INSTITUTOS NACIONAIS DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA INCT ACOMPANHAMENTO E AVALIAÇÃO. Período de abrangência do relatório: de a

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1 INSTITUTOS NACIONAIS DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA INCT ACOMPANHAMENTO E AVALIAÇÃO Período de abrangência do relatório: de a IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO TÍTULO: Câncer Hereditário e Agregação Familial: Perfis clínicos e moleculares de pacientes Brasileiros e seus parentes com alto risco de câncer (INCITO) PROCESSO Nº: / COORDENADOR: Luiz Paulo Kowalski PROJETO DE PESQUISA HOUVE ALTERAÇÕES NOS OBJETIVOS E/OU METAS PROPOSTOS? ( ) SIM ( X ) NÃO Em caso positivo registrar as alterações ocorridas: Embora os objetivos e metas não tenham sido alterados, foram modificados alguns projetos no seu contexto metodológico ou científico por problemas técnicos ou outros achados relevantes publicados durante o desenvolvimento do estudo. HOUVE ALTERAÇÕES NO CRONOGRAMA ORIGINAL? ( X ) SIM ( ) NÃO Em caso positivo registrar as alterações ocorridas,como inclusão ou exclusão de objetivos e metas, dentre outros: O projeto de pesquisa proposto Estudos funcionais do papel do gene TP53 no controle da eergia e metabolismo não será executado pois o colaborador internacional que daria suporte não está mais no mesmo laboratório o qual apresentava as condições adequadas para o seu desenvolvimento. Um novo projeto foi incluído e é intitulado Análise funcional do ANRASSF1 em Carcinomas de Próstata. Este estudo é baseado em achado prévio do grupo. Os resultados parciais estão apresentados resumidamente no item Resultados/Metas (Ensaios Funcionais). Foram incluídas análises de famílias com melanoma dentro do projeto Análise de CNVs em síndromes de predisposiçao hereditária ao câncer. O projeto Sequenciamento total do genoma de pacientes com carcinomas de mama e tireóide foi modificado para a análise de sequenciamento do exoma destas pacientes, por garantir que os resultados sejam obtidos dentro dos prazos propostos. HOUVE PROBLEMAS E/OU DIFICULDADES NA EXECUÇÃO DO PROJETO?: ( X ) SIM ( ) NÃO Em caso positivo indicar quais foram:

2 Alguns projetos tiveram atraso na aprovação pelo Comitê de Ética da Instituição (alguns por pendências apontadas que tiveram que ser adequadamente respondidas e reavaliadas) e consequentemente na coleta das amostras. Também houve algum atraso na chegada de material de consumo por importação. Entretanto, de modo geral, a grande maioria dos projetos propostos já tem resultados parciais, dados publicados ou estão em bom andamento e deverão, em sua maioria, ser concluídos dentro dos prazos indicados no cronograma de execução. EQUIPE HOUVE ALTERAÇÃO NA COMPOSIÇÃO ORIGINAL DA EQUIPE? ( X ) SIM ( ) NÃO Em caso positivo indique o número de inclusões e exclusões: Responsável p/ laboratório associado ( ) Inclusão ( ) Exclusão Justificar: Pesquisador ( X ) Inclusão ( ) Exclusão João Duprat Pedreira Neto CPF: Justificar: Foi inserido um novo projeto de pesquisa de análises de probandos e familiares com melanoma para a investigação de variações no número de cópias genômicas. O pesquisador será responsável pelo atendimento clínico, coleta de amostras e dados clínicos dos pacientes incluídos no estudo. As amostras já foram analisadas para o sequenciamento CDKN2a e CDK4. Nota: listar em anexo, o nome e CPF, dos pesquisadores incluídos e excluídos do INCT. DESCREVER OS MECANISMOS DE INTERAÇÃO UTILIZADOS ENTRE GRUPOS DE PESQUISA PARTICIPANTES DO INCT: São realizadas reuniões com os pesquisadores envolvidos no INCITO para apresentação e discussão do andamento dos projetos assim como novas estratégias para aumentar a interação e colaboração dos projetose em andamento. Em 2012, o Seminário de Pesquisa Básica, reuniu 25 apresentações de estudantes e pesquisadores que apresentaram e discutiram os resultados de projetos científicos (40% deles relacionados ao INCITO). No período de 30 de setembro a 6 de outubro 2012 foi realizado o evento São Paulo Advanced School of Comparative Oncology, resultado da colaboração entre o INCITO, Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP, Faculdade de Medicina Veterinária, USP e da UNESP, Instituto de Biociências, UNESP e Faculdade de Medicina Veterinária, UFMG, Minas Gerais. Este evento também foi apoiado pela CAPES e CNPq. Participaram vários pesquisadores vinculados ao INCITO (nacionais e internacionais) assim como alunos nacionais e internacionais que apresentaram e discutiram os resultados da pesquisa desenvolvida. No dia 19 de abril de 2013 foi realizado no Hospital AC Camargo uma reunião a convite do INCITO a outros INCTs para aumentar a interação entre os INCTs e os pesquisadores envolvidos neste projeto. Na reunião estiveram presentes membros (coordenadores, vicecoordenadores, PI, outros pesquisadores) dos INCTs vinculados ao ensino, saúde e outros com temática vinculado ao nosso projeto (27 INCTs de diferentes regiões do Brasil). Nessa reunião foram discutidos os principais aspectos e resultados, meios de divulgação e estratégias para aumentar a parceria entre os grupos. Foi uma excelente oportunidade de conhecer os cientistas e ciência de excelência desenvolvida no país e apoiada pelo CNPq e FAPs.

3 RELATAR EVENTUAIS DIFICULDADES ENCONTRADAS ENTRE OS GRUPOS DE PESQUISA PARTICIPANTES DA REDE E POSSÍVEIS MECANISMOS UTILIZADOS PARA SUPERAR ESTAS DIFICULDADES: A principal dificuldade apontada no relatório anterior foi a interação com os diferentes INCTs e seus pesquisadores. Para superar esse grande obstáculo, enviamos convites a todos os coordenadores dos INCTs vinculados direta ou indiretamente à saude para uma reunião para discussão e apresentação dos projetos. Obtivemos uma resposta positiva e a presença quase que massiva (27 dos 30 INCTs convidados) de todos. Na discussão ficou evidente que esse era um grande anseio de todos os envolvidos. HOUVE A INCLUSÃO OU EXCLUSÃO DE INSTITUIÇÕES E EMPRESAS? ( ) SIM ( X ) NÃO EM CASO POSITIVO INDIQUE O NÚMERO: Instituição de Ensino e/ou Pesquisa ( ) Inclusão ( ) Exclusão Justificar: Empresas ( ) Inclusão ( ) Exclusão Justificar: As empresas incluídas no relatório anterior mantém seu envolvimento com o INCITO e Instituição. RESULTADOS OBTIDOS / METAS COMENTE OS 3 (TRÊS) PRINCIPAIS RESULTADOS CIENTÍFICOS E/OU TECNOLÓGICOS OBTIDOS ATÉ O MOMENTO PARA: A PESQUISA: Estudos Epidemiológicos 1. Os pacientes e familiares com cânceres particulares (segundo os projetos envolvidos no estudo) continuam a ser recrutados e os dados clínicos, história familiar e outros de relevância na investigação estão sendo coletados. As amostras biológicas são armazenadas e gerenciadas pelo Biobanco de Macromoléculas segundo normas éticas adotadas na Instituição. Como apresentado no relatório anterior, o banco de dados para integrar as informações cínicas e de pesquisa está em fase de teste. Dada a potencialidade do impacto da ocorrência de mutacões p.r337h na população brasileira e a variabilidade da doença, foi proposto o desenvolvimento de algoritmos de predição para avaliar o risco individual de cancer em portadores da mutação R337H. Usando ferramentas de bioinformática foi iniciada a integração dos dados obtidos (147 familias diagnosticadas com Síndrome Li-Fraumeni, 37 com alguma mutação em TP53) para a construção de um algorítmo que estime o risco individual de câncer estratiticado por idade. Neste período, foi criada a ontologia para a representação dos dados provenientes dos pacientes. A ferramenta de integração e criação da interface interativa para os pesquisadores encontra-se em fase de desenvolvimento. Foram investigadas diversas possibilidades de incluir a capacidade de inferência num sisitema de integração baseado em ontologias. Essa

