Estudo da Biologia Reprodutiva e do Potencial Biotecnológico e Alimentar de holotúrias da costa de Peniche

Transcrição

1 Estudo da Biologia Reprodutiva e do Potencial Biotecnológico e Alimentar de holotúrias da costa de Peniche Rita Figueiras Alves dos Santos [2013]

2

3 Estudo da Biologia Reprodutiva e do Potencial Biotecnológico e Alimentar de holotúrias da costa de Peniche Rita Figueiras Alves dos Santos Dissertação para a Obtenção do Grau de Mestre em Aquacultura Dissertação de Mestrado realizada sobre a orientação da Doutora Ana Pombo e do Doutor Rui Pedrosa [2013]

4 Título: Estudo da Biologia Reprodutiva e do Potencial Biotecnológico e Alimentar de holotúrias da costa de Peniche Copyright Rita Figueiras Alves dos Santos Escola Superior de Turismo e Tecnologia do Mar Peniche Instituto Politécnico de Leiria 2013 A Escola Superior de Turismo e Tecnologia do Mar e o Instituto Politécnico de Leiria têm o direito, perpétuo e sem limites geográficos, de arquivar e publicar esta dissertação/trabalho de projeto/relatório de estágio através de exemplares impressos reproduzidos em papel ou de forma digital, ou por qualquer outro meio conhecido ou que venha a ser inventado, e de a divulgar através de repositórios científicos e de admitir a sua cópia e distribuição com objetivos educacionais ou de investigação, não comerciais, desde que seja dado crédito ao autor e editor. iv

5 v Aos meus pais e irmã Aos meus avós À Eliana À memória da Shiva

6

7 Agradecimentos E s t e t r a b a l h o n ã o t e r i a s id o p o s s ível s e m a a j u d a e o a p o i o i n c o n d ic i o n a l d e u m c o n j u n t o d e p e s s o a s a q u e m d e v o o m e u m a is p r o f u n d o a g r a d e c imento. As s im, E m p r imeir o lugar, g o s t a r i a d e a g r a d e c e r à m inha o r i e n t a d o r a, Pr o f e s s o r a D o u t o r a A n a P o m b o, p e l o e n t u s ia s m o c o m q u e a c e itou o r ie n t a r e s t e t r a b a l h o, m e s m o s a b e n d o a s p o s s íveis d if i c u ld a d e s, d a d a a e s c a s s e z d e liter a t u r a s o b r e o t e m a. Um m u it o o b r ig a d o p o r t o d a a a j u d a, a p o io i n c o n d ic i o n a l, p e l a p a r t ilha d e id e i a s, i n c e n t i vo c o n s t a n t e e p e las v a l io s a s s u g e s t õ e s. A o m e u o r i e n t a d o r, Prof e s s o r Do u t o r R u i P e d r o s a, q u e r o a g r a d e c e r t e r a c e itado f a z e r p a r t e d e s t e p r o j e t o, m e s m o s a b e n d o a s m in h a s g r a n d e s l i m itações n a á r e a d a b iot e c n o log ia. Um m u ito o b r ig a d o p e lo a p o io e in c e n t i v o c o n s t a n t e! N ã o p o d e r i a d e i xa r d e a g r a d e c e r à Pr o f e s s o r a Do u t o r a S u s a n a Me n d e s, n ã o s ó p e la a j u d a e s t a t íst ic a, m a s t a m b é m p e los v a l i o s o s c o m e n t á r io s e p u x ã o d e o r e l h a s m a is d o q u e m e r e c i d o s, q u e s e m d ú v id a m e l h o r a r a m im e n s o e s t e t r a b a lh o. U m m u ito o b r ig a d o à a m i z a d e s e m p r e p r e s e n t e! U m g r a n d e, g r a n d e, G R A NDE o b r ig a d o à Pr o f e s s o r a Dout o r a S u s a n a F e r r e i r a, p e la p a c iê n c ia e e n t u s ia s m o n a r e v i s ã o d e a lg u n s r e s u lt a d o s e a j u d a n o t r a t a m e n t o d a s f o t o s d a h i s t o l o g ia. Mu i t o o b r ig a d a p e lo c a r i n h o s e m p r e d e m o n s t r a d o e v a liosíssim a s s u g e s t õ e s! A o s t é c n icos d e laborat ó r io, n o m e a d a m e n t e à T é c n ic a V e r a S e v e r ia n o, u m m u it o o b r ig a d o p e la d is p o n ib i l id a d e s e m p r e d e m o n s t r a d a q u a n d o n e c e s s it a v a d e mat e r ia is. À P r o f e s s o r a D o u t o r a Su s a n a Pe r e ir a d a Un i v e r s i d a d e d o P o r t o e à m i n h a e t e r n a p r o f e s s o r a d o a n d a r, Mar i a I n ê s, u m m u it o o b r ig a d a p e lo s c o m e n t á r i o s e s u g e s t õ e s d a d a s, m a s m a is d o q u e i s s o, à e t e r n a a m i z a d e e c a r in h o. O b r ig a d a p o r f a zer e m p a r t e d a m in h a v i d a, h o j e e s e m p r e! A o An d r é H o r t a e T i a g o S imões, p o r t o d a a a j u d a d i s p e n s a d a e v a l i o s o s c o n s e lhos. U m g r a n d e, G R ANDE a g r a d e c im e n t o a o s m e u s o r ient a d o r e s d o c o r a ç ã o, Su s e t e P i n t e u s, C e lso A l v e s e J o a n a S i l v a! Sem v o c ê s, u m a p a r t e s u b s t a n c ia l d e s t a t e s e n ã o t e r i a s i d o p o s s ível e d o f u n d o d o m e u c o r a ç ã o, a g r a d e ç o - vo s a p a c i ê n c ia, a a m i z a d e, o vii

8 t e m p o d is p e n d id o c o m ig o e o i n c e n t i v o c o n s t a n t e, n u n c a m e d e i x a n d o ir a b a i x o. O b r ig a d a p o r m e t e r e m a c o m p a n h a d o d e s d e o i n íc i o a t é a o f im. Vo c ê s s ã o ú n ic o s!!! P o r ú lt imo, m a s n ã o m e n o s im p o r t a n t e, à m i n h a f a m íl ia, p o r m e t e r e m p r o p o r c i o n a d o e s t e Mestra d o, p o r t e r e m s e m p r e a c r e d itado e m m im, p e lo a p o i o c o n s t a n t e e p o r s e r e m o s p i lar e s d a m i n h a e x i s t ê n c ia. O b r i g a d o p o r t e r e m e n t e n d i d o o p o r q u ê d a s m in h a s a u s ê n c ia s a o f i m - de- s e m a n a. N o f in a l v a leu a p e n a! À E l i a n a, s e m t i e s t a t e s e, e m t o d a s a s s u a s v e r t e n t e s, n ã o t e r i a s id o p o s s ível! O b r ig a d a p e lo a p o i o e p r e s e n ç a c o n s t a n t e, p o r t o d a a j u d a e p e l o s m a r a v i l h o s o s c o r t e s e c o l o r a ç õ e s, b e m m e l h o r e s q u e o s m e u s! ; ) Enf im a c h o q u e é u m o b r ig a d o p o r t u d o : E s t a T e s e é N o s s a!!! : D viii

