsive explants than O. mucugense. O. albopictum shoots showed higher dry weights than other species. N. mucugensis explants were more

12 4 responsives in the presence of BAP (1.11 e 2.22µM) and in the absence of NAA. O. albopictum showed the biggest callus formation. We recommend the use of 1.3µM NAA or 4.44µM BAP for N. mucugensis, 2.22µM BA µM NAA for O. mucugense and 1.11µM of BAP µM NAA for O. albopictum. The use of cotton for sealing culture containers reduced the loss of water in 50% and it made possible the development of the lignified cellular wall of adaxial and abaxial epidermis. The concentration of sucrose did not show significant influence on the survival of cotton sealed tube plants. The restriction of sucrose in the culture medium decreased the PVC sealed tubes plant s survival.

13 5 INTRODUÇÃO GERAL Bromeliaceae, com cerca de espécies, forma a maior família de plantas essencialmente americana, distribuindo-se do sul dos Estados Unidos até o Chile. A única exceção é Pitcairnia feliciana (A. Chev.) Harms J. Mildbraed, encontrada no Golfo da Guiné, África. Dados da biogeografia da família sugerem que as primeiras espécies devem ter se originado e iniciado a sua diversificação numa época bastante próxima à separação dos continentes, que originou o Oceano Atlântico, há cerca de 200 milhões de anos (Leme e Marigo 1993). São conhecidos três grandes centros de origem e dispersão de espécies: os Andes, o planalto das Guianas e o leste brasileiro. Os representantes mais primitivos (Pticairnioideae e gêneros mais primitivos de Tillandsioideae) aparecem na região andina e nas Guianas. As espécies e táxons considerados mais avançados (Bromelioideae e táxons mais evoluídos de Pitcairnioideae e Tillandsioideae) encontram-se amplamente difundidos no leste brasileiro (Smith 1934). No Brasil, encontram-se quase metade das espécies de bromélias conhecidas, especialmente na região costeira, na Mata Atlântica e na restinga, podendo aparecer também na Amazônia, na caatinga, no cerrado e nos campos de altitude (Leme e Marigo 1993). O longo período de estabilidade geológica ocorrido na região que envolve o território brasileiro proporcionou a sobrevivência e desenvolvimento de grupos que hoje ocorrem na forma de vários gêneros endêmicos tais como Canistrum, Cryptanthus, Encholirium, Nidularium, Orthophytum, Quesnelia e Wittrockia (Leme e Marigo 1993; Leme 1998). A família Bromeliaceae está dividida em 3 subfamílias: Pitcairnioideae Harms, Bromelioideae Reichenbach e Tillandsioideae Harms. O número de gêneros diverge entre os autores. Smith e Downs (1974) na Flora Neotrópica apresentam 46 gêneros. Entretanto a descrição de novas espécies e o crescente estudo da família, tem ampliado este número para 51, 50 e 56 (Brummitt 1992; Leme e Marigo 1993; Leme 1997) (Tabela 1).

14 6 Tabela 1 Subdivisões da família Bromeliaceae (Leme 1997). FAMÍLIA BROMELIACEAE SUBFAMÍLIA Pitcairnioideae TRIBO Pitcairnieae GÊNERO Ayensua Connelia Cottendorfia Fosterella Lindmania Navia Pepinia Pitcairnia Steyerbromelia TRIBO Brocchinieae GÊNERO Brocchinia TRIBO Puyeae GÊNERO Brewcaria Deuterocohnia Dyckia Encholirium Hechtia Puya SUBFAMÍLIA Tillandsioideae GÊNERO Alcantarea Catopsis Glomeropitcairnia Guzmania Mezobromelia Tillandsia Vriesea Werauhia SUBFAMÍLIA Bromelioideae GÊNERO Acanthostachys Aechmea Ananas Androlepis Araeococcus Billbergia Bromelia Canistropsis Canistrum Cryptanthus Deinacanthon Disteganthus Edmundoa Fascicularia Fernseea Greigia Hohenbergia Hohenbergiopsis Lymania Neoglaziovia Neoregelia Nidularium Ochagavia Orthophytum Portea Pseudaechmea Pseudananas Quesnelia Ronnbergia Streptocalyx Ursulaea Wittrockia

