A meus. A meus e e. e e. meus
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- Emanuel Martins
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1 ao título de Mestre.
2 A meus A meus e A meus e e A e e
3 A a e e eu o cursava a e e, o com os e a meu A a o e e E a os meus contribuíram
4 em 8 9
5
6
7 nos 9 ao
8 como a e intestinal (100%) e (65%). o na presença CMT isolado em mesma e as outras no feocromocitoma ou de 2 ou 3 membros o momento com
9 o e 2 as a no exon 11 ( códon e nas famílias com no exon 1 O ( códon 618, portador da foi detectada uma mutação 16 Nas formas carcinoma 17'=1\l~rn_<:,,!l no exon , ou numa
10 no 8, no o
11 occur (CLA), is neuromas with in 2 or 3 or hyperparathyroídism. mutations in the ret proto-oncogene, which a cause MEN 2 and recent studies suggest a relationship between mutations and phenotypes in MEN 2
12 were as was 8, exon 16 8
13
14 casos. O ou (3) (6,9). A é a se a é a subtipos,,...,,..,.,.,.,.,,,. a hiperplasia ( 6, 9 ). A (tabela 1 ), baseando-se na nos indivíduos que subdivida em nt<:>i~"'n clínica ( 4 ' 10 ' 11 ): a) (1 ), componentes feocromocitoma e hiperparatireoidismo); NEM (2), que que
15 e h N raras com (B, 16 >, no entanto estes as (18) em menos mesma ou (8,10) 1 é um tumor as c uma adrenocorticotrófico prostaglandinas, e outras < 16 ' >. A é o mais importante na no pós com e na de indivíduos afetados ou com risco a
16 com a ou em anos e se o
17 1 - e 1 torv r.rtrrii"\1"'11fi"iiyi~ e 1 menos em 4 2 ou 3 (8) CMT é unilateral e surge na quinta ou sexta década de vida < 8 >. As manifestações ou massa linfadenomegalia cervical ou outros cervicais locais, raro o aparecimento de ou doença metastática < 8 l. o é usualmente multifocal e bilateral, em torno da ou quarta década no NEM e CMTF e precocemente no NEM infância ser observados neuromas) ( 8 ' 15 ' 17 >. ponto de vista anatômico, a forma hereditária freqüentemente o superior e médio de cada lobo tireoidiano < 8 > CMTé e encapsulado e na microscopia, sob aspecto de uma rede de células neoplásicas uniformes, podendo observar-se a presença de amilóide e de calcificações ( 8 >. Os padrões de crescimento tumoral mais comumente encontrado são o trabecular e o alveolar. O CMT esporádico usualmente não é precedido por hiperplasia celular, enquanto que na forma hereditária a hiperplasia é precursora do carcinoma, observada até mesmo ao nascimento < 8 30 l.
18 como a 10 anos em é e (10) 1 (31) sem sucesso. o inuvu'ir<:llnto~ na!clemnncc:lcao (33) o {36,37) e cromossoma 1 1 meses as e 11 (36-3B). apresenta exons nas células derivadas neural < 39 >, incluindo tumores como CMT e feocromocitoma. A com uma estrutura homóloga ao
19 em com na e o identificado, é o denominado crescimento neuronal < 41 l, membro factor-{3) < 42 >. e no a é (42) ~~;~~ iia I ""có~~~"oi~ Códon 609, 611, 618, 620 Exon 14 Códon 804 Exon 15 Códon 883, 891 Figura 1 - Estrutura do proto-oncogene ret. Os exons e os respectivos códons nos quais foram identificadas mutações associadas a Neoplasía Endócrina Múltipla Tipo 2 estão assinaladas. O mecanismo molecular pelo qual as mutações no proto-oncogene ret desencadeariam o processo neoplásico foi determinado através de elegantes estudos in vitro realizados pelo grupo de Santoro e cols < (Fig 2). De modo simplificado, no
20 8 ao se mesmo nos na é um e menos (9)
21 9 A Normal B flffllftc::n... av no rnr...nn {NEM2A) """'''"'"''"""' no (NEM2B) Cist-+ Met-+ Thr (NEM ausência de dímerização, (adaptado < 5 >). Principais Mutações no Proto-oncogene ret As mutações descritas estão localizadas basicamente nos exons 10, 11 e 16 < 38, ), no entanto foram relatadas mutações com menor freqüência nos exons 13, 14 e 15 < l. No CMTF e NEM 2A, as mutações mais freqüentes afetam um dos cinco resíduos de cisteína no exon 10 ou 11, no domínio extracelular do proto-oncogene ret < l. No CMTF
22 no exon 3 < 53 l comum ocorre (55,56) no (48) (50) ao e ou (8} nos exons 13 e 16 ( 43 ' 48 ' 53 ). A uma segundo (43,45,48) uma maior pacientes com no códon 634, e híperparatireoidismo '"""'"'"''"" em outros que o hiperparatireoidismo é comum é do subtipo ~ arginina ( 10 >. Nas na NEM a
23 ser o reatnz<:mo um,..;:;>,,uuv com 1 e em casos 8 a (10} ao líquen (CLA} < 10 l, a ocorre no os casos relatados o momento e na à de os no exon 10 8 e (10)
24 2- com 2 com no nos exons 1 11, 13, 14 e 16 o o o o o o o (1 o o 5 2 o o o o (1 o o o 1 2 (1 1 o 9 o o (1 9 3 (1 o 18 (1 o (10) é uma e de alta mortalidade quando diagnosticada o Tireóide é de a terapêutica e o doença no afetado e em seus
25 1 uma nn<"c!'lbci rn!tciiqi as IVliiiJ'W'"' nos
26
27 5 A com e uma e (rastreamento citopatológico e anatomopatológico hiperparatireoidismo e a obtidos consulta ao prontuário paciente, e ter,aoe3ut!ico.