4 capacidade é importante para mitigar o problema da heterogeidade semântica por meio de hierarquias conceituais ou regras de inferência. Como próximos passos pretende-se analisar e implementar a integração destes dados de modo a prover os pesquisadores do projeto com uma ferramenta de consulta prática e unificada. 2. O banco de soro de pacientes com carcinomas colorretais foi recentemente aprovado pelo CEP da Instituição e está em coleta de amostras. Já foram coletadas amostas de soro de 90 pacientes com melanoma. Para este tipo tumoral, as vesículas já foram purificadas e o estudo está em fase de padronização da análise proteômica nestas vesículas. Já foram coletadas amostras de 164 casos de pacientes com carcinomas de cabeça e pescoço. Estão sendo coletados os dados clínicos e histopatológicos destes pacientes antes do início dos experimentos. Biologia Tumoral 1. O projeto Síndromes de Câncer Hereditário e Agregação Familial está em fase final. Vários artigos foram publicados no período e outros encontram-se em fase final de análise dos dados e redação dos manuscritos (lista de publicações em anexo). O projeto em pacientes com a síndrome de Li-Fraumeni está concluído, com artigos já publicados, submetidos e outros em elaboração. Estão sendo finalizadas as análises referentes à investigação de alterações genômicas em tumores de mama e próstata esporádicos, manuscrito submetido e outros em preparação. Amostras pareadas de DNA tumoral e de sangue periférico de 18 pacientes conmcarcinomas de cavidade oral e de orofaringe com história de câncer na familias (cabeça e pescoço ou tumores relacionados) também foram avaliadas quando ao perfil genômico. Um subconjunto de casos pareados (sangue e tumor) compartilharam as mesmas alterações, sendo 11 classificadas como raras, sugerindo um papel potencial destas alterações na predisposição hereditária a estes tumores. Foi também realizado um recrutamento de 30 pacientes portadores de tumores com pelo menos 4 casos diagnosticados na familia e um deles em idade inferior a 50 anos. Estes casos estão sendo avaliados para mutações no gene TP53. Um outro estudo recém incluído neste tema é a análise de 20 pacientes com Sindrome de Li-Fraumeni/Li-Fraumeni-Like com ausência de mutações em TP53 e a história de multiplos tumores. Estes pacientes estão sendo avaliados para alterações genômicas (SNPs e CNVs) utilizando a plataforma 2.0K da Affymetrix. Para a Síndrome de Lynch, foram analisados 58 pacientes que preencheram os critérios de Amsterdam ou Bethesda, porém, sem mutações patogênicas nos genes MMR (MLH1, MSH2, MSH6, PMS1 e PMS2), TP53 e CHEK2. Foram identificadas 20 CNVs raras (não descritas previamente) em 17 casos. Quatro CNVs raras mapeadas em 6p11.2, 7p22.3, 11q13.2 e 14q23.1 foram detectadas independente em pelo menos quatro pacientes. Estes achados estão em fase de confirmação por outros métodos. 2. O projeto Rastreamento global de mutações no câncer hereditário por sequeciamento direto e em larga escala (exome-sequencing) continua em andamento. Foram sequenciados 146 pacientes com a S. Lynch (mutações para os genes MLH1, MSH2, MSH6, PMS1 e PMS2), 23 pacientes com polipose intestinal (AMPC, MUTYH), 63 pacientes com melanoma familiar (TP16 e P14ARF) e 194 pacientes com cancer de mama e ovário (BRCA1 e BRCA2) totalizando 426 pacientes. Deste, 117 eram portadores de mutações conhecidas, 110 apresentaram variantes de significado incerto e 199 não apresentaram mutações. Vale ressaltar que a grande maioria dos casos, além de avaliação de mutações em ponto e pequenas deleções e inserções por sequenciamento, foi também avaliado para rearranjos genômicos por MLPA. Um total de 199 pacientes negativos para mutação nos genes candidatos estão sendo investigados por sequenciamento do exoma, alguns casos em delineamento experimental baseado em famílias. Esta estratégia tem uma grande probabilidade de identificar novos genes associados a síndromes

5 hereditárias. Até o momento foram obtidos resultados de 30 pacientes cuja análise das sequencias esta sendo conduzida pelo grupo de bioinformática. 3. Este último grupo será investigado por sequenciamento do exoma. 4. No período anterior foram analisados 40 casos vinculados ao projeto Determinação do perfil de expressão no carcinoma ductal invasivo usando genes codificadores e não codificadores. No período que cobre o relatório foram avaliados outros 103 casos segundo o acometimento de linfonodos (ausência, 1-3 linfonodos e >4). Nesta comparação foram identificados 43 genes diferencialmente expressos que estão sendo validados por RT-qPCR. Além disso, foram identificados dois pares de transcritos codificantes e não-codificantes, com seus respectivos transcritos senso e antisenso, com expressão invertida sugestivo de uma regulação. Interessantemente, os pares de transcritos apresentaram diferença de comportamento nos grupos de tumores de mama segundo o status dos receptores hormonais (positivo e negativo). Os dois pares estão sendo caracterizados em detalhes. 5. Seis novas propostas foram apresentadas no período anterior e os resultados preliminares já estão sendo obtidos: (a) Isolamento e caracterização de células tronco tumorais. Uma abordagem realizada foi a obtenção de células tronco tumorais (CSC) de 7 tumores obtidos de pacientes portadores de mutações germinativas em TP53. Em um dos casos os esferóides apresentavam perfil imunoistoquímico CD44+, CD24-, Oct4+, Ki67+ e SOX2 +. Após vários ensaios (formação de colônias, diferenciação, Time-lapse, capacidade de auto-renovação e de proliferação in vitro), foi demonstrado o papel da CSC nestes tumores e que este pode ser um modelo útil para a compreeensão do papel da mutacão fundadora R337H. A segunda abordagem trata da avaliação da CSC do câncer de mama e dos mirnas que regulam sua formação e atividade, quanto a agressividade tumoral e resistência à quimioterapia. Por problemas de importação alguns reagentes chegaram em 02/2013 e os resultados obtidos são preliminares para os mirnas (knockdown). Já foram selecionados os clones que expressam altos níveis dos mirnas de interesse (mir-221, -222 e p). A avaliação da expressão dos mirnas em células aderentes e de mamosferas, com e sem transdução lentiviral foi parcialmente concluída. Os resultados mostraram que existe uma variabilidade na expressão endógena dos mirnas em estudo nas células aderentes quando comparado com mamosferas. A terceira etapa do estudo foi modificada (quantificação e separação de células com o fenótipo CD44+/CD24- /ESA+ por FACS) em função da quantidade limitada destas células nas linhagens analisadas. Foi observado um aumento da expressão do HER2 nas mamosferas quando comparadas com as células aderentes nas linhagens MCF-7 e SKBR3, o que sugere um possível papel de HER2 na regulação de célulastronco tumorais. (b) A análise por RNAseq do transcriptoma de carcinomas de próstata (CaP) é baseado em sequenciamento de alto rendimento da porção 3' dos transcritos para avaliar as diferenças de expressão gênica em casos com escore de Gleason 7 com e sem recidiva bioquímica. Foram selecionadas 21 CaP sendo 10 pacientes com e 11 pacientes sem recidiva bioquímica, e duas amostras de hiperplasia prostática benigna. Dentre os genes diferencialmente expressos, NFKBIZ e BRP44 foram mais expressos no grupo de pacientes sem recidiva. Estes genes foram validados por RT-qPCR com significância estatística e com probabilidades de 87,53% e 83,41% de serem mais expressos no grupo sem recidiva pelo método de probabilidades. Não foi verificada associação estatística entre a expressão das proteínas e sobrevida livre de recidiva bioquímica. Será realizado o sequenciamento das bibliotecas nas plataformas Illumina e Ion PGM para aumentar a confiabilidade da análise dos dados

6 globais. Sequenciamento de exoma de tumores esporádicos. Os critérios de inclusão do projeto Rastreamento global de mutações em carcinomas orais e de orofaringe em pacientes jovens por sequenciamento do exoma incluem pacientes com diagnóstico destes tumores com idade igual ou inferior a 45 anos, sem tratamento quimioterápico ou radioterápico prévios à obtenção das amostras, disponibilidade de material (DNA tumoral e sangue periférico) e informações clínicas e patológicas completas. Com base nestes critérios foram obtidas 18 amostras de tumores (10 de cavidade oral e 8 de orofaringe) e de sangue periférico dos mesmos pacientes. Os casos foram genotipados para o virus do papiloma humano (HVP) sendo 6 deles positivos. O projeto foi aprovado no CEP e os reagentes já foram adquiridos. A próxima etapa é a construção das bibliotecas e sequeciamento pelo plataforma Illumina HiSeq. O Sequenciamento de exoma de tumores esporádicos de mama está sendo desenvolvido em tumores triplo negativos (TN) de mulheres jovens (<35 anos) segundo a presença ou ausência de mutação em BRCA1. Estão sendo analisadas amostras de sangue periférico, tecidos mamários normais e tumorais por sequenciamento do exoma utilizando a plataforma SOLID/Life technologies em 4 pacientes não portadoras e 2 portadoras de mutação germinativa no gene, totalizando 18 amostras. Os resultados obtidos estão sendo analisados. No projeto Sequenciamento de exoma de tumores de próstata Gleason 7 com ou sem recidiva bioquímica nosso objetivo é identificar painéis de mutações somáticas associadas com risco de recidiva. Nossa proposta é utilizar os mesmos casos usados no projeto de RNAseq (projeto b). Neste momento os DNAs foram isolados e as bibliotecas estão sendo construídas. (c) O projeto referente a Análise do metiloma em carcinomas de tireoide deverá ser iniciado no segundo semestre de Neste período foram selecionadas 94 amostras que foram histopatologicamente confirmadas com o diagnóstico de carcinoma papilífero de tireoide (CPT). Todos os casos foram avaliados para mutações em BRAF e KRAS. Um subconjunto destas amostras segundo o padrão de mutações detectado será avaliado quanto ao perfil global de metilação. Uma pesquisadora recentemente vinculada ao INCT em Oncogenômica (Claudia A Rainho) desenvolverá este estudo. Foi também avaliado o padrão de expressão gênica global em 57 destes CTP e 9 tecidos adjacentes normais utilizando a plataforma 8x60K (Agilent Technologies Inc.). Foram identificados 715 genes diferencialmente expressos. Os maiores níveis de expressão dos CTP foram observadas para GABRB2, CLDN10, KLK7, HMGA2 e HPCAL4 e menores para MYOC, GLDC, SEMA3D, TFF3 e LRP1B. A lista gerada com 715 genes foi comparada com banco de dados públicos (GEO e TGCA Portal), confirmando o envolvimento de 589 genes. Uma análise de vias canônicas destacou a via de ativação de RXR/TR, sugerindo uma diminuição da responsividade ao hormônio tireoidiano. Os dados de expressão gênica serão integrados aos do metiloma. (d) O projeto Sequenciamento total do genoma de pacientes com carcinomas de mama e tireóide foi modificado para análise de sequenciamento do exoma destas pacientes. Os critérios de inclusão foram revisados e alterados para: probando que tenha desenvolvido câncer de tireoide (não medular) e/ou câncer de mama, sincrônicos ou metacrônicos e que possuam histórico familial dos tumores; com pelo menos dois familiares de primeiro ou segundo grau que tenham sido afetados com um dos dois tumores e pelo menos um dos casos com idade inferior a 45 anos ou que tenham pelo menos 1 familiar que tenha desenvolvido um dos tumores, sendo que este paciente e o probando devem ter desenvolvido os tumores antes dos 40 anos e haver outros tumores em outras