9 A t é a o m o m e n t o, d e s t e t r a b a lh o r e s u lt o u u m p ó s t e r c ie n t íf ic o n o C o n g r e s s o E u r o p e u d e B iot e c n o lo g ia e m Brat is l a v a, e u m a p u b l i c a ç ã o e m f o rma d e r e s u m o n a r e v ist a c ie n t íf i c a Curre n t O p i n ion i n B i o t e c h n o lo g y : P ó s t e r c i e n t íf ic o : S a n t o s, R., S ilva, J., P i n t e u s, S., A lves, C., P o m b o, A. a n d P e d r o s a, R. ( ). S e a c u c u m b e r s f r o m t h e P e n i c h e c o a s t ( Portu g a l ) e x h ib it n e w p r o m i s ing a n t i t u m o r a c t i v i t y a g a inst H e p G - 2 c e l l l in e. Eu r o p e a n B i o t e c h n o lo g y Co n g r e s s, in B r a t is l a v a. P u b l i c a ç ã o : S a n t o s, R., P i n t e u s, S., Pom b o, A. a n d Pe d r o s a, R. ( ). A n t ib a c t e r ia l, a n t if u n g a l a n d a n t ioxidant a c t i v it y o f s e a c u c u m b e r s f r o m t h e Pe n iche c o a s t ( P o r t u g a l). Curre n t O p i n ion in Biotechnolo g y, V o lume 2 4, S u p p l e m e n t 1, p a g e s S 9 7. ix

10

11 Resumo

12

13 Resumo A b io l o g ia r e p r o d u t i v a d e d u a s e s p é c ie s d e h o lot ú r ias f o i e s t u d a d a a t r a v é s d a a v a l ia ç ã o d o Í n d ice G o n a d o s s o m á t ico e a n á l i s e s h i s t o l ó g ic a s a o s t ú b u l o s d a s g ó n a d a s. O p o t e n c ial b i o t e c n o l ó g i c o f o i r e a l i za d o p e l a a v a l ia ç ã o d a c a p a c id a d e a n t io x i d a n t e, a n t imicr o b i a n a e a n t it u m o r a l d e e x t r a t o s o r g â n ic o s e a a v a l i a ç ã o d o p e r f i l l i p íd ic o f o i e f e t u a d a a t r a v é s d a q u a n t if icação d a g o r d u r a t o t a l e p e r f i l em ácid o s g o r d o s, p a r a a s t r ê s e s p é c ie s. A a v a l iação d o Í n d ic e G o n a d o s s o m á t i c o ( G I ) e a n á l i s e s h i s t o l ó g ic a s r e v e la r a m q u e a a ltura d e f e ver e iro a b r il c o r r e s p o n d e a o p i c o d e m a t u r a ç ã o d a g ó n a d a, p a r a a s d u a s e s p é c ie s, c o m G I d e % e % p a r a f ê m e a s e m a c h o s d e H o l o t h u r i a f o r s k a l i e % e % p a r a f ê m e a s e m a c h o s d e H o l o t h u r i a m a m m a t a. A e s p é c ie Ho l o t h u r i a f o r s k a l i ( f r a ç ã o m e t a n ó l ica) a p r e s e n t o u u m a m a ior a t i v i d a d e a n t i o x i d a n t e, c o m ± m g de EAG g - 1 d e e xt r a t o, u ma p e r c e n t a g e m d e r e d u ç ã o d o r a d ical D P P H d e % ± ( 1 m g m l - 1 ) e ± µ m o l d e e q u i v a l e n t e s d e t r o l o x g - 1 de e xt r a t o. N a a va l i a ç ã o d a c a p a c id a d e a n t imicr o b i a n a, a p e n a s p a r a S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s o c o r r e u a r e d u ç ã o d o c r e s c imento, p r o m o v i d o p o r e x t r a t o s d e H o l o t h u r ia f o r s k a l i ( f r a ç ã o d i c lor o m e t a n o ) ( %; 1 m g m l - 1 ). A a v a l iação d a a t i v i d a d e a n t if ú n g ic a p a r a S. c e r e v is ia e, r e ve l o u q u e St ic h o p u s r e g a lis ( f r a ç ã o m e t a n ó l ic a ) a p r e s e n t o u u m m a i o r p o t e n c i a l d e r e d u ç ã o d o c r e s c im e n t o ( 62.80%; 1 m g m l - 1 ). P a r a C. a lb i c a n s, o m a ior p o t e n c i a l f o i d e mo n s t r a d o p o r St ichopus r e g a lis e H o l o t h u r i a f o r s k a li ( f r a ç õ e s met a n ó l ic a s ) c o m % e % ( 1 m g m l - 1 ), r e s p e t i vam e n t e. O s v a l o r e s d e I C 50, p a r a C. a lb i c a n s, f o r a m de µ g m l - 1 ( μ g m l - 1 ) e µ g m l - 1 ( µ g m l - 1 ), r e s p e t i v a m e n t e. N a r e d u ç ã o d a v i a b i l id a d e e p r o l if e r a ç ã o c e l u lar, p a r a H o l o t h u r i a f o r s k a li ( f r a ç ã o m e t a n ó l ica) n a linha c e lu l a r MC F - 7, o c o r r e u u m a r e d u ç ã o d e % ( 1 m g m l m é t o d o d e MT T ). R e l a t i v a m e n t e à l in h a c e l u l a r He p G -2, a r e d u ç ã o d a v i a b i l id a d e e p r o l if e r a ç ã o c e l u lar f o i d e % e % ( 1 m g m l - 1 ; e xt r a t o m e t a n ó l ico m é t o d o d e MT T ), r e s p e t i v a m e n t e. N a v i a b i l idade c e lu l a r, o IC 50 ( e x t r a t o m e t a n ó l ic o ) f o i de µ g m l - 1 ( µ g m l - 1 ) e µ g m l - 1 ( µ g m l - 1 ), p a r a MCF-7 e H e p G - 2, r e s p e t ivamente. N a p r o l iferação c e l u lar, o I C 50 f o i de µ g m l - 1 ( µ g m l - 1 ) e µ g m l - 1 ( µ g m l - 1, m é t o d o d e MT T ), p a r a MC F - 7 e H e p G - 2, respetivamente. F o i o b t id a, p a r a Ho l o t h u r ia f o r s k a l i, H o l o t h u r i a m a m m a t a e S t i c h o p u s r e g a l is, %, 1 % e % d e g o r d u r a t o t a l, r e s p e t i vam e n t e. No p e r f i l e m á c i d o s g o r d o s, a Ho lot h u r ia f o r s k a li a p r e s e n t o u o s v a lo r e s m a is e le v a d o s e m C1 6 : 0 ( % ) e A RA ( % ). A Ho l o t h u r ia m a m m a t a a p r e s e n t o u a m a i o r q u a n t id a d e t o t a l e m PUFA e a e s p é c ie St ic h o p u s r e g a l is a p r e s e n t o u a m a ior xiii