15 7 Schultz (1985) descreve as bromélias como uma grande família de plantas herbáceas, terrestres ou epifíticas, com caule reduzido e, nas epífitas, raízes restritas à fixação. As folhas lanceoladas se inserem em espiral no caule ou formam uma roseta basal capaz de acumular grande quantidade de água. A epiderme das folhas em várias espécies é revestida de escamas capazes de absorver água e nutrientes necessários para o desenvolvimento da planta. O desenvolvimento do epifitismo envolveu o surgimento de escamas cada vez mais especializadas. Paralelamente à especialização das escamas, ocorre a redução do sistema radicular. Se a espécie absorve água e nutrientes diretamente do ar ela apresenta tricomas escamiformes altamente especializados, distribuídas em grande quantidade pela superfície foliar, e as raízes são reduzidas visto que a função de absorção radicular é restrita (Smith e Downs 1974). Evolutivamente o ovário tende a se posicionar de forma cada vez mais protegida, portanto os indivíduos morfologicamente derivados possuem ovário ínfero. O fruto se desenvolve no sentido de proporcionar uma dispersão cada vez mais especializada. Assim, o fruto capsular, composto de muitas sementes pequenas dotadas de apêndices, assume a forma bacácea, onde as sementes aparecem em maior tamanho e menor número. A relação tamanho-quantidade apresentada pelas sementes é uma adaptação ao sucesso reprodutivo para o tipo de dispersão desenvolvida. A dispersão pelo vento envolve uma redução no tamanho, que resulta em sementes leves, mas ao mesmo tempo com menos reservas energéticas (Smith e Downs 1974). A família Bromeliaceae tem grande importância na manutenção da biodiversidade animal e vegetal, fornecendo água e alimento além de ser utilizada como abrigo e local de acasalamento para muitas espécies animais. As bromélias vêm adquirindo importância econômica crescente devido à utilização no mercado florístico e ornamental, sendo que a maioria das plantas utilizadas para estes fins são obtidas de forma extrativista, o que vem acarretando uma perda genética significativa. O Estado da Bahia, como o Nordeste de uma forma geral, possui uma flora bastante rica, com espécies, pertencentes a diversas famílias, com grande potencial para exploração econômica. O gênero Neoregelia L.B.Sm. é composto por espécies terrestres, epífitas ou saxícolas. Apresenta tamanho bastante variado, suas folhas são densamente

16 8 rosuladas e usualmente espinosa-serreadas. A disposição das folhas origina um tanque característico, no qual a inflorescência está localizada (Smith e Downs 1983; Leme 1998). N. mucugensis Leme é uma planta típica dos campos rupestres. Apresenta grande plasticidade fenotípica, sendo caracterizada por variações na coloração, forma e conformação da roseta foliar e na coloração das flores (Leme 1998) (Figura 1A). Orthophytum Beer é um gênero exclusivamente brasileiro, composto por espécies terrestres ou saxícolas. As folhas serreadas são completamente recobertas por escamas, que refletem parte da luz solar que incide nas plantas. Pode ser dividido em dois grupos: o primeiro reúne maior número de espécies, apresenta inflorescência provida de escapo e folhas verdes; as espécies do outro grupo apresentam inflorescência séssil e, durante a floração, tendem a apresentar folhas coloridas na parte central da roseta foliar (Smith e Downs 1983; Wanderley 1990). Segundo Wanderley e Conceição (2006) as espécies de Orthophytum com inflorescência séssil, ocorrentes na Chapada Diamantina têm grande valor ornamental devido à intensa coloração vermelha que suas brácteas e folhas atingem na antese. Esta característica torna estas espécies também muito importantes por atrair beija-flores, desempenhando um importante papel ecológico. Orthophytum mucugense Wand. e Conceição é a mais nova espécie de Orthophytum descrita. Os indivíduos deste táxon crescem formando grandes populações em paredões rochosos localizados nas margens de rios. Os relatos acerca da sua distribuição geográfica revelam que a sua ocorrência está restrita ao município de Mucugê Chapada Diamantina. Apesar de ser encontrada em uma Unidade de Conservação Municipal e de formar grandes populações, a ocorrência restrita a uma única localidade leva O. mucugense a categoria vulnerável, fato que demonstra a importância da realização de trabalhos de preservação com esta nova espécie (Wanderley e Conceição 2006) (Figura 1B).