7 gerações que não aquela acometida por CM e CT (não medular) e/ou haver um indivíduo do sexo masculino acometido por CT (não medular); quando tumor de mama precedente ao tumor de tireoide não ter sido tratada com radioterapia. Segundo esses critérios foram convocados e incluidos no estudo 22 pacientes. As bibliotecas já foram geradas e o sequenciamento sera realizado no equipamento HiSeq (Illumina) com uma cobertura de 140X. (e) Metagenômica e Câncer Colorretal. Utilizando métodos de metagenômica, baseados no seqüenciamento em larga-escala de fragmentos do gene 16SrDNA, está sendo avaliada a microbiota bacteriana intestinal associada ao epitélio intestinal em lesões tumorais de câncer de reto, a qual será contrastada com a microbiota não-tumoral do reto, avaliada por colonoscopia. Será também investigado o papel das bactérias colônicas na resposta quimio- e radioterápica em câncer de cólon, em material obtido por biópsia pré-tratamento, contrastando a microbiota com a eficiência do tratamento. Foram obtidas 21 amostras controles e 20 de carcinomas de reto para a análise metagenômica da microbiota bacteriana associada epitélio intestinal. A PCR foi padronizada com iniciadores que flanqueiam e permitem amplificar a região V1 do gene codificador do 16S-rDNA. Foi utilizado o sequenciador Ion Torrent. As sequências obtidas encontram-se em análise (QIME - Quantitative Insights Into Microbial Ecology - Caporaso et al., 2010). Estudos Funcionais 1. Geração de linhagens celulares com expressão de proteínas fluorescentes ou bioluminescentes para avaliação de candidatos gerados de estudos prévios. Como experimento preliminar, as células U87MG foram transfectadas com um vetor de expressão de luciferase sendo selecionadas as células que expressam a proteina. Estas células foram xenotransplantadas ortotopicamente. Análises usando o sistema Carestream Kodak Multispectral FX System de quimioluminescência mostraram que o sistema é capaz de detectar a luminescência vinda das células implantadas no cérebro de camundongo. Isso permitirá o acompanhamento do crescimento do tumor em tempo real sem a necessidade de sacrificar o animal. Esta estratégia será aplicada em outros estudos do grupo. 2. Um estudo realizado pelo grupo mostrou que STI1/HOP é secretada em vesículas extracelulares de diferentes tamanhos e com origem em corpos multivesiculares. STI1/HOP localiza-se na face externa destas vesículas o que permite sua interação com a proteína príon (PrPC). A sinalização mediada pela STI1/HOP presente em vesículas extracelulares é 5 vezes mais potente que aquela mediada pela proteína recombinante (Hajj et al. Cell Mol Life Sci Epub Mar 31). Além disso, mostramos a relevância da interação PrPC-STI1 no crescimento de glioblastoma multiforme in vivo. Este efeito foi bloqueado por um peptídeo que inibe a interação entre as duas moléculas, mostrando que este complexo representa um alvo terapêutico importante no tratamento de GBMs. A expressão de PrPC e STI1/HOP foi ainda avaliada em uma série de 205 casos de tumores de cólon. Os resultados apontam que a expressão destas proteínas está correlacionada a maior invasão sanguínea, linfática e neural. De acordo com estes dados, ensaios in vitro usando-se linhagens celulares de tumores de cólon humano mostraram que STI1/HOP é capaz de induzir a migração dependente de PrPC. Juntos, estes dados apontam que o complexo PrPC-STI1/HOP pode ser um alvo relevante para o tratamento de tumores colorretais. 3. Encontra-se em andamento a análise funcional das isoformas proteicas não classificáveis (UV) de MLH1 e MSH6 obtidas no neste projeto. Entre os 36 pacientes com Síndrome de Lynch portadores de UVs, quatro foram selecionados para análise funcional. Para os ensaios funcionais das UVs selecionadas, os genes

8 MLH1 e MSH2 foram clonados em vetor de expressão pcdna3.1 HisA. A clonagem direcional dos genes foi avaliada por sequenciamento direto dos vetores e análise de restrição. Os vetores contendo os genes MLH1 ou MSH2 selvagens foram utilizados como molde para a mutagênese sítio-dirigida. Os vetores contendo as mutações foram construídos e confirmados por sequenciamento. As linhagens de adenocarcinoma de cólon humano HCT-116 (MLH1-/-) e LoVo (MSH2-/-), foram transitoriamente transfectadas, com o vetor de expressão contendo o inserto selvagem, o inserto com as variáveis não classificáveis ou o vetor vazio. Os níveis de expressão e os tamanhos corretos das proteínas ectópicas foram avaliados em gel de SDS-poliacrilamida 10% (SDS-PAGE) e análise de western blotting. A quantidade de proteína naturalmente expressa, β-tubulina, foi utilizada como controle de carregamento quando os níveis de expressão das variantes produzidas foram comparados. Os vetores MLH1 e MSH2 selvagem foram construídos sendo confirmados por sequenciamento direto. A expressão das proteínas recombinantes foi avaliada por SDS-PAGE e western blotting após a transfecção transitória das linhangens de colon terem sido selecionadas. No próximo período será avaliada a localização subcelular das UVs construídas por imunofluorescência indireta e a interação proteína-proteína por imunoprecipitação.a atividade de reparo será examinada in vitro com a construção de substratos contendo erros de pareamento. 4. ANRASSF1 ncrna em câncer de próstata. O objetivo deste estudo é caracterizar estrutural e funcionalmente um novo lncrna antisenso intrônico, identificado como sendo transcrito em câncer de próstata em uma região intrônica do locus do gene supressor de tumor RASSF1A, na fita oposta ao gene codificador de proteína. Este lncrna foi denominado ANRASSF1, de transcrito antisenso noncoding RASSF1. Usando técnicas de biologia molecular e celular, incluindo superexpressão ou silenciamento do lncrna ANRASSF1, além de técnicas de ChIP-PCR e RNA-IP PCR, foi identificado que este novo lncrna ANRASSF1 afeta exclusivamente a expressão da isoforma RASSF1A, sem causar efeito na expressão de RASSF1C. Nossos resultados mostram um novo mecanismo de repressão epigenética altamente locus-específico, envolvendo um lncrna antisense daquele locus. Estes dados sugerem que centenas de outros lncrnas não-spliced transcritos no genoma humano, e ainda não caracterizados, possam exercer um papel regulador locus-específico. Os dados apontam também para a importância de estudar em mais detalhes o possível envolvimento do aumento da expressão do lncrna ANRASSF1 com a tumorigênese. Ensaios Clínicos 1. Estudo prospectivo não randomizado fase II para identificação de marcadores de resposta à quimioterapia neoadjuvante e associação de radioterapia e cetuximab em pacientes com carcinoma epidermóide (CEC) de orofaringe. O estudo encontra-se em fase final de validação dos resultados. A análise de genotipagem do HPV mostrou que o subtipo HPV16 era o mais frequente (16/18 casos positivos). Os pacientes HPV negativos apresentaram menor taxa de sobrevida comparada aos pacientes positivos (log-rank test, p=0,036), confirmando dados da literatura. Ganhos em 3q26.31 e 11q13.2, e perdas em 9p21.3 foram exclusivamente encontrados no grupo HPV negativo (p<0,05).perdas genômicas em 8p p11.22, 14q11.1-q11.2, 15q11.2 e ganhos em 11q13.2 e 11q13.2-q13.3 (p<0,05) foram os mais significativos entre os casos estudados. Amplicons mapeados em 11q13.2 e 11q13.2-q13.3 foram considerados como raros (não presentes em outros bancos de dados genômicos). A análise genômica foi capaz de revelar ganhos genômicos capazes de distinguir os pacientes respondedores (RC, RP>50%) dos não-respondedores (RP<50%, DE e DP) ao tratamento. A análise de expressão de transcritos na mesma casuística quando da comparação a resposta global ao