14 Resumo q u a n t id a d e e m C18: 0 ( % ), C 1 8 : 1 n - 7 ( % ), EPA ( % ) e D H A ( % ). A s e s p é c i e s e s t u d a d a s a p r e s e n t a m c a r a c t e r íst i c a s q u e n o s l e v a m a s u g e r ir o s e u p o t e n c ia l p a r a c u lt i vo e p o d e m a s s im s e r t id a s c o m o n o v a s e s p é c i e s p a r a a a q u a c u lt u r a e m P o r t u g a l e E u r o p a. A lém d i s s o, a p r e s e n t a m e l e v a d o p o t e n c ia l a n t i o x i d a n t e, a n t im icrobia n o e c i t o t ó x ic o, a lém d e p o s s u irem á c id o s g o r d o s d e r e l e v â n c i a p a r a a s a ú d e h u m a na, p e lo q u e s e a b r e m j a n e la s p a r a a p u r if icação e i d e n t if i c a ç ã o d e n o v a s m o l é c u l a s c o m p o t e n c i a l b i o t e c n o l ó g i c o e a limentar r e le v a n t e. P a la v r a s - c h a v e : H o l o t ú r i a s ; Biologia r e p r o d u t i v a ; P o t e n c ia l B i o t e c n o lógico ; Compost o s b i o a t i v o s ; P e r f i l l ip íd i c o. xiv

15 Abstract

16

17 Abstract T h e r e p r o d u c t i v e b i o log y o f t wo s p e c ie s o f s e a c u c u m b e r s wa s s t u d ie d b y e v a l u a t ing t h e G o n a d o s o m a t i c i n d e x a n d h i s t o l o g ic a l a n a l yzes t o t h e t u b u l e s o f t h e g o n a d s. T h e b i o t e c h n o log ic a l p o t e n t i a l wa s p e r f o r m e d b y e v a lu a t io n o f t h e a n t io x i d a n t, a n t imicr o b i a l a n d a n t itum o r a c t i v it ie s o f o r g a n ic e x t r a c t s ( m e t h a n o l a n d d ic h lor o m e t h a n e ) a n d t h e l ip i d p r o f i le was p e r f o r m e d b y m e a s u r i n g t h e t o t a l f a t a n d f a t t y a c i d p r o f ile, f o r t h e t h r e e s p e c ie s. T h e e v a l u a t io n o f t h e G o n a d o s o m a t i c in d e x ( G I ) a n d h i s t o l o g ic a l a n a l y z e s r e v e a led t h a t t h e r a n g e f r o m F e b r u a r y t o A p r i l c o r r e s p o n d s t o t h e p e a k o f g o n a d m a t u r a t ion, f o r b o t h s p e c ies, wit h G I va l u e s o f % a n d % f o r f em a l e s a n d m a l e s o f H o lot h u r ia f o r s k a l i a n d % a n d % f o r f e m a les a n d m a les o f Ho lothur ia ma m m a t a. H o l o t h u r i a f o r s k a l i, in t h e m e t h a n o lic f r a c t io n, s h o wed t h e h ig h e s t a n t io x i d a n t a c t i v it y, with ± m g o f EAG g - 1 e x t r a c t, a p e r c e n t a g e r e d u c t io n o f D PPH o f % ± ( 1 m g ml - 1 ) a n d ± µ m o l o f t r o l o x e q u i v a le n t s g - 1 e xt r a c t. I n e v a lu a t ing t h e a n t i m icr o b i a l c a p a c it y, o n l y St a p h y lo c o c c u s a u r e u s g r o wt h wa s r e d u c e d b y d i c h l o r o m e t h a n e e x t r a c t s o f H o l o t h u r i a f o r s k a l i ( % ; 1 m g m l - 1 ). T h e m e t h a n o lic f r a c t io n o f S t i c h o p u s r e g a l is s h o we d t h e g r e a t e s t a n t if u n g a l p o t e n t ia l a g a i n s t S. c e r e v is i a e g r o wt h ( r e d u c t io n o f %, 1 m g m l - 1 ). F o r C. a l b ic a n s, t h e p e r c e n t a g e o f g r o wth r e d u c t io n wa s g r e a t e r f o r t h e m e t h a n o l ic f r a c t ion o f St ic h o p u s r e g a l is a n d Ho lot h u r i a f o r s k a li, with v a lu e s o f % a n d % ( 1 m g m l - 1 ), r e s p e c t i v e l y. T h e IC 50 va l u e s f o r C. a l b ic a n s we r e m g m l - 1 ( t o m g ml - 1 ) a n d m g m l - 1 ( t o m g m l - 1 ) f o r b o t h s p e c ies, r e s p e c t i v e l y. I n t h e e v a lu a t io n o f c e l l r e d u c t io n v iabilit y a n d p r o l if e r a t io n, f o r H o lot h u r i a f o r s k a l i ( m e t h a n o l ic f r a c t io n ) in c e l l l in e MC F - 7, t h e r e wa s a r e d u c t io n o f % ( 1 m g m l MT T m e t h o d ). R e g a r d ing c e l l l in e H e p G - 2, r e d u c t i o n o f c e l l v i a b i l it y a n d p r o l if e r a t io n was % a n d % ( 1 m g m l - 1 ; m e t h a n o lic e x t r a c t - MT T m e t h o d ), r e s p e c t i v e l y. O n c e l l v ia b i l it y, t h e I C 50 ( m e t h a n o l e xt r a c t ) wa s m g m l - 1 ( m g m l - 1 ) a n d m g m l - 1 ( m g m l - 1 ) f o r MC F - 7 a n d HepG - 2 c e lls l i n e, r e s p e c t i v e l y. I n c e l l p r o l if e r a t i o n, t h e I C 50 was m g m l - 1 ( m g m l - 1 ) a n d m g m l - 1 ( m g m l - 1 MT T m e t h o d ), f o r MC F - 7 a n d He p G - 2 c e l ls l in e, r e s p e c t ively. T h e t o t a l f a t f o r Ho l o t h u r ia f o r s k a l i, H o l o t h u r i a m a m m a t a and S t i c h o p u s r e g a l is, wa s %, 1 % a n d %, r e s p e c t i v e l y. R e g a r d ing t h e f a t ty a c id p r o f ile, H o l o t h u r i a f o r s k a l i s h o we d t h e h ig h e s t v a l u e s in C 1 6 : 0 ( % ) a n d A R A ( % ). H o l o t h u r ia m a m m a t a h a d t h e h ig h e s t t o t a l a m o u n t o f P UF A a n d St i c h o p u s r e g a l i s s h o wed t h e h ig h e s t a m o u n t i n C 1 8 : 0 ( % ), C 1 8 : 1 n - 7 ( % ), E PA ( % ) a n d DHA ( % ). xvii