28 16 no ou probando nas o o no A utilizada no ao ilustrado na 3- ambas 2A(1) Famílias com e NEM com e feocromocitoma, rastreamento doença paratireoidiana no afetado e nos familiares de com CMT e doença rastreamento para feocromocitoma no afetado e nos familiares de risco NEM CMTF Outros tipos Famílias com CMT, com ou sem feocromocitoma, com anormalidades clínicas específicas, usualmente sem doença paratireoidiana Famílias com pelo menos 4 membros afetados com CMT, sem evidências de feocromocitoma ou doença paratireoidiana no afetado e nos familiares em risco Famílias com menos de 4 membros afetados com CMT, sem evidências de feocromocitoma ou doença paratireoidiana no afetado e nos familiares em risco
29 1'7 L I ou os eram os exons 10, 11 e 1 o novas ou casos
30 18 o 1 é -14 no 1 com es~sus;oenae~-io em e a menos a (ph mm e1u
31 os exons foram: 3 minutos à EXON PRIMER FRAG, TEMPERATURA ANELAMENTO 10 RET10F 5'- GGCAGC ATT GTT GGG GGA CAC-3' PC RET10R 5'- GTT GAG ACC TCT GTG GGG CT -' RET11F 5'- ATG AGG CAG AGC ATA CGCAGC C -3' 347 wc RET1 5'- CTT GAA GGC ATC CAC GGA GAC C -3' oooc 13 INT12F 5'- AAC TTG GGC AAG GCG ATG CA -3' 276pb 57 C INT13R 5'- AGA ACA GGG CTG TAT GGA GC -3' 57 C 16 M2BF 5'- AGG GAT AGG GCC TGG GCT TC -3' 192pb 57 C M2BR 5'- TAA CCT CCA CCC CAA GAG AG -3' 57 C Restrição Enzimática O princípio deste método consiste no fato de que uma mutação pode criar ou destruir o sítio de restrição de uma determinada enzima de restrição (endonuclease), Ou seja, a
32 20 com os e DNA
33 o a é
34 3m RESULTADOS
35 num 14 com e 7 a com a ao catecolaminas hiperpatireoidismo foi determinado,.1:,.,"'".::: ~
36 24 e A
37 25 serem como A e os fenótipos an,f"i'u~tr<:lf'in,<::!' com menos...,,.._..,,.,.,..,. afeitacjos com ou no e nos em
38 26 com caso com um com em nosso os novo. diagnosticadas a infância, com carcinoma medular de tireóide diagnosticado aos 14 com de metástases e alguns anos aparecimento à distância (fígado e A ganglioneuromatose intestinal foi nos
39 e aos com no 2 com ou em ou 3 e no uma 2 7 anos e 6 meses. 7 com sem sugestivos ou
40 28 ou A os com a no anexo!:lr't"\ffll"' a "'"'ier... ieôn as com NEM 2 (tabela
41 com NEM os casos NEM 2A descritos na literatura, a ou nosso estudo, utilizando a mutações, a troca amino-ácido ou triptofano -+ TGG). A figura 3 demonstra um de agarose em uma com utilizando a de restrição Rsa I. A 3 4 B Rsal 347pb Alelo normal 5' 3' Alelo afetado 5' 3' 5' GTiAC 3' Figura 3 - A Gel de agarose ilustrativo da utilização diagnóstica da enzima de restrição Rsa 1. Os indivíduos 1 e 2 são os afetados (positivos) enquanto que 3 e 4 são os não portadores da mutação (negativos). Nos indivíduos afetados, a mutação cria um sítio de restrição para esta enzima, levando a clivagem do fragmento de DNA. B. Sítio de reconhecimento da enzima Rsa I.
42 30 Famílias com NEM à 2 famílias com a rara 2A à a no domínio exon 11' com a -+ arginina na A Hhal 347pb 1 B Alelo normal Alelo afetado 5' 5' 3' Figura 4- A. Gel de agarose ilustrativo da (negativo) cria um sítio de restrição para esta esquemática de sequenciamento, a seta representa os picos concomitantes da troca de nucletídeos. B. Sítio de reconhecimento da enzima Hha I. Famílias com CMTF: Nas 2 famílias portadoras da síndrome de CMTF, as mutações encontradas situaram-se no domínio extracelular, no códon 618 do exon 10, troca do amino-ácido cisteína -+ serina (TGC -+ AGC).