9 tratamento (respondedores vs não-respondedores) ao revelou 14 genes diferencialmente expressos, sendo 7 com diminuição (DENND4A, C5, COBL, TRAPPC2, DYNC1I1, TP53TG3 e ZP3) e 7 com aumento de expressão (ACOT4, DDOST, GMEB1, NPTXR, ZFYVE9, ZNF545 e PRSS2). A análise integrada dos dados genômicos e transcriptômicos revelou 82 moduladores, sendo observada correlação positiva em 57 deles. A análise funcional in silico utilizando Ingenuity Pathway Analysis (IPA v8.0 Ingenuity Systems ( dos 57 moduladores gerou 5 redes principais sendo a principal delas associada a modificação pós-transcricional de RNA. 2. Identificação de preditores moleculares de resposta a radioquimioterapia neoadjuvante em pacientes com adenocarcinomas de reto. Este projeto já tem recrutado os 100 casos propostos para o estudo em colaboração com um dos parceiros do INCITO, MD Anderson Cancer Center, USA. Serão realizadas análises de rastreamento de mutações por sequenciamento do exoma com o objetivo de identificar marcadores moleculares de resistência ao tratamento radioquimioterápico. Atualizar 3. Estudo de fase I de 18F-fluoroacetato de sódio (18F- FAc) como um agente de imagem PET para a detecção tumoral (carcinoma de próstata e mama). Este trabalho tem o objetivo de apresentar os resultados dos estudos do 18F-FAc sobre toxicidade sistêmica (aguda/subaguda) e crônica, além da toxicidade reprodutiva, mutagênica e carcinogênica. Este estudo demonstrou a relação dose/resposta após a administração de uma única dose no teste de toxicidade aguda e múltiplas doses para o teste de toxicidade subaguda, possibilitando a comprovação da segurança do radiofármaco no seu uso clínico, além do estudo em animais inoculados com células tumorais de mama (MDA-MB-231) e de próstata (PC3). O 18F-FAc deverá ser sintetizado em módulo automatizado, utilizando O-mesil-glicolato de etila como precursor. A solução final será purificada por uma membrana de 0,22µm (Millipore), seguida pelos controles de qualidade radioquímico, químico, radionuclídico, estabilidade e estudos em animais do 18F-FAc inoculados com tumor. B FORMAÇÃO DE RECURSOS HUMANOS: O INCT em Oncogenômica tem contribuído para a formação de recursos humanos em áreas estratégicas da saúde desenvolvendo projetos de excelência na área. No período de 2009 a 2013 foram concluídas 230 defesas de dissertações de mestrado e teses de doutorado no Programa de Pós Graduação em Ciências (Oncologia) da Fundação Antonio Prudente, Hospital do Cancer AC Camargo., SP. Todos os pesquisadores vinculados ao INCITO desta Instituição atuam como orientadores do núcleo permanente deste Programa. No periodo de 2009 a 2013, 57 alunos concluíram seus projetos de Mestrado e Doutorado vinculados aos projetos INCITO neste programa de PG. Além dos alunos de mestrado e doutorado, 17 pósdoutorandos desenvolvem seus projetos nas temáticas do INCITO. Outros pesquisadores vinculados ao INCITO e de outras Instituições tambem formaram RH na temática do projeto (resumo dos dados na planilha abaixo). C TRANSFERÊNCIA DE CONHECIMENTO E TECNOLOGIA: Como apresentado no relatorio anterior, a partir dos resultados obtidos no projeto INCITO assim como dados da literatura, foi inserida na rotina (Departamento de Anatomia Patológica) a genotipagem do papilomavírus humano (HPV) em carcinomas de orofaringe. Nossos dados demostraram que pacientes HPV negativos apresentaram menor taxa de sobrevida comparada aos pacientes positivos. Esses dados demonstram a necessidade de desenvolvimento de estratégias terapeuticas distintas para estes dois grupos de pacientes. A análise de mutações em genes de predisposição para as diferentes Síndromes associadas

10 ao câncer incluindo BRCA1, BRCA2, CHEK2, TP53, MLH1, MSH2, MSH6, PMS1, CDKN2A, APC, KRAS, MUTYH, EGFR e BRAF é aplicada como ensaios de rotina para os pacientes atendidos no ambulatório de Oncogenética e necessitam destes testes para diagnóstico. Desde que os testes genéticos para genes de predisposição ao câncer foram implementados para a rotina clínica do Hospital AC Camargo, em dezembro de 2009, foram realizados 302 testes. Em relação aos testes moleculares em tumores sólidos para a avaliação da predição de resposta à terapia alvo foram estabelecidos os testes para mutações em ponto específicas em diferentes genes (KRAS, EGFR, ckit, PDGFRa) e análise de metilação em regiões promotoras do MGMT. O ensaio de instabilidade de microsatélites (MSI) para casos com carcinomas colorretais também foi disponibilizado no serviço. Outros testes que incluem sequenciamento genômico completo, do exoma completo, de painéis de genes tanto para avaliação de mutação somática para diferentes tumores sólidos, como para avaliação de mutações em genes de predisposição para as diferentes síndromes relacionadas ao câncer, foram estabelecidos e estarão disponíveis nos próximos dois meses para os pacientes. Grande parte desses avanços foi conseguido graças ao financiamento nos projetos financiados pelo INCITO. Ensaios de novas proteínas na prática diagnóstica também já foram incluídos na rotina como a investigação da claudina 7, entre outros. Ensaios de hibridação in situ fluorescente e CISH foram implementados e são realizados para uma grande quantidade de genes tendo sido inseridos na rotina diagnóstico do Hospital AC Camargo. Potenciais candidatos selecionados dos resultados obtidos do INCITO e que estão em fase de confirmação e validação dos dados tem potencial para serem incluídos na rotina diagnóstica. Como um exemplo, encontra-se o amplicam mapeado em 11q em carcinomas de orofaringe que tem potencial para dsitinguir entre respondedores e não respondedores ao tratamento quimioterápico. Outro potencial achado que pode resultar em um marcador util ao tratamento foi o encontrado em carcinomas papilíferos da tireoide onde foi demonstrada a ativação de RXR/TR, a qual pode resultar na diminuição da responsividade ao hormônio tireoidiano. No período, foi realizada a visita a Fundação Centro de Controle de Oncologia do Estado do Amazonas FCECON de Manaus, Amazonas e Instituto do Cancer do Ceará - Escola Cearence de Oncologia (programa Dinter-Minter com o PG em Ciências-Oncologia, Hospital do Cancer AC Camargo) para avaliação da possibilidade de implantação do Serviço de Oncogenética nestes locais. D EDUCAÇÃO E DIVULGAÇÃO DA CIÊNCIA: 1. Curso para professores e alunos da rede pública: a primeira versão do curso de oncologia para professores e alunos da rede pública está agendada para os dias 16 e 17 de maio de 2013 nas dependências do Hospital A.C.Camargo, São Paulo. Em uma parceria com a Secretaria Estadual de Educação foram selecionados professores e alunos representantes de 32 escolas de período integral do Estado, espalhadas pelas cidades de Araraquara, Caieiras, Capivari, Itapevi, Jundiaí, Pindamonhangaba, Santo André, São José do Rio Preto, São Paulo, São Vicente e Sumaré. O curso será ministrado em dois dias e apresentará conceitos básicos da biologia do câncer, aspectos de prevenção e fatores de risco associados aos tumores mais frequentes na população brasileira, tumores genéticos e aspectos da oncogenética; sempre com o objetivo de promover o raciocínio crítico sobre a doença e buscando subsídios para replicação desses conhecimentos.

11 2. Exposições: Desde sua concepção, as exposições Câncer: conhecer para prevenir e O caminho da fumaça, foram montadas em mais de 50 espaços diferentes, como parques, estações de trens e metrô, clubes, shoppings e hospitais. Estima-se que 25 milhões de pessoas passaram pelas mostras e cerca de 5 milhões tenham conhecido ao menos parte dos painéis, que têm ilustrações coloridas, linguagem lúdica e educativa, acessível a qualquer público e abordam conceitos de biologia celular e molecular, genética e genômica do câncer, os principais fatores de risco, formas de prevenção e diagnóstico precoce da doença, além dos males do tabagismo. Em 2012, as exposições circularam por três unidades do Centro Educacional Unificado (CEU), localizados em regiões periféricas da cidade de São Paulo (Penha, de 14 a 28/9; São João Clímaco, de 28/9 a 19/10; e Jaçanã, de 19/10 a 12/11). A nova proposta estratégica da campanha em escolas - visa aproximar o conteúdo informativo sobre câncer dos alunos da rede pública e da comunidade local que, na ocasião, participaram de atividades elaboradas e monitoradas por enfermeiros especializados. A mostra foi montada, ainda, no Hospital Geral de Grajaú (entre 23/11/2012 e 3/12/2012), para o público local; como parte das atividades da Feira Empírika, no Memoral da América Latina, SP, entre os dias 22 e 26 de outubro; no Conjunto Nacional (em março/2012) e no Shopping Frei Caneca, em São Paulo, entre 19 de junho e 4 de julho de Atividade interativa PTC: Idealizada em 2008, esta atividade didático-científica apresenta noções de variação genética entre indivíduos e sua relação com a suscetibilidade a doenças, como o câncer. Os alunos de mestrado e doutorado da Instituição são envolvidos na organização e realização de dois testes (fenotípico e genético) que analisam o polimorfismo do gene TAS2R38 (PTC), que codifica a percepção do sabor amargo; em uma iniciativa de apresentar conceitos de forma lúdica. Nesse sentido, o INCITO montou um estande na Empírika - Feira Ibero-americana de Ciência, Tecnologia e Inovação - ( realizada entre os dias 23 e 25 de outubro de 2012, na Expo Barra Funda, em São Paulo (um evento da Universidade de Salamanca/Espanha), e realizou, nos três dias de evento, 300 testes genéticos (de saliva) e mais de 600 testes fenotípicos. A atividade atraiu a atenção dos adolescentes, principal público da feira, que aconteceu junto com a Feteps - Feira Tecnológica do Centro Paula Souza por onde passaram mais de 20 mil visitantes. Os resultados dos testes genéticos foram enviados por aos participantes, visando manter o interesse dos participantes no assunto. 4. Encontro com especialistas: Esta atividade ilustra o compromisso da Instituição com a difusão de informações sobre a importância da prevenção e do diagnóstico precoce do câncer. Entre abril de 2012 e de 2013 foram realizados 12 encontros com especialistas, um por mês, com palestras e conversas com profissionais da Instituições sobre os temas de saúde da mulhere do homem. Também foram abordados temos relacionados a cânceres do intestino, pele, tireóide e ossos assim como abordagens relacionadas ao diagnóstico precoce, entre outros, com público de mais de 2 mil pessoas, no total. 5. Campanha de prevenção: Atrelado ao compromisso de estabelecer conceitos de prevenção de câncer são realizadas campanhas de prevenção e diagnóstico precoce da doença em comunidades específicas, que não têm acesso a rede privada de atendimento. Em 2012, foram realizados atendimentos médicos e exames preventivos e foram confirmados 159 diagnósticos de câncer cujos pacientes foram admitidos para tratamento no Hospital AC Camargo, SP. 6. Comitês interdisciplinares: Os comitês interdisciplinares criados, denominados Comitês de Medicina Personalizada reúnem especialistas das áreas de oncologia clínica, oncogenética, cirurgia, patologia convencional e molecular e pesquisa básica que se encontram periodicamente para alavancar a medicina personalizada, reduzindo a distância