18 Abstract T h e s e s p e c ies h a v e c h a r a c t e r ist i c s t h a t l e a d u s t o s u g g e s t t h e p o t e n t ia l f o r c u lt i v a t i o n a n d c a n t h u s b e r e g a r d e d a s n e w s p e c ies f o r a q u a c u lt u r e in P o r t u g a l a n d Eur o p e. A ls o, t h e y h a v e h ig h p o t e n t ia l a n t io x i d a n t, a n t imicrobia l a n d c yt o t o x ic a c t i v it ies, b e s i d e s h a v i n g f a t t y a c i d s o f r e le v a n c e f o r h u m a n h e a lth. Mo r e o v e r, t h e s e f in d ings o p e n n e w windows f o r t h e p u r if i c a t ion a n d i d e n t if icat i o n o f n o v e l m o l e c u le s with b iot e c h n o log ical p o t e n t ia l. K e y wo r d s : S e a c u c u m b e r s ; R e p r o d u c t i v e B i o l o g y; B i o t e c h n o l o g ic a l P o t e n t ia l; B io a c t ive c o m p o u n d s ; F a t t y a c id p r o f i le. xviii

19 Índice

20

21 Índice Resumo... xiii Abstract... xvii Introdução Biologia das espécies estudadas e sua distribuição geográfica Aquacultura de holotúrias: estado atual do tema Potencial biotecnológico de holotúrias Holotúrias, um novo recurso alimentar de alto valor nutricional... 9 Objetivos Objetivo Geral Objetivos Específicos Materiais e Métodos Amostragem biológica e determinação do Índice Gonadossomático (GI) Análises histológicas Preparação dos extratos Avaliação da capacidade antioxidante Quantificação Total de Polifenóis Avaliação da capacidade de redução do radical DPPH Avaliação da capacidade de captação do radical peróxilo (ROO ) - Método ORAC Avaliação da capacidade antimicrobiana Preparação dos meios de cultura Avaliação da capacidade antibacteriana Avaliação da capacidade antifúngica Avaliação do potencial citotóxico Ensaio de proliferação celular e viabilidade celular nas células MCF-7 e HepG Método de 3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) Método de calceína AM Quantificação da gordura total e avaliação do perfil em ácidos gordos das espécies em estudo Análise estatística Resultados Amostragem biológica e Índice Gonadossomático das duas espécies em estudo Morfometria dos Túbulos das Gónadas e Análises Histológicas xxi

22 Índice 4.3. Avaliação da capacidade Antioxidante Quantificação Total de Polifenóis Capacidade de redução do radical DPPH Capacidade de captação do radical peróxilo (ROO ) - Método ORAC Avaliação da capacidade antimicrobiana Capacidade antibacteriana Capacidade Antifúngica Avaliação da atividade citotóxica dos extratos de holotúrias sobre os modelos celulares MCF-7 e HepG Efeitos de toxicidade dos extratos de holotúrias nas linhas celulares MCF-7 e HepG Efeito dos extratos de holotúrias sobre a proliferação celular nas linhas celulares MCF-7 e HepG Quantificação da gordura total e avaliação do perfil em ácidos gordos das três espécies de holotúrias Discussão e Conclusão Perspetivas Futuras Bibliografia Anexos xxii

23 Introdução

24

25 Introdução N a s ú lt imas d é c a d a s t e m - s e v i n d o a a s s i s t i r a u m c r e s c e n t e i n t e r e s s e e c o n ó m i c o e d e e x p lor a ç ã o d a s p o p u la ç õ e s d e h o lot ú r ias a n ível m u n d ia l. Est e int e r e s s e e s t á m a i o r itar iam e n t e c e n t r a d o e m p a ís e s c o m o a C h i n a, J a p ã o, I n d o n é s i a, Au s t r á l ia, e n t r e o u t r o s, o n d e a s h o lot ú r ia s s ã o c o n h e c i d a s e c o n s u m idas c o m o b ê c h e de m e r, t r e p a n g o u h a i s o m. Bêche de m e r é o n o m e d a d o à s h o lot ú r ia s q u e f o r a m s u j e itas a u m p r o c e s s o c o n t ín u o d e c o z e d u r a, l impeza, s e c a g e m e, e m a lg u n s c a s o s, s u j e itas a f u m a g e m ( A n d e r s o n e t a l., ; S icuro e L e v in e, ; Purcell e t a l., ). A f á c i l o b t e n ç ã o d e h o l o t ú r ia s p o r p e s c a d o r e s l o c a i s, q u e o s p e s c a m à m ã o, a p n e ia o u u t i lizando e q u i p a m e n t o s s imples, c o m o u m a v a r a c o m u m a j a u l a n a e xt r e m id a d e, b e m c o m o o i n t e r e s s e d e c o r r e n t e d a s g r a n d e s m e t r ó p o le s n o m e r c a d o d a s e x p o r t a ç õ e s, t e m l e va d o a u m a s e v e r a d e p l e ç ã o d o s s t o c k s n a t u r a is. A l ia d o a e s t e f a t o r, a n a t u r e za s é s s i l d a s h o l o t ú r i a s e a f a c ilidade d e p r o d u ç ã o d e b ê c h e de m e r, e x i g in d o p o u c a o u n e n h u m a t e c n o logia a s s o c iada, t e m s i d o a p o n t a d a c o m o u m d o s p r i n c ip a is r e c u r s o s d e s u b s i s t ê n c i a d a s p e q u e n a s c o m u n i d a d e s r u r a is c o s t e i r a s d e p a ís e s s u b d e s e n v o l v i d o s n a r e g iã o a s iát ica. T a l t e m a c a r r e t a d o u m g an h o e c o n ó m i c o p a r a e s t a s p o p u la ç õ e s, a t r a v é s d a e xp o r t a ç ã o d a s h o lot ú r i a s ( n a f o r ma s e c a, f r e s c a o u c o n g e la d a ) m a i o r itar iam e n t e p a r a a C h i n a ( m a is c o n c r e t a m e n t e p a r a o p o r t o d e Ho n g K o n g ) e S i n g a p u r a ( B e l l e t a l., ; O c h ie wo e t a l., ; An d e r s o n e t a l., ; F r ie d m a n e t a l., ). N o h e m i s f é r i o Norte e p a r t ic u larme n t e n a E u r o p a, a i n d a s e e n c o n t r a m u ito p o u c o d e s e n vo l v i d a a p e s c a d e h o lot ú r ia s, s e n d o a p e n a s d o m i n a d a p o r u m c o n j u n t o p e q u e n o d e e s p é c i e s c o m o : C u c u m a r i a f r o n d o s a, St ichopus r e g a l is, H o l o t h u r ia m a m m a t a, H o l o t h u r i a p o l ii, Ho l o t h u r ia t u b u l o s a, P a r a s t ic h o p u s c a l i f o r n icus, e n t r e o u t r a s ( S ic u r o e L e v i n e, ). T o d a s e s t a s e s p é c i e s t ê m c o m o d e s t in o o m e r c a d o a s i á t ico, s e n d o e x p o r t a d a s n a s u a f o r m a s e c a, c o n g e l a d a o u f r e s c a e t e n d o c o m o p r i n c ip a is p a ís e s e x p o r t a d o r e s a T u r q u ia, F r a n ç a e E s p a n h a. O t o t a l d e h o l o t ú r ia s e x p o r t a d a s p e l a T u r q u i a e m f o i d e t o n e la d a s ( V a n n u c c i n i, ; A y d i n, ; S i c u r o e L e v ine, ) B i o lo g ia d a s e s p é c i e s e s t u d a d a s e s u a d istribuiç ã o g e o g r á f i c a A s h o l o t ú r i a s s ã o u m a d a s c in c o g r a n d e s c la s s e s d e e q u i n o d e r m e s. Pertencem tam b é m a e s t e f i l o, a s e s t r e la s - do- m a r e o u r iç o s - do- m a r. Existem c e r c a d e e s p é c i e s d e h o lot ú r ias d i s t r ib u ídas em 6 o r d e n s e 2 5 f a m íl i a s ( Co n a n d, ). E s t e s o r g a n ism o s a p r e s e n t a m e m m é d ia, u m t a m a n h o t íp i c o e n t r e c m d e c o m p r im e n t o. O s e u c o r p o a p r e s e n t a u m a f o r m a a p r o x imadamente c i l índrica e n ã o t ê m b r a ç o s ( q u e s ã o e n c o n t r a d o s e m o u t r o s e q u inoderme s c o m o a s e s t r e la s - d o 3