17 9 A B C Figura 1 Plantas em flor (A) Neoregelia mucugensis; (B) Orthophytum mucugense e (C) Orthophytum albopictum. As barras representam 1cm.

18 10 Orthophytum albopictum Philcox apresenta inflorescência séssil e durante o período de florescimento as folhas centrais da roseta também adquirem coloração vermelha. As duas espécies de Orthophytum aqui apresentadas têm o mesmo habitat e distribuição geográfica, mas são facilmente diferenciadas pelo tamanho; O. mucugense é uma planta de pequeno porte, já O. albopictum é considerada uma espécie de grande porte (para este gênero), apresentando folhas ao menos duas vezes mais largas que as de O. mucugense (Smith e Downs 1983; Stannard 1995; Wanderley 1990; Wanderley e Conceição 2006) (Figura 1C). Os problemas ambientais e o intenso extrativismo têm afetado as populações de bromélias, ressaltando a importância de trabalhos de conservação, que protejam estes vegetais e, conseqüentemente, toda a fauna e flora associadas a estas plantas (Fialho 1990, Fialho e Furtado 1993; Leme e Marigo 1993; Oliveira et al. 1994; Oliveira e Rocha 1997). A coleta indiscriminada destas plantas tem prejudicado a recuperação das populações naturais, tornando as bromélias cada vez mais escassas na natureza. Sendo assim, tornam-se imprescindíveis novas medidas, que de um lado mantenham as espécies a salvo do perigo de extinção, e de outro ajudem a manutenção da fonte de renda relacionada à utilização ornamental destas plantas. Uma atenção especial deve ser destinada a espécies com distribuição restrita ou ameaçadas de extinção. Neoregelia mucugensis, Orthophytum mucugense e Orthophytum albopictum são espécies endêmicas da Chapada Diamantina Bahia, ocorrem em unidades de conservação municipais ou federais, mas não são consideradas protegidas devido às grandes queimadas que costumam atingir a região no período de seca (Leme 1998; Wanderley e Conceição 2006). Estes três táxons apresentam grande potencial ornamental. Portanto o estudo da propagação destas espécies é importante para a conservação bem como para o estabelecimento de um sistema de cultivo comercial. A reprodução assexuada através dos brotamentos laterais da planta mãe é feita com sucesso, mas limita bastante o número de plantas obtidas. A reprodução por sementes promove a varibilidade genética e a obtenção de maior número de indivíduos. Já a multiplicação in vitro possibilita a formação de um grande número de mudas, essencial para a racionalização do cultivo (Mercier e Kerbauy 1995, 1997). A propagação em larga escala reduz os custos de produção