12 entre os resultados da bancada e sua aplicação para o paciente. Dos encontros realizados com cada equipe (são 12 grupos no total), em média um encontro por bimestre, têm surgido ideias e desenhos de novos projetos, com integração multidisciplinar. 7. Comunidade científica, acadêmica e profissionais de saúde: As atividades acadêmicas propostas nessa área visam estimular a troca e a transferência horizontal de resultados gerados pelos projetos do INCiTO com pesquisadores e estudantes de instituições nacionais e internacionais. Entre 30 de setembro e 7 de outubro de 2012 aconteceu, em Águas de São Pedro, São Paulo, o São Paulo Advanced School of Comparative Oncology (ESPCA) um encontro para consolidar e expandir a pesquisa básica e aplicada de câncer em oncologia comparada no estado de São Paulo. Na ocasião, 32 palestrantes de diferentes países, incluindo Brasil, Canadá, França, EUA, Japão, Holanda, Alemanha, Finlândia e Reino Unido e mais de 100 inscritos se reuniram para estabelecer redes de contatos com pesquisadores que trabalham com câncer em humanos e animais. Um artigo sobre a ESPCA foi publicado na BMC Proceedings (2013, 7(Suppl 2):A1 doi: / s2-a1). Um evento realizado semanalmente denominado Seminário de Pesquisa Básica, reuniu em 2012, 25 apresentações de estudantes e pesquisadores que apresentaram resultados de projetos científicos (40% deles relacionados ao INCITO). O Biobanco do Hospital AC Camargo recebeu nove visitas técnicas monitoradas, de pesquisadores e estudantes de pós-graduação de instituições de São Paulo, Campinas, Botucatu, Belo Horizonte, Mato Grosso, Rio Grande do Norte e Bahia além dos pesquisadores internacionais que participaram do evento ESPCA. 8. Curso de aprimoramento de inglês científico para a formação de professores: O curso de comunicação científica para formação de professores é um programa inovador que rapidamente prepara instrutores para ensinar comunicação científica adequada em inglês. O curso foi resultado de uma parceria com o MD Anderson Cancer Center e Fulbright Fundation com o objetivo de disseminar amplamente os princípios e práticas do discurso científico em inglês, para que os cientistas brasileiros possam participar efetivamente em publicações internacionais e apresentações de suas descobertas científicas. Uma professora altamente capacitada, Dra. Carrie Cameron, instrutora do Departamento de Epidemiologia e diretora associada do programa de Prevenção do Câncer, do MD Anderson Cancer Center, proferiu o curso com duas horas diárias durante três semanas. Participaram do treinamento 28 pesquisadores e alunos de pós-graduação. Desse total, oito fizerem o curso como instrutores, com o comprometimento de multiplicar o conteúdo de forma contínua para os demais integrantes do CIPE - nosso Centro de Pesquisa. 9. Reunião com outros INCTs: Liderado pelo INCITO, 27 INCTs de diferentes áreas como saúde, biotecnologia, nanotecnologia, meio ambiente, células-tronco, fisiologia, educação e outras, se reuniram no dia 19 de abril de 2013, no Anfiteatro do Hospital A.C.Camargo, em São Paulo. O encontro segue a filosofia do programa, que é a de mobilizar e agregar, de forma articulada com atuação em redes, os grupos de pesquisa em áreas estratégicas e de fronteira da ciência, para que estabeleçam parâmetros para novas parcerias. Participaram do evento pesquisadores dos estados do Rio de Janeiro, Minas Gerais, Rio Grande do Sul, Paraná, Santa Catarina, Ceará, Pernambuco, do Distrito Federal e de São Paulo. 10. Divulgação na Mídia: Houve um aumento de mais de 100% no total de notícias publicadas nas mídias impressa (1205 matérias em revistas e jornais) e eletrônica (139 em TV, rádio e Internet) quando somadas e comparadas com os resultados de No total, foram 1344 notícias relacionadas ao câncer que incluíram a equipe do projeto. Há, ainda, uma campanha de mídia desenvolvida em parceria com a JWT, que está em fase final e deve ir ao ar em breve.

13 11. Disciplina de Pós-Graduação em Oncogenética é coordenada por três pesquisadores do projeto INCITO (Erika Maria Monteiro Santos, Maria Isabel W Achatz e Silvia Regina Rogatto). Foi aprovada pelo Conselho de Pós-graduação do Curso de Pós-graduação Strictu Sensu da Fundação Antônio Prudente. Foi ministrada no período de Outubro de 2012 a Dezembro de 2012, com duração de 72 horas, correspondendo a seis créditos no programa, com 13 alunos participantes. 12. A disciplina de Enfermagem em Oncogenética tem duração de 10 horas, e em 2012 a disciplina foi oferecida em duas ocasiões (para a 16ª turma do curso de especilização em março de 2012; para a 17ª turma em maio de 2012), o que correspondeu a 102 alunos participantes. O material didático referente a disciplina é disponibilizado aos alunos no ambiente de Ensino à Distância gerido pelo Hospital AC Camargo,SP. ENUMERE OS ATÉ 03 (TRÊS) PRINCIPAIS IMPACTO(S) CAUSADO(S) PELAS AÇÕES E RESULTADOS DO PROJETO PARA A AMPLIAÇÃO, MELHORIA E CONSOLIDAÇÃO DA COMPETÊNCIA TÉCNICO-CIENTÍFICA NACIONAL PARA: A PESQUISA: 1. Os ensaios moleculares em famílias com história familial de câncer revelou várias alterações genômicas com potencial para contribuir para o aumento do risco na Síndrome de cancer de mama e ovário hereditária, Síndrome de Li-Fraumeni e Síndrome de Lynch. Vários artigos foram publicados em periódicos de impacto relevante na área. 2. Alguns projetos já resultaram em dados de alta relevância como a descrição assinaturas de transcritos codificadores e não codificadores em cânceres de mama e próstata e de resposta ao tratamento em carcinomas de orofaringe 3. Os novos projetos utilizando estratégias de sequenciamento de alto desempenho apresentados no período anterior resultaram em dados preliminares. Um deles, utilizando RNAseq em carcinomas de próstata demonstrou que os genes NFKBIZ e BRP44 são candidatos a marcadores em pacientes sem recidiva. B FORMAÇÃO DE RECURSOS HUMANOS: O INCT em Oncogenômica permitiu que 57 alunos desenvolvessem e concluíssem seus projetos de Mestrado e Doutorado. Vinte e nove alunos de mestrado e doutorado e 17 pósdoutorandos desenvolvem seus projetos nas temáticas do INCITO. Esse número é muito maior se considerado os colaboradores externos a Instituição. Foram publicados no período um total de 65 artigos com um expressivo número envolvendo alunos e pesquisadores internacionais. C TRANSFERÊNCIA DE CONHECIMENTO E TECNOLOGIA: 1. disponibilização de testes genéticos para avaliação de genes de predisposição em famílias com risco de desenvolvimento de câncer (síndromes de câncer familial triadas por serviço de Oncogenética). 2. Disponibilização de outros testes como genotipagem do HPV para pacientes com câncer oral ou de orofaringe. 3. Grande envolvimento da equipe para a criação de Serviços de Oncogenética em dois estados brasileiros: Ceará e Amazonas. D EDUCAÇÃO E DIVULGAÇÃO DA CIÊNCIA: 1. Inúmeras atividades foram desenvolvidas no período para a divulgação da ciência