26 Introdução m a r ). O e s q u e let o é r e d u z i d o a e s p ículas mic r o s c ó p icas e x i s t e n t e s n a p a r e d e d o c o r p o e t ê m p é s a m b u l a c r á r i o s. A b o c a é a n t e r ior, c e r c a d a p o r t e n t á c u l o s r e f r a c t e i s, i n t e s t in o l o n g o, â n u s p o s t e r ior e c l o a c a, a p r e s e n t a n d o ó r g ã o s r e s p irat ó r io s ( f ig u r a 1 ) ( C o n a n d, ; Sa ld a n h a, ). Figura 1. Anatomia e forma geral do corpo de uma holotúria (Adaptado de A s h o l o t ú r i a s p o d e m s e r e n c o n t r a d a s e m t o d o o a m b i e n t e m a r i n h o, d e s d e o i n t e r t id a l e á g u a s r a s a s, a t é a o s f u n d o s a b is s a is. A m a i o r d i v e r s i d a d e d e e s p é c ie s o c o r r e n o O c e a n o Í n d ic o e Pa c íf i c o. A r e p r o d u ç ã o p o d e s e r s e x u a d a o u a s s e x u a d a, s e n d o a m a i o r ia d a s e s p é c ie s d ió i c a s ( s e x o s s e p a r a d o s ) m a s n ã o a p r e s e n t a n d o d imorf i s m o s e x u a l. As l a r va s a p r e s e n t a m a f o r m a p l a n t ó n ic a e s ó n a f a s e d e j u v e n i l, a o o c o r r e r a m e t a m o r f i z a ç ã o, é q u e a d q u ir e m h á b it o s b e n t ó n ic o s ( Co n a n d, ; B a t t a g lene, ). A s e s p é c ies e x istentes n a c o s t a p o r t u g u e s a n ã o s ã o t ã o d i v e r s if i c a d a s c o m o a s e x i s t e n t e s n a s r e g iõ e s d o P a c íf i c o e Í n d ic o. No e n t a n t o, p o s s u e m u m a g r a n d e a b u n d â n c ia e d e n s id a d e p o p u la c ional. A e s p é c ie Ho lot h u r i a f o r s k a l i a p r e s e n t a u m a d istribuição g e o g r á f i c a t íp i c a d e u m a e s p é c ie At l â n t ic a - Medit e r r â n ic a, p o d e n d o s e r e n c o n t r a d a e m t o d a a c o s t a p o r t u g u e s a a t é à s i lh a s d a Ma d e ira, Aç o r e s e De s e r t a s. É p o s s ível t a m b é m s e r e n c o n t r a d a d e s d e a Es c a n d inávia e i l h a s B r itânicas a t é à s i l h a s C a n á r i a s e Ma r r o c o s ( T u wo e C o n a n d, ). R e lat i v a m e n t e à e s p é c ie H o l o t h u r i a m a m m a t a, e s t a p o d e s e r e n c o n t r a d a e m t o d a a r e g iã o d o Ma r Me d iterrâ n e o e t a m b é m n a r e g i ã o n o r d e s t e d o O c e a n o A t l â n t i c o, e s t a n d o a in d a p r e s e n t e n o c o n j u n t o d a s i lh a s Ma c a r o n é s ia s ( A ç o r e s, Ma d e ir a e Canár ia s ). Am b a s a s e s p é c ie s s u p r a c itadas s ã o e s p é c ies t íp i c a s d a z o n a i n t e r t id a l, s e n d o a i n d a p o s s ível e n c o n t r á - l a s n a zo n a s u b t id a l a t é a o s 5 0 m e t r o s d e p r o f u n d i d a d e. P o r ú l t imo, a e s p é c i e S t ic h o p u s r e g a l is a p r e s e n t a u m a d istribuiç ã o g e o g r á f i c a s im i lar à s e s p é c i e s a n t e r i o r m e n t e 4