19 11 e, conseqüentemente, o preço final das mudas, mas principalmente diminui o extrativismo, favorecendo a preservação das espécies (Kanashiro 2005). O cultivo in vitro de bromélias tem obtido espaço na preservação de espécies raras ou ameaçadas de extinção (Arrabal et al. 2002; Carneiro et al. 1999; Mercier e Kerbauy 1997; Rech Filho et al. 2005). A escassez de estudos sobre a biologia reprodutiva destas plantas tem elevado a importância da conservação in vitro da família. A manutenção in vitro assegura a conservação de germoplasma (Carneiro e Mansur 2004; Villalobos et al. 1991) e é vantajosa inclusive por proporcionar a produção de plantas saudáveis, e a representação de grande variedade de genótipos em espaços reduzidos (Engelmann 1991). A micropropagação visando a preservação de espécies deve assegurar a manutenção da variabilidade genética. Para tanto, é importante a utilização de plântulas obtidas a partir da germinação in vitro de sementes oriundas de diferentes populações (Mercier e Nievola 2003). Neste caso, o cultivo in vitro a partir de sementes é aconselhado também por gerar um grande número de plantas-matrizes, evitando a retirada de indivíduos da natureza, o que agravaria o grau de ameaça sobre estas espécies (Carneiro e Mansur 2004). Outra importante vantagem da obtenção de explantes a partir da germinação decorre da maior facilidade na desinfestação de sementes quando comparadas com tecidos extraídos de plantas nativas (Mercier e Kerbauy 1997). Para a conservação in vitro as plantas devem manter a sua estabilidade genética, sendo importante o desenvolvimento de métodos que reduzam a ocorrência de mutações e a variação somaclonal. A regeneração de brotos a partir de organogênese direta e a redução da concentração e do tempo de exposição dos explantes aos reguladores de crescimento diminuem as chances de ocorrência de alterações genéticas (Mercier e Nievola 2003). Apesar de algumas espécies de bromélias serem amplamente propagadas, muitos indivíduos comercializados ainda são obtidos pelo extrativismo predatório, colocando muitas espécies em risco. A padronização de protocolos de micropropagação tem possibilitado a produção de grande quantidade de mudas para o abastecimento agrícola e comercial. No entanto, o número de espécies micropropagadas ainda é bastante reduzido (Arrabal et al. 2002; Carneiro e Mansur, 2004; Carneiro et al. 1999; Droste et al. 2005; Endres et

20 12 al. 2002; Guimarães et al. 1999; Malda et al. 1999; Mercier e Kerbauy 1992, 1997, 1998). Plantas procedentes de propagação in vitro podem apresentar problemas na adaptação para o ambiente ex vitro, resultando freqüentemente num baixo percentual de sobrevivência. A incapacidade de controlar a perda de água por evaporação a partir da superfície foliar bem como o mau funcionamento dos estômatos de plantas cultivadas in vitro afeta a capacidade de adaptação ao ambiente externo (Seelye et al. 2003). Estas alterações que acarretam a inabilidade das plantas em manter a sua umidade interna parecem ser influenciadas pelo acúmulo de gases como, etileno, mas principalmente pelo elevado teor de umidade presente no recipiente utilizado para o cultivo in vitro (Buddendorf-Jooten e Woltering 1996; De Proft et al. 1985; Zobayed et al. 1999). Assim, um modelo de cultivo que possibilite a ocorrência de trocas gasosas tem mostrado facilitar a fase de aclimatização das mudas (Jackson 2003; Seelye et al. 2003). A ventilação dos frascos de cultura obtida através do uso de tampas permeáveis aumenta as trocas gasosas e, conseqüentemente, as taxas de transpiração das plantas in vitro (Lai et al. 2005; Zobayed et al. 1999). A aeração dos frascos estimula o desenvolvimento de adaptações contra a perda de água ainda no ambiente de laboratório, resultando na produção de plantas com melhor controle da evaporação (Santamaria et al. 2000). Outros trabalhos demonstraram efeitos positivos das trocas gasosas sobre a propagação in vitro de mamão (Lai et al. 1998), eucalipto (Zobayed et al. 2000a), batata doce (Zobayed et al. 2000b), batata (Zobayed et al. 2001) e maçã (De Klerk 2002). Mills e Tal (2004), avaliando a tolerância à salinidade em tomate, demonstraram que plantas crescendo sob condições in vitro em frascos ventilados apresentaram comportamento semelhante ao das plantas cultivadas em ambiente externo. O meio de cultura utilizado para a micropropagação em geral contém açúcar em quantidade suficiente para possibilitar o crescimento heterotrófico dos brotos. Além disso, o típico ambiente de cultivo in vitro é caracterizado por apresentar um grande acúmulo de substâncias como o etileno, decorrente da ausência de trocas gasosas entre o recipiente de cultivo e o meio externo, de forma que existe uma grande diferença entre estes ambientes (Kozai 1991). A aproximação entre as condições da cultura in vitro e as condições ambientais tem