14 incluindo as campanhas de prevenção as quais atraíram um grande número de pessoas assim como a campanha anti-tabagismo coordenada pelo Dept de Cirurgia de Cabeça e Pescoço. 2. Curso para professsores e alunos da rede pública numa parceria com o governo do estado de São Paulo; 3. Exposições e atividades interativas com a população (atingindo um número muito elevado de pessoas), disciplinas ministradas na pós-graduação, reunião com os demais INCTs da área da Saúde e correlatos. PARA FINS DE DIVULGAÇÃO, RELACIONAR RESULTADOS OBTIDOS QUE MEREÇAM DESTAQUE PARA O DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO, TECNOLÓGICO E/OU SOCIAL: RESULTADOS EM NÚMEROS OBS.: Os Currículos Lattes dos pesquisadores do INCT devem estar atualizados com relação às publicações e aos bolsistas, de onde serão coletados pelo CNPq os dados de publicação científica e de orientação. A INDICADORES DE PESQUISA NÚMEROS DA PRODUÇÃO TÉCNICO-CIENTÍFICA E ARTÍSTICA NO PERÍODO (anexar referências): TIPO SOFTWARE - PATENTE - PRODUTOS - PROCESSOS - PRODUÇÃO ARTÍSTICA (ESPECIFICAR) - Alunos de Iniciação Científica 4 Alunos de Mestrado 14 Alunos de Doutorado 15 Alunos de Pós-Doutorado 17 Artigos Publicados 65 Artigos Submetidos 7 Artigos em Preparação 15 Conferências 10 Poster em Eventos 25 Apresentações orais em Eventos 8 Prêmio 3 QUANTIDADE B INDICADORES DE TRANSFERÊNCIA DE CONHECIMENTO E TECNOLOGIA NÚMEROS DA PRODUÇÃO NO PERÍODO (especificar e anexar referências): TIPO Testes de genotipagem do HPV em carcinomas orais e de orofaringe 70 QUANTIDADE

15 Análise de mutações em genes de predisposição para as diferentes 302 Síndromes associadas ao câncer incluindo BRCA1, BRCA2, CHEK2, TP53, MLH1, MSH2, MSH6, PMS1, PMS2, CDKN2A, APC, KRAS, EGFR e BRAF ( ) Implantação dos testes de mutação em ponto para os genes KRAS, Em início EGFR, ckit, PDGFRa e análise da região promotora do gene MGMT Testes da Claudina 7 15 Ensaios de FISH e CISH para marcadores moleculares identificados no projeto Visita para estabeleciamento de cooperação para a implantação do serviço de Oncogenética em Manaus, Amazonas e em Fortaleza C INDICADORES DE EDUCAÇÃO E DIVULGAÇÃO DA CIÊNCIA NÚMEROS DA PRODUÇÃO NO PERÍODO (especificar e anexar referências): TIPO Curso para professores e alunos da rede publica Disciplina de Pós-Graduação Stricto Sensu 1 Disciplina de Pós-Graduação Lato Sendu 1 Curso de Educação à Distância 2 Exposições Conversando com Especialistas QUANTIDADE 1 (70 professores + 30 alunos) 50 (5 milhões de pessoas) 12 (> 2000 pessoas) Campanha na Mídia Impressa: 1205; eletronica: 139 Organização de Evento Advanced Sao Paulo School of Comparative Oncology 1 (> 100 pessoas, 32 palestrantes internacionais) Atividades Interativas PTC) - Feira Ibero-americana de Ciência, 300 testes Tecnologia e Inovação Campanhas de prevenção ao Câncer atendimentos, 159 diagnósticos de câncer Comitês Interdisciplinares 6 Seminário de Pesquisa Básica Visitas técnicas monitoradas ao CIPE/ Banco de Amostras Curso de aprimoramento em inglês em parceria com MD Anderson 1 Cancer Center (28 inscritos- efeito multiplicador, 30 horas) Reunião com outros 27 INCTs (8 horas) 1 Semanais 25 apresentações Inúmeras (mínimo 1/semana) INFORMAÇÕES ADICIONAIS FORMAS DE DISPONIBILIZAÇÃO PÚBLICA DOS RESULTADOS DO PROJETO: Os artigos resultantes dos projetos são publicados em periódicos de excelência na área e estão, em sua maioria, disponíveis no Portal CAPES. O material de divulgação dos resultados realizados pela FAPESP e CNPq são de acesso livre a todos os interessados. Os relatórios apresentados as Agências de Fomento, CNPq e FAPESP, são disponibilizados no website do Hopsital AC Camargo com link para o INCITO ( As campanhas e exposições realizadas pelo grupo contem também material informativo sobre o estudo. Uma parcela significada dos resultados obtidos neste projeto são divulgados na mídia escrita ou falada. No total, foram publicadas 1205 matérias em revistas e jornais e139 em TV, rádio e Internet.

16 COMENTE AS PRINCIPAIS MELHORIAS IMPLANTADAS NAS INSTALAÇÕES FÍSICAS DA SEDE E DOS LABORATÓRIOS ASSOCIADOS AO INSTITUTO, COMO ADPTAÇÕES FÍSICAS, EQUIPAMENTOS, ETC.: O INCITO utiliza a estrutura física do CIPE Centro Internacional de Pesquisa do Hospital AC Camargo, SP inaugurado em A infra-estrutura dos laboratórios de pesquisa é de referência internacional contendo uma organização estrutural baseada em bancos de tecidos e de macromoléculas, patologia investigativa, escritório de projetos, apoio técnico em todos laboratórios, pessoal especializado e de apoio para o uso de equipamentos como sequenciadores de alto desempenho, reparo de equipamentos, secretarias, biblioteca, acesso a periódicos online, internet de bom desempenho, pessoal especializado em análises de bioinformática, biotérios e laboratórios de segurança para pesquisa em linhgens celulares e animais. Neste ano de 2012 foram adquiridos dois novos equipamentos de grande porte, o sequenciador Ion Torrent e o CytoScan (Affymetrix). Essa infra-estrutura de excelência atende um grande número de pesquisadores e alunos do Programa de PG em Ciência (Oncologia), Hospital AC Camargo, alguns alunos do Programa de Ciências Biológicas (Genética), do IB- UNESP (em parceria com o INCITO), Instituto de Química Depto de Bioquímica USP-SP, Hispital do Cancer do Ceará no programa Dinter/CAPES além de outros colaboradores que frequentemente utilizam a infra-estrutura dos laboratórios do CIPE em projetos de parceria em pesquisa. HOUVE ATIVIDADES DE INTEGRAÇÃO COM OUTROS INCT s: ( X ) SIM ( ) NÃO EM CASO POSITIVO COMENTAR: Como apresentado acima foi organizada uma reunião, liderada pelo nosso grupo, com a participação de 27 INCTs de diferentes áreas como saúde, biotecnologia, nanotecnologia, meio ambiente, células-tronco, fisiologia, educação e outras no dia 19 de abril de 2013, no Anfiteatro do Hospital A.C.Camargo, em São Paulo. Foi uma excelente oportunidade para identificar parcerias e colaboração em pesquisa. A parceria ja estabelecida entre os INCTs incluem os grupos já descritos no relatorio anterior: INCT de Controle do Câncer- INCA, Coordenador: Hector Nicolas S. Abreu; INCT de Doenças do Papilomavírus (HPV) FCMSCSP, Coordenador: Luisa Lina Villa; INCT de Genética Médica Populacional- INAGEMP, Coordenador: Roberto Giugliani; INCT em Neurociência Translacional - INNT, Coordenador Esper Abrão Cavalheiro INCT de Óptica e Fotônica INOF, Coordenador: Vanderlei Salvador Bagnato. INCT de Bionalítica, UNICAMP, Coordenador: Lauro Tatsuo Kubota. INCT III Instituto de Investigação em Imunologia, INCOR. CONSIDERAÇÕES FINAIS COMENTAR OUTROS ASPECTOS RELEVANTES DO DESENVOLVIMENTO GERAL DO INCT: Os recursos financeiros do INCT permitem uma disponibilização de infraestrutura de pesquisa colaborativa e integrada. Há uma forte integração dos grupos que ficam motivados pela existência de recursos que permitirão que suas hipóteses sejam testadas e eventualmente confirmadas. Há a garantia de investimento em recursos humanos e a disponibilização desse conhecimento em tecnologia e informação para desisões em políticas públicas. A seguir, estão apresentados os artigos publicados ou submetidos da equipe e os projetos vinculados ao INCT.