27 Introdução d e s c r itas, s e n d o a i n d a p o s s ível s e r e n c o n t r a d a n o G o lf o d o Mé x i c o e n a c o s t a n o r d e s t e d e Cu b a e I l h a s V irgens, s e n d o n o e n t a n t o u m a e s p é c i e d e f u n d o, e n t r e o s 1 0 e o s m e t r o s ( T a b e la I ) ( Pa ws o n e t a l., ; Rám o n e t a l., ; B o r r e r o - P é r e z, e t a l., 2011). Tabela I. Taxonomia de algumas espécies existentes na costa portuguesa (Adaptado de WorMs World Register of Marine Species). Taxonomia Holothuria forskali (Delle Chiaje, 1823) 5 Holothuria mammata (Grube, 1840) Stichopus regalis (Cuvier, 1817) Reino Animalia Animalia Animalia Filo Equinodermata Equinodermata Equinodermata Classe Holothuroidea Holothuroidea Holothuroidea Ordem Aspidochirotida Aspidochirotida Aspidochirotida Família Holothuriidae Holothuriidae Stichopodidae Género Holothuria Holothuria Stichopus Espécie Holothuria forskali (Delle Chiaje, 1823) Holothuria mammata (Grube, 1840) 1. 2 A q u a c u ltur a d e h o lot ú r ia s : e s t a d o a t u a l d o t e m a Stichopus regalis (Cuvier, 1817) A a q u a c u lt u r a t e m v i n d o a a p r e s e n t a r - s e c o m o u m a i n d ú s t r ia r e n t á v e l c o m v i s t a à p r e s e r v a ç ã o d a s e s p é c i e s. O s e u o b j e t i vo e s t á m a ior itar i a m e n t e c e n t r a d o n o c u lt i vo d e e s p é c im e s p a r a r e p o v o a m e n t o d e s t o c k s, t e n d o j á p r o d u z i d o t o n e la d a s d e j u v e n is p a r a r e p o v o a m e n t o d e l o c a i s, o n d e s e v e r if i c a u m a d e p l e ç ã o d a s h a b it u a is e s p é c ie s n a t i v a s, s e n d o t a m b é m p r o d u z i d a s u m a g r a n d e q u a n t id a d e d e h o lot ú r ia s p a r a o m e r c a d o d e e xp o r t a ç ã o p a r a f ins a l im e n t a r e s ( B e l l e t a l., ). O c u lt i v o d e h o lotúr ia s e m s ist e m a s d e a q u a c u ltur a s u r g iu n a C h i n a e m , c o m a p r o d u ç ã o d e j u ve n is d e St i c h o p u s j a p o n ic u s, e m c u lturas p e n. Est a s c o n t in u a m a s e r u t ilizadas e m m u it a s p r o v ín c i a s e c a r a c t e r i z a m - s e p e la c u lt u r a d e j u v e n is e a d u lt o s e m á g u a s m a r i n h a s c a lm a s e d e b a i x a p r o f u n d id a d e, c o m e s t a c a s e r e d e s a d e l i m it a r o e s p a ç o. S e n o i n íc i o o c u ltivo s u r g iu p o r f o r m a a r e p o v o a r o s s t o c k s d e s t a e s p é c i e d e a lt o va l o r c o m e r c i a l, c o m o e v o l u i r d a t e c n o l o g i a a s s o c ia d a à a q u a c u ltura, f o r a m intro d u z id a s n o v a s e s p é c ie s e n o v o s s istem a s d e c u lt i vo i n d o o r e o u t d o o r. Atualment e s ã o j á a lg u m a s a s e s p é c i e s c u lt i va d a s e m a q u a c u lt u r a, c o m o p o r e x e m p lo, Ho lot h u r i a s c a b r a, H o l o t h u r i a f u s c o g i lv a, e n t r e o u t r a s d e e l e v a d o va l o r e c o n ó m ico ( Batta g le n e, ; C h e n, ). N o e n t a n t o, e x i s t e m a in d a lacunas n o e s t u d o d a r e p r o d u ç ã o d e v á r ias e s p é c i e s. A e s p é c ie Ho l o t h u r i a s c a b r a é d a s p o u c a s c u j a

28 Introdução t e c n o logia d e c u lt ivo s e e n c o n t r a b e m e s t u d a d a, f u n d a m e n t a d a e a p l ic a d a ( Morgan, 2000; Ramof a f ia e t a l., ; I v y e t a l., 2006). O e s t u d o d a b io l o g i a r e p r o d u t i v a d e d e t e r m in a d a e s p é c ie é o p r im e iro p a s s o p a r a q u e s e j a p o s s ível a r e a l i z a ç ã o d o s e u c u lt i vo e m a q u a c u lt u r a. A r e p r o d u ç ã o é r e g u l a d a por f a t o r e s e n d ó g e n o s m a s é a f e t a d a p o r f a t o r e s e x ó g e n o s, c o m o p o r e x e m p l o a t e m p e r a t u r a, s a l in id a d e, d isponibilidade d e a l im e n t o, f a t o r e s d e s t r e s s, c i c l o s lu n a r e s, e n t r e o u t r o s. A s s im, e x i s t e m d iferenças d e s i n c r o n i z a ç ã o n o p e r ío d o e m q u e a s g ó n a d a s e s t ã o m a d u r a s e p r o n t a s p a r a a d e s o v a, e n t r e e s p é c ie s d e z o n a s t r o p ic a is e t e m p e r a d a s, e m e s m o e n t r e d e t e r m in a d a s r e g iõ e s g e o g r á f ic a s à m e s m a l a t it u d e ( T u wo e Co n a n d, ; Batta g l e n e, ; R a m o f af ia e t a l., ; S h i e l l e Uthicke, 2006). O e s t a d o d e m a t u r a ç ã o d a s g ó n a d a s é a va l i a d o e d e s c r ito s e g u n d o c i n c o e s t á g io s f u n d a m e n t a i s d e d e s e n v o l v imento: I i n d e t e r m in a d o, I I c r e s c iment o, I I I m a d u r o, I V p a r c i a lment e d e s o v a d o e V d e s o v a d o. Est e s e s t á g i o s s ã o a v a l i a d o s s e g u n d o o Í n d ic e G o n a d o s s o m á t i c o e t e n d o p o r b a s e v á r ios c r it é r io s r e lat i vos a o s t ú b u l o s d a s g ó n a d a s : c o r, c o m p r imento d o s t ú b u lo s, d i â m e t r o d o s t ú b u l o s, p r e s e n ç a d e r a m if ic a ç õ e s, m o r f o log ia e h i s t o l o g i a. A h i s t o l o g ia p e r m ite a va l i a r o e s t a d o d e o o g é n e s e e e s p e r m a t o g é n e s e e, a t r a v é s d e m icr o f o t o g r a f ia, é p o s s ível o b s e r v a r e s s e s e s t a d o s d e m a t u r a ç ã o ( Ram o f af ia e t a l., 2003). A s g ó n a d a s, a p r e s e n t a n d o a f o r m a d e t ú b u l o s, c o n s t it u e m a p r im e ira l in h a d e a v a l i a ç ã o d o e s t a d o d e m a t u r a ç ã o. Uma g ó n a d a m a d u r a a p r e s e n t a t ú b u los c o m u m a g r o s s u r a c o n s id e r á ve l, n ã o s e n d o n e c e s s a r i a m e n t e d e m a s i a d o l o n g o s e m c o m p r imento. No e n t a n t o, g ó n a d a s m a d u r a s s ã o s in ó n im a s d e t ú b u lo s c o m u m d i â m e t r o c o n s i d e r á v e l e o n d e é p o s s ível v e r a o lh o n u o s o ó c itos ( f ê m e a s ) o u v e r u m int e r ior o p a c o, c a r a c t e r íst i c o d e u m l ú m e n p r e e n c h id o p o r e s p e r m a t o z o a ( e s p e r m a t ó c it o s m a d u r o s ) ( m a c h o s ). P e lo c o n t r á r io, t ú b u lo s f i n o s o u d e m a s ia d o t r a n s lú c idos e c o r e s p á l id a s, s ã o s i n ó n imo d e g ó n a d a s e m d e s e n v o l vi m e n t o o u d e s o v a d a s, e s t a n d o a c o n f irmação d e s t e s e s t a d o s, d e p e n d e n t e d e a n á l i s e s h istológicas ( f ig u r a 2 ) ( T u wo e C o n a n d, ). 6