21 13 demonstrado melhorar o desenvolvimento das plantas. Kozai et al. (1991) destacam a possibilidade de estimular a fotoautotrofia in vitro, reduzindo a quantidade de carboidrato fornecido e aumentando a intensidade luminosa do ambiente de cultivo. Alguns sistemas de micropropagação fotoautotróficos que envolvem a utilização de meios sem açúcar, ventilação forçada e exposição a altas intensidades luminosas têm mostrado resultados positivos, proporcionando um melhor desempenho das plantas no que tange ao crescimento, qualidade e sobrevivência (Zobayed et al. 2000a; Xiao e Kozai 2004). O objetivo deste trabalho foi avaliar a germinação e o crescimento em viveiro e estabelecer um protocolo eficiente para o estabelecimento e a propagação in vitro bem como para a aclimatização de plantas micropropagadas pertencentes às espécies Neoregelia mucugensis, Orthophytum mucugense e Orthophytum albopictum.

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27 19 CAPÍTULO 1 Germinação e crescimento inicial de Neoregelia mucugensis Leme e Orthophytum mucugense Wand. e Conceição. Bromélias endêmicas da Bahia - Brasil 1. 1 Este capítulo será submetido à revista Biodiversity and Conservation

28 20 RESUMO As espécies Neoregelia mucugensis e Orthophytum mucugense, endêmicas da Chapada Diamantina - Bahia, têm grande potencial ornamental e importância ecológica. Como outras bromélias, são obtidas de forma extrativista. O objetivo desse trabalho foi avaliar a influência do substrato na germinação e desenvolvimento inicial de N. mucugensis e O. mucugense. Foram utilizados três substratos para a avaliação da germinação e do crescimento das plantas aos 120 dias: (V) vermiculita, (T) terra vegetal e (V+T) vermiculita + terra vegetal (1:1) e dois substratos para a avaliação do crescimento aos 300 dias: (T) terra vegetal e (V+T) vermiculita + terra vegetal. As duas espécies apresentaram altas porcentagens de emergência (%E), sendo que os valores observados para N. mucugensis (91,2 96,5%) foram maiores do que para O. mucugense (58 77,5%). Em O. mucugense os maiores valores para %E foram observados nos substratos T (77,5%) e V+T (76%). O índice de velocidade de emergência e o tempo médio de emergência para as duas espécies não diferiram significativamente entre os três substratos. Aos 120 dias, os substratos T e V+T foram mais efetivos no ganho de matéria seca que o substrato V para O. mucugense. Enquanto para N. mucugensis, o substrato V+T proporcionou um ganho quase duas vezes maior que o substrato T. Aos 300 dias, o ganho de matéria seca foi maior no substrato T para as duas espécies. A germinação e o desenvolvimento inicial de N. mucugensis e O. mucugense foram influenciados pelos substratos utilizados neste experimento.

29 21 ABSTRACT (Germination and initial development of Neoregelia mucugensis Leme and Orthophytum mucugense Wand. e Conceição. Endemic bromeliads from Bahia Brazil.) Neoregelia mucugensis and Orthophytum mucugense are endemic species from Chapada Diamantina, Bahia, Brazil and they have great ornamental potential and ecological relevance. Like others bromeliads, they are obtained through extractivism. The purpose of the present study was to evaluate the effects of substrates at the germination and initial development of N. mucugensis and O. mucugense. Three substrates were compared to evaluate germination and plant growth at 120 days: (V) vermiculite, (T) organic soil and (V+T) vermiculite + organic soil (1:1); and two substrates were used to evaluate plant growth at 300 days: (T) organic soil and (V+T) vermiculite + organic soil. Even though both species have presented high emergence percentage (%E), the values observed for N. mucugensis ( %) were higher than the values for O. mucugense ( %). For O. mucugense the highest values of %E were observed in the substrates T (77.5%) and V+T (76%). The emergence velocity index and the average period of emergence, for both species, did not show significantly differences between the three substrates. At day 120, the substrates T and V+T were more efective concerning dry weight incorporation than the substrate V for the O. mucugense. The substrate V+T promoted a gain almost twice times greater than the substrate T for N. mucugensis. After 300 days, the dry weight incoporation was greater in the substrate T for both species. The germination and the initial development of N. mucugensis and O. mucugense were influenced by the substrates evaluated in this study.