17 1 Agra IM, Ferlito A, Takes RP, Silver CE, Olsen KD, Stoeckli SJ, Strojan P, Rodrigo JP, Gonçalves Filho J, Genden EM, Haigentz M Jr, Khafif A, Weber RS, Zbären P, Suárez C, Hartl DM, Rinaldo A, Kim KH, Kowalski LP. Diagnosis and treatment of recurrent laryngeal cancer following initial nonsurgical therapy. Head Neck May; 34(5): PMID: Alvarenga AW, Coutinho-Camillo CM, Rodrigues BR, Rocha RM, Torres LF, Martins VR, da Cunha IW, Hajj GN. A Comparison between Manual and Automated Evaluations of Tissue Microarray Patterns of Protein Expression. J Histochem Cytochem Apr;61(4): doi: / Epub 2013 Jan Arantes CP, Dias MV, Roffé M, Costa-Silva B, Lopes MH, Porto-Carreiro I, Rabachini T, Lima FR, Beraldo FH, Prado MM, Linden R, Martins VR. The unconventional secretion of stressinducible protein 1 by a heterogeneous population of extracellular vesicles. Hajj GN, Cell Mol Life Sci Mar Azevedo EH, Montoni N, Gonçalves Filho J, Kowalski LP, Carrara-de Angelis E. Vocal handicap and quality of life after treatment of advanced squamous carcinoma of the larynx and/or hypopharynx. J Voice 2012 Mar; 26(2):e PMID: Bernardi MA, Logullo AF, Pasini FS, Nonogaki S, Blumke C, Soares FA, Brentani MM. Prognostic significance of CD24 and claudin-7 immunoexpression in ductal invasive breast cancer. Oncol Rep Jan; 27(1): PMID: Bitu CC, Carrera M, Lopes MA, Kowalski LP, Soares FA, Coletta RD. HOXB7 expression is a prognostic factor for oral squamous cell carcinoma. Histopathology Mar; 60(4): doi: /j x. PMID: Bitu CC, Destro MF, Carrera M, da Silva SD, Graner E, Kowalski LP, Soares FA, Coletta RD. HOXA1 is overexpressed in oral squamous cell carcinomas and its expression is correlated with poor prognosis. BMC Cancer 2012 Apr 12;12:146. PMID: Bravo-Calderón DM, Oliveira DT, Marana AN, Nonogaki S, Carvalho AL, Kowalski LP. Prognostic significance of beta-2 adrenergic receptor in oral squamous cell carcinoma. Cancer Biomark ; 10(1):51-9. PMID: Carraro DM, Koike Folgueira MA, Garcia Lisboa BC, Ribeiro Olivieri EH, Vitorino Krepischi AC, de Carvalho AF, de Carvalho Mota LD, Puga RD, do Socorro Maciel M, Michelli RA, de Lyra EC, Grosso SH, Soares FA, de Souza Waddington Achatz MI, Brentani H, Moreira-Filho CA, Brentani MM.Comprehensive Analysis of BRCA1, BRCA2 and TP53 Germline Mutation and Tumor Characterization: A Portrait of Early-Onset Breast Cancer in Brazil. PLoS One. 2013;8(3):e doi: /journal.pone Corrêa NCR, Kuasne H, Faria JAQA, Seixas CCS, Abreu FB, Nonogaki S, Rocha RM, Gobbi H, ROGATTO SR, Goes AM, Gomes DA. Genomic and phenotypic profiles of two breast cancer cell lines derived from primary human tumors. Oncology Reports 29(4): , Cruz Ede P, Toporcov TN, Rotundo LD, Biazevic MG, Brasileiro RS, Carvalho MB, Kowalski LP, Antunes JL. Food restrictions of patients who are undergoing treatment for oral and oropharyngeal cancer. Eur J Oncol Nurs 2012 Jul; 16(3): Cunha LL, Morari EC, Guihen AC, Razolli D, Gerhard R, Nonogaki S, Soares FA, Vassallo J, Ward LS. Infiltration of a mixture of different immune cells may be related to molecular profile of differentiated thyroid cancer. Endocr Relat Cancer May 24; 19(3):L31-6. PMID: Cunha LL, Morari EC, Nonogaki S, Soares FA, Vassallo J, Ward LS. Foxp3 expression is associated with aggressiveness in differentiated thyroid carcinomas. Clinics (Sao Paulo). 2012; 67(5): PMID: Cunha LL, Morari EC, Guihen AC, Razolli D, Gerhard R, Nonogaki S, Soares FA, Vassallo J, Ward LS. Infiltration of a mixture of immune cells may be related to good prognosis in patients with differentiated thyroid carcinoma. Clin Endocrinol (Oxf) Dec;77(6): doi: /j x. PMID: da Silva SD, Hier M, Mlynarek A, Kowalski LP, Alaoui-Jamali MA. Recurrent oral cancer: current and emerging therapeutic approaches. Front Pharmacol Aug; 3:149. doi: /fphar PMID: de Brot M, Rocha RM, Soares FA, Gobbi H. Prognostic impact of the cancer stem cell related markers ALDH1 and EZH2 in triple negative and basal-like breast cancers. Pathology Jun; 44(4): de Carvalho AC, Kowalski LP, Campos AH, Soares FA, Carvalho AL, Vettore AL. Clinical

18 significance of molecular alterations in histologically negative surgical margins of head and neck cancer patients. Oral Oncol Mar; 48(3): PMID: Gonçalves A, Ewald IP, Sapienza M, Pinheiro M, Peixoto A, Nobrega AF, Carraro DM, Teixeira MR, Ashton-Prolla P, Achatz MI, Rosenberg C, Krepischi AC. Li-Fraumeni-like syndrome associated with a large BRCA1 intragenic deletion. BMC Cancer Jun 12; 12(1): Kaminagakura E, Villa LL, Andreoli MA, Sobrinho JS, Vartanian JG, Soares FA, Nishimoto IN, Rocha R, Kowalski LP. High-risk human papillomavirus in oral squamous cell carcinoma of young patients. Int J Cancer Apr 15; 130(8): doi: /ijc PMID: Köhler HF, Kowalski LP. Prognostic impact of the level of neck metastasis in oral cancer patients. Braz J Otorhinolaryngol Dec; 78(6): PMID: Köhler HF, Kowalski LP. A critical appraisal of different survival techniques in oral cancer patients. Eur Arch Otorhinolaryngol Jan; 269(1): PMID: Kowalski LP, Sanabria A, Vartanian JG, Lima RA, de Mendonca UB, dos Santos CR, Boldrini D Jr, de Mello LE, Pinto FP, Lehn CN, Correa LA, Dedivitis RA, Guimarães AV, Pedruzzi PA, Ramos GH, Gonçalves AJ, Suehara AB, Kanda JL, Capuzzo Rde C, de Oliveira JC, Curado MP, de Góis Filho JF, Fukuyama E, Beserra IM Jr, de Carvalho Neto PB, Carvalho AL. Total thyroidectomy with ultrasonic scalpel: a multicenter, randomized controlled trial. Head Neck Jun; 34(6): doi: /hed PMID: Krepischi AC, Achatz MI, Santos EM, Costa SS, Lisboa BC, Brentani H, Santos TM, Gonçalves A, Nóbrega AF, Pearson PL, Vianna-Morgante AM, Carraro DM, Brentani RR, Rosenberg C. Germline DNA copy number variation in familial and early-onset breast cancer. Breast Cancer Res Feb 7; 14(1):R24. PMID: Krepischi AC, Pearson PL, Rosenberg C. Germline copy number variations and cancer predisposition. Future Oncol 2012 Apr; 8(4): PMID: Lazarini, M.; Traina, F.; Machado-Neto, J.A.; Barcellos, K.S.; Moreira, Y.B.; Brandao, M.M.; Verjovski-Almeida, S.; Ridley, A.J.; Saad, S.T.O. ARHGAP21 is a RhoGAP for RhoA and RhoC with a role in proliferation and migration of prostate adenocarcinoma cells. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease 1832: , Lopes MH, Santos TG. Prion potency in stem cells biology. Prion 2012 Apr-Jun; 6(2): doi: /pri PMID: López I, P Oliveira L, Tucci P, Alvarez-Valín F, A Coudry R, Marín M. Different mutation profiles associated to P53 accumulation in colorectal cancer. Gene May 10;499(1):81-7. Doi: /j.gene PMID: Mai PL, Malkin D, Garber JE, Schiffman JD, Weitzel JN, Strong LC, Wyss O, Locke L, Means V, Achatz MI, Hainaut P, Frebourg T, Evans DG, Bleiker E, Patenaude A, Schneider K, Wilfond B, Peters JA, Hwang PM, Ford J, Tabori U, Ognjanovic S, Dennis PA, Wentzensen IM, Greene MH, Fraumeni JF Jr, Savage SA. Li-Fraumeni syndrome: report of a clinical research workshop and creation of a research consortium. Cancer Genet 2012 Aug; 205: PMID: DOI: /j.cancergen Martins VR, Dias MS, Hainaut P. Tumor-cell-derived microvesicles as carriers of molecular information in cancer. Curr Opin Oncol Jan;25(1): López RV, Zago MA, Eluf-Neto J, Curado MP, Daudt AW, da Silva-Junior WA, Zanette DL, Levi JE, de Carvalho MB, Kowalski LP, Abrahão M, de Góis-Filho JF, Boffetta P, Wünsch-Filho V. Education, tobacco smoking, alcohol consumption, and IL-2 and IL-6 gene polymorphisms in the survival of head and neck cancer. Braz J Med Biol Res Oct;44(10): PMID: Monteiro Santos EM, Valentin MD, Carneiro F, de Oliveira LP, de Oliveira Ferreira F, Junior SA, Nakagawa WT, Gomy I, de Faria Ferraz VE, da Silva Junior WA, Carraro DM, Rossi BM. Predictive models for mutations in mismatch repair genes: implication for genetic counseling in developing countries. BMC Cancer Feb 9; 12:64. PMID: Neto JC, Ikoma MM, Carvalho KC, Vassallo J, De Brot M, Gobbi H, Soares FA, Rocha RM. MGMT and PTEN as potential prognostic markers in breast cancer. Exp Mol Pathol Feb; 92(1):20-6. PMID:

19 33 Oliveira DT, Biassi TP, Faustino SE, Carvalho AL, Landman G, Kowalski LP. Eosinophils may predict occult lymph node metastasis in early oral cancer. Clin Oral Investig Dec;16(6): doi: /s PMID: Oliveira-Costa JP, Oliveira LR, da Silveira GG, Soave DF, Soares FA, Ribeiro-Silva A. Topoisomerase expression in oral squamous cell carcinoma: relationship with cancer stem cells profiles and lymph node metastasis. J Oral Pathol Med Jun 5. doi: /j x. PMID: Paiva CE, Serrano SV, Paiva BSR, Scapulatempo-Neto C, Soares FA, ROGATTO SR, Marques MEA Absence of TGFBRII predicts bone and lung metastasis and is associated with poor prognosis in stage III breast tumors. Cancer Biomark. 2012;11(5): Paschoal AR, Maracaja-Coutinho V, Setubal JC, Simões ZL, Verjovski-Almeida S, Durham AM Non-coding transcription characterization and annotation: A guide and web resource for non-coding RNA databases. RNA Biol. 9: , 2012 [Epub ahead of print] Pubmed PMID: Peinado H, Alecković M, Lavotshkin S, Matei I, Costa-Silva B, Moreno-Bueno G, Hergueta- Redondo M, Williams C, García-Santos G, Ghajar C, Nitadori-Hoshino A, Hoffman C, Badal K, Garcia BA, Callahan MK, Yuan J, Martins VR, Skog J, Kaplan RN, Brady MS, Wolchok JD, Chapman PB, Kang Y, Bromberg J, Lyden D. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med Jun; 18(6): PMID: Rainho CA, Reis PP and Rogatto SR (Eds). São Paulo Advanced School of Comparative Oncology: Abstracts. BMC Proceedings 2013, Volume 7 Suppl: 1-41, Rezze GG, Leon A, Silva DC, Neves RI, Molina GC, Carraro DM, Landman G, Duprat JP. Primary cutaneous melanoma arising in agminated melanocytic nevi: CDKN2A and CDK4 mutation screening. Acta Derm Venereol Jan;92(1): Reis BM, Losi-Guembarovski R, Souza EMSF, Cavalli I, Morita MC, Ramos GHA, Oliveira BV, Mizuno LT, ROGATTO SR Cóllus IMS. Allelic variants of XRCC1 and XRCC3 repair genes and susceptibility of oral cancer in Brazilian patients. J Oral Pathol Med. 2012, 42(2): Reis EM, Verjovski-Almeida S Perspectives of Long Non-Coding RNAs in Cancer Diagnostics. Front. Genet. 3: Rodini CO, Xavier FC, Paiva KB, De Souza Setúbal Destro MF, Moyses RA, Michaluart P, Carvalho MB, Fukuyama EE; Head And Neck Genome Project Gencapo (Cury PM, Dias-Neto E, Figueiredo DL, Fukuyama EE, Góis-Filho JF, Leopoldino AM, Mamede RC, Moreira-Filho CA, Nóbrega FG, Nóbrega MP, Ojopi EP, Serafini LN, Severino P, Silva AM, Silva WA Jr, Silveira NJ, Souza SC, Wünsch-Filho V, Zago MA, Amar A, Arap SS, Araújo NS, Araújo-Filho V, Barbieri RB, Bandeira CM, Bastos AU, Bogossian AP, Braconi MA, Brandão LG, Brandão RM, Canto AL, Carvalho-Neto PB, Casemiro AF, Cerione M, Cernea CR, Cicco R, Chagas MJ, Chedid H, Chiappini PB, Correia LA, Costa A, Costa AC, Cunha BR, Curioni OA, Dias TH, Durazzo M, Ferraz AR, Figueiredo RO, Fortes CS, Franzi SA, Frizzera AP, Gallo J, Gazito D, Guimarães PE, Gutierres AP, Inamine R, Kaneto CM, Lehn CN, López RV, Macarenco R, Magalhães RP, Martins AE, Meneses C, Mercante AM, Montenegro FL, Pinheiro DG, Polachini GM, Porsani AF, Rapoport A, Rodrigues AN, Rodrigues-Lisoni FC, Rodrigues RV, Rossi L, Santos AR, Santos M, Settani F, Silva FA, Silva IT, Silva-Filho GB, Smith RB, Souza TB, Stabenow E, Takamori JT, Tavares MR, Turcano R, Valentim PJ, Volpi EM, Yamagushi F, Cominato ML, Correa PM, Mendes GS, Paiva R, Ramos O, Silva C, Silva MJ, Tarlá MV), Tajara EH, Okamoto OK, Nunes FD (2012). Homeobox gene expression profile indicates HOXA5 as a candidate prognostic marker in oral squamous cell carcinoma. Int J Oncol 40: doi: /ijo , Rosa FE, Santos RM, ROGATTO SR, Domingues MAC. Current approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas. Braz J Med Res Braz J Med Biol Res Mar 19:0. [Epub ahead of print]

20 44 Santos EMM, Edwards QT, ROGATTO SR, Achatz WMI, Santos FM, MacDonald DJ. Integration of genomics in cancer care. J Nursing Scholarship, 45(1):43-51, Schiavon BN, Jasani B, de Brot L, Vassallo J, Damascena A, Cirullo-Neto J, Ivanildo Neves J, Augusto Soares F, Gobbi H, Malagoli Rocha R. Evaluation of Reliability of FISH Versus Brightfield Dual-probe In Situ Hybridization (BDISH) for Frontline Assessment of HER2 Status in Breast Cancer Samples in a Community Setting: Influence of Poor Tissue Preservation. Am J Surg Pathol Oct; 36(10): PMID: DOI: /PAS.0b013e Sens-Abuázar C, Napolitano E Ferreira E, Osório CA, Krepischi AC, Ricca TI, Castro NP, da Cunha IW, Maciel Mdo S, Rosenberg C, Brentani MM, Soares FA, Rocha RM, Carraro DM. Down-regulation of ANAPC13 and CLTCL1: Early Events in the Progression of Preinvasive Ductal Carcinoma of the Breast. Transl Oncol Apr; 5(2): PMID: Silva AG, Achatz IM, Krepischi AC, Pearson PL, Rosenberg C. Number of rare germline CNVs and TP53 mutation types.orphanet J Rare Dis Dec 21;7:101. doi: / PMID: [PubMed - in process]. 48 Silva AG, Ewald IP, Sapienza M, Pinheiro M, Peixoto A, de Nóbrega AF, Carraro DM, Teixeira MR, Ashton-Prolla P, Achatz MI, Rosenberg C, Krepischi AC Li-Fraumeni-like syndrome associated with a large BRCA1 intragenic deletion. BMC Cancer Jun 12;12:237. doi: / PMID: [PubMed - in process] 49 Silveira, R.A.; Fachel, A.A.; Moreira, Y.B.; De Souza, C.A.; Costa, F.F.; Verjovski-Almeida, S.; Pagnano, K.B.B. Protein-coding genes and long noncoding RNAs are differentially expressed in dasatinib-treated chronic myeloid leukemia patients with resistance to imatinib. Hematology, in press, Serra KP, Sarian LO, Rodrigues-Peres RM, Vassallo J, Soares FA, Pinto GA, da Cunha IW, Shinzato JY, Derchain SF. Expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) and p53 in neighboring invasive and in situ components of breast tumors. Acta Histochem May; 114(3): PMID: Silva IC, Netto Ide P, Vartanian JG, Kowalski LP, Angelis EC. Prevalence of upper aerodigestive symptoms in patients who underwent thyroidectomy with and without the use of intraoperative laryngeal nerve monitoring. Thyroid Aug; 22(8): PMID: Silva SD, Nonogaki S, Soares FA, Kowalski LP. p16 (INK4a) has clinicopathological and prognostic impact on oropharynx and larynx squamous cell carcinoma. Braz J Med Biol Res Dec;45(12): PMID: Silva Veiga LC, Bérgamo NA, Reis PP, Kowalski LP, Rogatto SR. Loss of Y-chromosome does not correlate with age at onset of head and neck carcinoma: a case-control study. Braz J Med Biol Res Feb;45(2): PMID: Strojan P, Ferlito A, Medina JE, Woolgar JA, Rinaldo A, Robbins KT, Fagan JJ, Mendenhall WM, Paleri V, Silver CE, Olsen KD, Corry J, Suárez C, Rodrigo JP, Langendijk JA, Devaney KO, Kowalski LP, Hartl DM, Haigentz M Jr, Werner JA, Pellitteri PK, de Bree R, Wolf GT, Takes RP, Genden EM, Hinni ML, Mondin V, Shaha AR, Barnes L. Reply to the letter to the editor by Straetmans et al. Head Neck Dec;34(12): doi: /hed PMID: Takahama A Jr, Alves Fde A, Prado FO, Lopes MA, Kowalski LP. Chondrosarcoma of the maxilla: Report of two cases with different behaviours. J Craniomaxillofac Surg Apr; 40(3):e71-4. PMID: Tavares R, Renaud G, Oliveira PSL, Ferreira CG, Dias-Neto E, Passetti F (2012). Identical sequence patterns in the ends of exons and introns of human protein-coding genes. Computational Biology and Chemistry 36: PMID: doi: /j.compbiolchem Tilli TM, Thuler LC, Matos AR, Coutinho-Camillo CM, Soares FA, da Silva EA, Neves AF, Goulart LR, Gimba ER. Expression analysis of osteopontin mrna splice variants in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia. Exp Mol Pathol Feb; 92(1):13-9. PMID: Toporcov TN, Biazevic MGH, Rotundo LDB, Andrade FP, Carvalho MB, Brasileiro RS, Kowalski LP, Antunes JLF. Consumo de alimentos de origem animal e câncer de boca e orofaringe. Rev Panam Salud Publica 2012;32(3): PMID: Toporcov TN, Tavares GE, Rotundo LD, Vaccarezza GF, Biazevic MG, Brasileiro RS, de Carvalho MB, Junior PM, Kowalski LP, Antunes JL. Do tobacco and alcohol modify protective effects of diet on oral carcinogenesis? Nutr Cancer Nov;64(8):1182-9