29 Introdução Figura 2. Anatomia dos ovários e testículos da espécie Holothuria forskali, com os respetivos estágios de desenvolvimento dos túbulos. T1: primeiros túbulos; T2: túbulos secundários; T3,T4: túbulos maduros, T5: túbulos desovados, GB: estrutura da gónada, DM: mesentério dorsal (Adaptado de Tuwo e Conand, 1992) Pot e n c i a l biot e c n o l ó g ic o d e h o lotúrias O s o r g a n i s m o s m a r i n h o s e a s h o lot ú r ia s e m p a r t icular r e p r e s e n t a m u m g r u p o d e e x c e l ê n c ia n a o b t e n ç ã o d e c o m p o s t o s b i o a t i v o s. As h o lotúrias, d a d a a s u a n a t u r e z a s é s s i l e a u s ê n c ia d e e s t r u t u r a s q u e l h e s c o n f ir a m a lg u m t ip o d e p r o t e ç ã o, p o s s u e m n o s s e u s c o r p o s m o le s, m e c a n i s m o s d e a d a p t a ç ã o à s c o n d ições a m b ie n t a is a d v e r s a s e d e p r o t e ç ã o c o n t r a p r e d a d o r e s. Ao h a b it a r e m o i n t e r t id a l, m u itas e s p é c ie s e s t ã o f r e q u e n t e m e n t e e x p o s t a s a s ituações d e s t r e s s, c o m o a p r o lo n g a d a e x p o s iç ã o à r a d ia ç ã o s o l a r, f a lta d e o x ig é n i o, a lterações d e s a l in i d a d e e p H. A s s im, e s t e s o r g a n i s m o s d e s e n vo l v e r a m, o b r ig a t o r i a m e n t e, m e c a n ismos d e a d a p t a ç ã o, q u e lh e s c o n f e r is s e m r e s i s t ê n c i a a e s t a s p e r t u r b a ç õ e s, n o m e a d a m e n t e a o n ível d a r e d u ç ã o d o s t r e s s o x i d a t i vo, r e s u ltado d a l o n g a e x p o s ição a o s UV ( r a i o s u ltravioletas), e n t e r r a r e m - s e n a a r e ia e b a i x a r e m o s e u m e t a b o l ismo, p a r a r e s i s t ir à f a lta d e o x ig é n i o e a lterações d e s a l in id a d e, r e s u ltant e s d e c ic l o s d e m a r é ( K ijjoa e S a wa n g won g, ; Bor d b a r e t a l., ). A l é m d a s p r e s s õ e s f ís i c a s, e s t e s o r g a n ism o s m a r i n h o s t a m b é m e s t ã o s u j e i t o s a p r e s s õ e s e c o l ó g i c a s, c o m o a c o m p e t iç ã o p e lo e s p a ç o e a p r e d a ç ã o, le v a n d o - o s a d e s e n vo l v e r e s t r a t é g i a s q u e l h e s p e r m itam s o b r e v i v e r, t a is c o m o p r o c e s s o s f ís icos ( e n t e r r a r e m - s e n o s u b s t r a t o ) e q u ím icos. E s t e s p r o c e s s o s q u ím icos c o n s ist e m, f u n d a m e n t a lm e n t e, n a p r o d u ç ã o d e m o l é c u las t ó x i c a s p e l o o r g an i s m o, q u e s ir vam p a r a a s u a d e f es a f a c e a p o t e n c i a i s a m e a ç a s, l e s a n d o o p r e d a d o r. N a g r a n d e m a i o r ia d a s 7

30 Introdução e s p é c ie s, e s t a s m o lé c u la s t ó x ic a s s ã o p r o d u zi d a s c o m o m e t a b o l itos s e c u n d á r io s, n ã o e s t a n d o d iret a m e n t e e n v o l v i d a s n a s a t i v i d a d e s v it a is d o o r g a n ism o, c o m o a r e s p ir a ç ã o, d ig e s t ã o, e x c r e ç ã o, e n t r e o u t r o s ( B o r d b a r e t a l., ). N o s ú lt im o s a n o s, t e m - s e v i n d o a a s s ist ir a u m a c o n s t a n t e p r o c u r a d e n o v o s p r o d u t o s n a t u r a i s, c o m i n t e r e s s e e m d if e r e n t e s á r e a s, c o m o p o r e x e m p lo a a l imentar, a c o s m é t ic a e a f a r m a c ê u t ic a, e x ist in d o u m p a r t ic u lar i n t e r e s s e n o s o r g a n i s m o s m a r i n h o s. Est e i n t e r e s s e e s t á int imam e n t e r e laci o n a d o c o m o s c o m p o s t o s s e c u n d á r i o s q u e e s t e s p r o d u z e m. F o i j á d e m o n s t r a d o q u e e s t a s m o lécula s p o d e m p o s s u ir d if e r e n t e s a t i v i d a d e s b i o lóg icas, c o m o a n t ib a c t e r ia n a, a n t if ú n g i c a, a n t i o x i d a n t e, a n t itum o r a l, e n t r e o u t r a s ( Du a n e t a l., ; Ma y e r e G u s t a f s o n, ). As h o lot ú r ias n e s t e c a m p o t ê m d e s e m p e n h a d o u m p a p e l d e d e s t a q u e, c o m o s s e u s m e t a b o litos s e c u n d á r io s a s e r e m c o n t i n u a m e n t e e s t u d a d o s e a p r e s e n t a n d o u m g r a n d e p o t e n c i a l n a s a t i v i d a d e s a c im a d e s c r itas ( Abr a h a m e t a l., ; Z h a n g e t a l., ; A lthunib a t e t a l., ; V a n Dyck e t a l., ; B o r d b a r e t a l., ). O s g licosíd e o s t r iter p é n ic o s, t a m b é m c o n h e c i d o s p o r s a p o n i n a s o u n o c a s o d a s h o l o t ú r ia s, h o lot u r in a s ; s ã o a m a ior c l a s s e d e m e t a b o l itos s e c u n d á r io s p r o d u z i d o s p o r e s t e s o r g a n ism o s. Est a s s a p o n i n a s e s t ã o r e p o r t a d a s n a l it e r a t u r a c o m o s e n d o p o s s u id o r a s d e u m l a r g o e s p e t r o d e e f e itos f a r m a c o lóg icos, c o m o : a t i v i d a d e s a n t i i n f lam a t ó r ia s, a n t it u m o r a i s, a n t io x i d a n t e s, a n t im icrobia n a s, a n t i v i r a is, e n t r e o u t r a s ( Z h a n g e t a l., ; Han e t a l., ; V a n D y c k e t a l., ; B o r d b a r e t a l., ; C a r e a g a e t a l., ). A s u a e s t r u t u r a q u ím ic a é d o t ip o l a n o s t e r o l, c o m u m a c a d e ia d e 1 8 l a c t o n a s e u m a c a d e ia d e a ç ú c a r l ig a d a a o c a r b o n o 3 d o a g licone 3 ( Z h a n g e t a l., ; H a n e t a l., ; Van D y c k e t a l., 2009). E s t u d o s a n t e r ior e s r e v e lar a m q u e n ã o s ó a s s a p o n i n a s s ã o r e s p o n s á v e is p o r v á r ia s a t i v i d a d e s j á d e s c r it a s, m a s t a m b é m o s p o l issacar íd e o s, is o la d o s d e v á r ias e s p é c ies d e h o lot ú r ias, p o s s u e m e f e it o s a n t io x i d a n t e s e a n t itumor a is. C o m o j á f o i a n t e r i o r m e n t e r ef e r ido, a m a ior p a r t e d a s e s p é c ie s d e h o l o t ú r i a s e s t ã o s u j e itas a c ic l o s d e m a r é, f icando e x p o s t a s à r a d ia ç ã o s o lar d u r a n t e l o n g o s p e r ío d o s d e t e m p o. A s s im, e ist o é p a r t i c u larme n t e v e r d a d e p a r a a s e s p é c ies t r o p ic a is, o n d e a r a d ia ç ã o UV é m a is i n t e n s a, n ã o é d e e s t r a n h a r q u e m u itas e s p é c ie s t e n h a m a d q u ir id o f o r m a s d e s e p r o t e g e r d o s t r e s s o x i d a t i v o. O int e r e s s e n a s h o lot ú r ia s c o m o f o n t e d e c o m p o s t o s b i o a t i v o s n ã o c o n h e c e b a r r e iras, s e n d o in ú m e r a s a s p o t e n c i a l i d a d e s d e s t e s o r g a n ism o s ( t a b e l a I I ). N o e n t a n t o, h á q u e r ef e r ir q u e a t u a lmente o u s o d a s mo l é c u las id e n t if ic a d a s c o m o r e s p o n s á v e is p o r d e t e r m i n a d a a t i v i d a d e, a in d a s e e n c o n t r a n a s f a s e s d e s c r e e n i n g ( e s t u d o / id e n t if ic a ç ã o ) e e n s a io s p r é c l ín ic o s. 8