30 22 INTRODUÇÃO Neoregelia mucugensis Leme e Orthophytum mucugense Wand. e Conceição são espécies de Bromeliaceae endêmicas da Chapada Diamantina Bahia (Leme 1998; Wanderley e Conceição 2006), têm grande potencial ornamental e como muitos representantes da família, grande importância ecológica pelas relações estabelecidas com a fauna local que podem utilizá-las para forrageamento e como refúgio (Rivero 1989; Oliveira et al. 1994; Oliveira e Rocha 1997). N. mucugensis apresenta ainda uma característica comum a muitos representantes da família Bromeliaceae: a capacidade de reter água no tanque (Rocha et al. 1997) que é o micro habitat de muitos organismos, possibilitando a reprodução de muitas espécies animais (Rivero 1989; Oliveira et al. 1994; Oliveira e Rocha 1997) e a germinação de sementes de alguns vegetais (Fialho 1990; Fialho e Furtado 1993). N. mucugensis ocorre no Parque Nacional da Chapada Diamantina, mas não é considerada protegida devido às extensas queimadas que atingem o Parque anualmente (Leme 1998). A espécie recém descrita O. mucugense foi encontrada exclusivamente no município de Mucugê. A ocorrência restrita leva essa planta a ser classificada como vulnerável (Wanderley e Conceição 2006). É importante que se estabeleçam medidas para assegurar a conservação destas espécies na área de Campos Rupestres, onde se pode observar uma elevada freqüência de táxons endêmicos que hoje caminham a passos largos para a extinção (Leme 1998). Estudos relacionados à propagação podem auxiliar na preservação das referidas espécies, promovendo a conservação ex situ, gerando indivíduos que possam ser re-introduzidos na natureza. O estabelecimento de um protocolo de propagação eficiente viabiliza os cultivos comerciais, reduzindo as atividades extrativistas. O entendimento dos principais processos envolvidos na germinação de sementes de espécies nativas é de grande importância na preservação e utilização destas em programas de revegetação (Smiderle e Sousa 2003; Cuzzuol e Lucas 1999). O conhecimento do comportamento germinativo das sementes e como a plântula se estabelece no ambiente é de grande relevância, porque além de avaliar a qualidade das sementes, bem como a capacidade de produzir

31 23 plântulas normais (Garcia 1994), amplia as bases para a compreensão do sucesso no estabelecimento desses indivíduos e da sua ampla variabilidade morfológica, além de auxiliar na conservação dessas espécies (Navarro e Guitián 2003; Borghetti 2000). A composição do substrato é um fator que desempenha papel importante na germinação e no sucesso do desenvolvimento da planta. Segundo Carvalho Filho et al. (2002) o substrato exerce influência na arquitetura do sistema radicular e no estado nutricional das plantas. A depender da estrutura do substrato, da qualidade de aeração, da capacidade de retenção de água, e do seu grau de infestação por patógenos, haverá ou não sucesso na germinação das sementes e no desenvolvimento das plantas (Popinigis 1985). Segundo Marques et al. (1999), o material usado deve proporcionar a retenção de água ideal à germinação e garantir a profundidade de semeadura, não dificultando a emergência das plântulas. Estudos sobre o efeito do substrato são necessários para obtenção de plântulas de melhor qualidade (Campos e Uchida 2002). A análise de crescimento é um importante instrumento para a avaliação dos efeitos ambientais sobre as espécies (Benincasa 2003). O conhecimento a cerca do crescimento e da incorporação de matéria seca das espécies, é essencial quando se pretende utilizá-las para fins comerciais ou em programas de recuperação de ambientes degradados (Vieira et al. 1998). O objetivo desse trabalho foi avaliar a germinação de sementes de N. mucugensis e O. mucugense em diferentes substratos e o desenvolvimento inicial das plântulas.