43 com com a se no 8 do exon 1 troca ilustração na 5. A 3 4 B Fokl 192 Alelo nonnal 5' 3' Aielo afetado 5' GGATG 5' 3' mutação destrói o sítio de restrição para esta enzima. B. Sítio de reconhecimento da enzima Fok I. Outras formas hereditárias: Foram analisadas 3 famílias com outras formas hereditárias do CMT, as localizavam no domínio extracelular. No entanto, em uma família, a mutação se localizava no códon 634 do exon 11, troca do amino-ácido cisteína ~ arginina (TGC ~ TAC) ou do amino-ácido cisteína ~ triptofano (TGC~ TGG), na outra no códon 618 do exon 1 O, troca do amino-ácido cisteína ~ serina (TGC~ AGC) e na última a mutação se situava no códon 620
44 ou 8 exon 10, nesses ao Comitê AFETADO 3 /11 3 I 1 I I 2 /11 I 1 8/16 -r tre CMTF 2 618/10 AluI -r ser 3 /11 -? 618/10 I eis -r ser 8 ou 620/10 -? CMT esporádico 7
45 A 33
46 _, 4. DISCU SAO
47 35 com no tumores a """''"v""''a"'.au com neuromas. em 1 síndrome ou nec:>olasla onrt "~"rtn<> as e múltipla n;;;,n;;,n;;; -"'""
48 no (28) o no a o fat"\f"'l"nrr f"\r ifnrr>""' e quando no identificadas em...,.,...,,.,...!1'0ir"<:>f"!:ln genética ( 61 ). IVIUilCI\,V<:;I;;> famílias com e os casos re1c:mmc>s falso-positivo ou a,
49 38 8 um anos antes a um com como sem o (61) como as casos. Q t.::.rlnt'~~"'" as!soc:tacio à é o em ) em presente em e NEM 2A(3) em apenas 1 o CMTF em 1% e os casos que A se em a a
50 39 o os na nas com a no no 8 exon exon 10 e nas 8 ou ou menor 11}, com a os uma e o é comum a mutação é (10) paciente com incluída em nosso ~;,Luu1u a no códon 8 ( exon
51 4U no 8 1 a nas 11 ). 8 nesses casos é A a outras a o e em nosso em 5 anos. a ao outras resumo, nossos a genético o o diagnóstico precoce, fundamental na conduta terapêutica e no no indivíduo afetado e em seus O rastreamento genético identifica a com doença hereditária, permitindo o tratamento precoce, através da tireoidectomia. Bem como, a análise permitiu diagnosticar a hereditariedade do CMT em 2 indivíduos previamente encaminhados como portadores de CMT esporádico.
52 no na 8 centros A o com o o com
53 5. CONC USÃ
54 A rastreamento é a e o no e em seus
55
56 J D 2 1 ' 1
57 in in mucosas neuromas, 1 a
58 47 1 os un J 9. J 1
59 48 A J 1 in in 2 neuromas: a N 1,1 a 1 D 1 a
60 49 to in Kilkenny C 996.
61 is are A in in multi pie :1
62 5 in 8 in in in in s J A in 8 1
63 1 a a disease: 11, ' 1
64 ANEXOS
65 com os 6 8 novos casos com anos ao com e com 8 com exon 11, I. ICL.IUICIII em com anos ao com confirmação a e gastrinoma. evolução, o e A
66 55 no com com exon 1, troca I. a 11! ou 6- anos ao A mutação foi 634, exon 11, troca ou I.
67 56?? 2 com 7 - Probando anos ao com no CMT """'T"'\1"" em acompanhamento realizando terapia supressiva por nódulo de 2 anos. Posteriormente, realizado e tireoidectomia. Foi diagnosticado nódulo num familiar, encaminhado a tireoidectomia, com hiperplasia A molecular demonstrou mutação no códon 634, exon 11, troca TGC--+CGC, enzima restrição utilizada foi Hha I. 8 - Probando 45 anos ao diagnóstico, com rastreamento positivo, com CMT associada à CLA, posteriormente sua filha desenvolveu CMT e a lesão de pele. A mutação localizava-se no códon 634, exon 11, troca TGC--+CGC, enzima de restrição utilizada foi H h ai.
68 57 uma com com 14 anos ao intestinal sintomática nos primeiros anos de vida, durante a infância anos idade neuromas na cavidade uma novo no exon 16, roc::+rír i::lr. utilizada foi /. 9- N
69 58 2 com ou sem a ou Família 1 com anos ao...,..,......,, aparecimento CMT em 6 no exon 1 troca I. 11 no 8, exon 10, troca L 1 Heredograma
70 outras com anos ou no ou 1 anos 1 com anos no entanto com como e o a e A no exon 1 L
71 em 8 com anos a a ou
72 venoso meu os meu nome ou
73 e os manter a ter um meu em e e e acesso ao em aos meus como o suas atribuições. seu acesso a aos meus
74
75 64 os em esse meu 10 venoso meu os meu nome ou a tireóide e em caso e nódulo ou aumento exames com
76 65 os um sem a o e e ter acesso a mim aos meus suas
77 66
78 67
79 (
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