32 24 MATERIAL E MÉTODOS As sementes das espécies Neoregelia mucugensis e Orthophytum mucugense foram coletadas no Parque Municipal de Mucugê, Rodovia BA 142, Km 96, município de Mucugê Bahia em junho de Os experimentos foram desenvolvidos na Unidade Experimental Horto Florestal da Universidade Estadual de Feira de Santana (Feira de Santana Bahia). As exsicatas das espécies encontram-se depositadas no Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana, com número HUEFS (N. mucugensis) e HUEFS (O. mucugense). Sementes procedentes de frutos maduros foram colocadas para secar sobre papel filtro a temperatura ambiente durante 4 dias. Sementes secas foram desinfestadas em álcool 70% durante um minuto e hipoclorito 3% por 15 minutos e em seguida submetidas a quatro lavagens em água destilada e autoclavada. A semeadura foi realizada superficialmente em recipientes plásticos de 50ml, perfurados na base, contendo três diferentes substratos: (V) vermiculita de granulação média, (T) terra vegetal e (V + T) vermiculita de granulação média + terra vegetal (1:1). Os substratos foram esterilizados a 121 O C durante 15 minutos. As culturas foram mantidas em laboratório sob condição de 25 ± 2ºC, fotoperíodo de 16h e densidade de fluxo de fótons fotossínteticamente ativos de 40 µmol.m - 2.s -1. A irrigação foi feita por capilaridade. A terra vegetal utilizada foi adquirida da Bio Jardim. A germinação das sementes foi avaliada diariamente durante 40 dias após a semeadura, considerando-se como germinadas as sementes que emitiram a primeira folha. Para a comparação das sementes das duas espécies, a matéria seca destas foi mensurada após a secagem em estufa com ventilação forçada a 60ºC por 96 horas. Foram avaliadas cinco repetições de 100 sementes cada. As variáveis analisadas foram baseadas em Borghetti (2000); Santana e Ranal (2000) e Maguire (1962) e consistiram de: Porcentagem de emergência (%E), Índice de Velocidade de Emergência (IVE), Tempo médio (Tm) e freqüência relativa (Fr). A primeira etapa da avaliação da resposta fisiológica das plântulas aos diferentes tratamentos ocorreu 120 dias após semeadura onde foi avaliado o

33 25 crescimento nos três substratos, através da determinação da matéria seca da parte aérea e do sistema radicular pelo método de estufa com ventilação forçada a 60ºC por 96 horas. Considerando os resultados obtidos neste ensaio, o substrato vermiculita foi excluído da segunda etapa da avaliação de desenvolvimento. Assim, as plântulas remanescentes foram transferidas para sacos de polietileno (10x18x5cm) contendo dois diferentes substratos: (T) terra vegetal ou (V + T) vermiculita de granulação média + terra vegetal (1:1) e mantidas em viveiro a 70% de luminosidade. Após 180 dias (300 dias após a semeadura) foi realizada a segunda etapa de avaliação, novamente através da determinação da matéria seca das plantas. Para os ensaios de germinação, utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 2 x 3 (espécie x substrato) com cinco repetições, sendo cada parcela composta por 40 sementes. Os resultados expressos em porcentagem foram transformados em arco seno (%G /100) 0,5 para a realização da análise estatística, a fim de normalizar a sua distribuição. Para a avaliação do desenvolvimento das plântulas aos 120 e 300 dias, o delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 2 x 3 e 2 x 2 (espécie x substrato) respectivamente, constituindo-se de quatro repetições, compostas por 10 plântulas cada (120 dias) ou cinco repetições compostas de 15 indivíduos cada (300 dias). Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey.

34 26

35 27 RESULTADOS E DISCUSSÃO A emergência de N. mucugensis nos três substratos foi iniciada 14 dias após a inoculação das sementes e se estendeu até o 23 o dia em vermiculita e vermiculita + terra e até o 25 o dia em terra. Já as sementes de O. mucugense apresentaram uma emergência mais lenta, que se estendeu do 17 o ao 40 o dia no substrato vermiculita, do 18 o ao 40 o dia em vermiculita+terra e do 19 o ao 40 o dia quando semeadas em terra. Este resultado mostra que a germinação de N. mucugensis é concentrada em um período de tempo mais restrito que a de O. mucugense (Figura 1.1). Na espécie N. mucugensis o percentual de emergência não diferiu significativamente entre os substratos avaliados. Já as sementes de O. mucugense, não apresentaram diferenças na emergência quando semeadas em terra (77,5%) ou vermiculita + terra (76%), mas ambos os substratos foram melhores para a germinação que a vermiculita (58%). O. mucugense apresentou taxa de emergência significativamente inferior a N. mucugensis em todos os substratos analisados (Tabela 1.1). Tabela 1.1 Valores médios para porcentagem de emergência (%E), tempo médio de emergência (TmE) e índice de velocidade de emergência (IVE) de sementes de Orthophytum mucugense e Neoregelia mucugensis em função do tipo de substrato utilizado. %E Z TmE IVE Substratos N. mucugensis O. mucugense N. mucugensis O. mucugense N. mucugensis O. mucugense Vermiculita (V) 94,0 a W A V 58,0 b B 16,47 a B 25,81 a A 2,31 a A 0,93 a B Terra (T) 91,2 a A 77,5 a B 16,37 a B 26,01 a A 2,17 a A 1,22 a B V + T 96,5 a A 76,0 a B 16,31 a B 25,00 a A 2,39 a A 1,26 a B Média 92,8 A 70,5 B 16,38 B 25,61 A 2,29 A 1,14 B Z Médias originais. A estatística foi realizada em médias transformadas em arco seno. W Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. V Médias seguidas pela letra maiúscula em cada linha, para cada variável, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

36 28 A Freqüência Relativa (%) Freqüência Relativa (%) B Tempo (dias) Figura 1.1 Freqüência relativa (%) da emergência de (A) N. mucugensis e (B) O. mucugense em vermiculita ( ), terra vegetal ( ) ou vermiculita + terra vegetal ( ).

37 29 N. mucugensis e O. mucugense apresentaram altos percentuais de emergência mostrando que estas espécies possuem comportamento semelhante a outros representantes da família (Mercier e Nievola 2003). Outros trabalhos registraram uma taxa de 100% de germinação para Aechmea beeriana (Nara e Webber 2002), cerca de 96% para Aechmea nudicaulis e Streptocalyx floribundus (Pinheiro e Borghetti 2003), 76% para Tillandsia geminiflora (Stringheta et al. 2005), 99% para Vriesea gigantea, 88,9% para Vriesea philippocoburgii (Droste et al. 2005), 90% para Vriesea hieroglyphica (Mercier e Kerbauy 1994), aproximadamente 50% para Pitcairnia staminea e cerca de 76% para Pitcairnia albiflos (Wendt et al. 2001). Em O. mucugense o menor valor encontrado para a emergência no substrato vermiculita (58%), cujas propriedades físico-químicas possibilitam uma alta retenção de água (Andrade et al. 1999, 2000; Araújo et al. 1991), pode estar relacionado com a inibição da germinação ocasionada pelo excesso de água no meio. Além disso, quantidades elevadas de água podem interferir na disponibilidade de O 2, afetando a respiração do embrião, o que pode influenciar negativamente na germinação (Kerbauy 2004). Supostamente a inviabilidade das sementes de O. mucugense no substrato vermiculita não ocorreu em N. mucugensis visto que o percentual encontrado para este tratamento (94%) não difere significativamente dos valores encontrados para terra (91,2%) ou vermiculita + terra (96,5%) (Tabela 1.1). Foi observado que sementes de Canistrum aurantiacum germinam na sua inflorescência (Siqueira Filho 2001). A geminação de sementes na inflorescência situada no tanque da planta pôde ser observada em N. mucugensis durante as coletas de sementes no seu habitat. Como este é um local de grande acúmulo de água, o comportamento da espécie no ambiente justificaria a maior capacidade de N. mucugensis de se desenvolver em locais com muita água, quando comparada com O. mucugense, uma espécie desprovida de tanque. O tempo médio e o índice de velocidade de germinação foram significativamente diferentes para as duas espécies, independentemente do substrato utilizado, confirmando que sementes de N. mucugensis germinam mais rápido e em um menor intervalo de tempo que sementes de O. mucugense (Tabela 1.1).