31 Introdução R e c e n t e m e n t e, c ie n t ist a s j a p o n e s e s p a t e n t e a r a m o s s e u s r e s u lt a d o s c i e n t íf ic o s, r e l a t i v o s a o u s o d e s u lf a t o d e c o n d r o it i n a e x t r a íd o d e h o l o t ú r i a s, q u e p r o v o u t e r r e s u ltados e n c o r a j a d o r e s no t r a t a m e n t o d e d o e n t e s c o m HIV ( v írus d a imunodef i c iência h u m a n a ) ( C h e n e t a l., ). Tabela II. Interesse farmacêutico e medicinal de compostos bioativos extraídos de holotúrias (adaptado de Bordbar et al., 2011). Espécies Compostos bioativos Atividades farmacológicas/medicinais Holotúria scabra Holothuria leucospilota Cucumaria frondosa Stichopus variegatus Theleonota ananas Actinopyga echinites Actinopyga miliari Holothuria atra Holothuria scabra Holothuria polii Cucumaria frondosa Psolus patagonicus Glicosídeos triterpénicos Oligoglicosídeos triterpénicos Glicolípidos Sulfato de condroitina fucosilada Glicosídeos triterpénicos Saponinas esteróides Glicosídeos triterpénicos sulfatados Peptídeos bioativos Anticancerígeno Anticoagulante Antimicrobiano, Antibacteriano e antifúngico Cucumaria frondosa Fenóis e flavonóides Antioxidante Stichopus japonicus Holothuria scabra Peptídeos colagénios Proteínas hidrosiladas Holothuria forskali Saponinas Antitumoral Cucumaria japonica Glicoproteínas Holothuria nobilis Polissacarídeos sulfatados Regeneração de feridas Holothuria tubulosa Holothuria mammata Holothuria polii Ácidos gordos polinsaturados 1. 4 H o l o t ú r ia s, u m n o v o r e c u r s o a l imentar d e a lto v a lor n u t r ic i o n a l O u s o d e h o lot ú r ias c o m o r e c u r s o a l imentar, d e s d e h á m u it a s d é c a d a s q u e s e e n c o n t r a im p l e m e n t a d o, e m p a ís e s c o m o a Ch i n a, J a p ã o, I n d o n é s ia, S i n g a p u r a, F i lipin a s, Au s t r á l ia, e n t r e o u t r o s. E s t a s, c o m o j á f o i r ef e r id o, s ã o c o n h e c id a s p o r b ê c h e de m e r (W e n e t a l., 2010; Anderson e t a l., ; Sicur o e L e v i n e, ). O int e r e s s e a l im e n t a r s u r g iu p r im e i r a m e n t e d e v i d o à s u a f á c i l o b t e n ç ã o p e l a s c o m u n i d a d e s l o c a is p i s c a t ó r ia s. Se n d o, s e f o r 9

32 Introdução v i s t o à l u z d e d é c a d a s p a s s a d a s, u m r e c u r s o c o m u m a g r a n d e a b u n d â n c ia (An d e r s o n e t a l., 2011). A l i a d o a o int e r e s s e a l iment a r r e c o n h e c i d o, e s t á o f a t o r p r e p o n d e r a n t e p e l a q u a l s ã o c o n s u m id o s. As h o lot ú r ia s, s o b o p o n t o d e v i s t a n u t r i c i o n a l, s ã o i d e a is p a r a s e r e m i n t r o d u z i d a s n a s d i e t a s a l imentar e s, p o is s ã o r ic a s e m p r o t e ín a s e b a i x a s e m g o r d u r a s, p o s s u in d o u m e l e va d o t e o r e m á c id o s g o r d o s e s s e n c i a is c o m o E P A ( á c id o e i c o s a p e n t a e n ó i c o ), D HA ( d o c o s a h e xa e n ó ic o ) e A R A ( á c i d o a r a q u id ó n i c o ) ( Z h o n g e t a l., ; A y d in e t a l., ; Y a h ya v i e t a l., ). A s p r o p r ie d a d e s n u t r i c io n a is d a s h o l o t ú r i a s e s t ã o i n t im a m e n t e r e l a c i o n a d a s c o m o s e u int e r e s s e a n ível d a m e d ic in a. A s u a u t i l i z a ç ã o n a c u r a d e f e r i d a s i n t e r n a s e e x t e r n a s, a t r a v é s d a r e g e n e r a ç ã o d o s t e c id o s c o m o p o r e xem p lo r e s u lt a n t e s d e u m a c e s a r i a n a, e s t ã o p a r t i c u la r me n t e a s s o c ia d o s à p r e s e n ç a d e a ltos n íveis d e E P A e g l icosam in o g l i c a n o s ( c a d e ias l i n e a r e s d e p o l issacar íd e o s, c o n s t it u íd o s p o r s u b u n id a d e s r e p e t id a s de d i s s a c a r íd e o s ). T ê m c o m o c a r a c t e r ís t ic a importa n t e a s u a c a r g a n e g a t i v a, q u e f a z c o m q u e r e t e n h a m s ó d io, q u e p o r s u a v e z v a i l e v a r a u m a m e l h o r r e t e n ç ã o d e á g u a ), q u e a p r e s e n t a m p r o p r i e d a d e s j á r e p o r t a d a s n a c u r a d e f e r id a s ( L i u e t a l., ; A y d i n e t a l., 2011). O s á c id o s g o r d o s e s s e n c i a i s c o m o o s E PA ( á c id o e i c o s a p e n t a e n ó i c o ), D HA ( á c i d o d o c o s a h e x a e n ó ic o ) e ARA ( á c ido a r a q u id ó n i c o ) n ã o s e e n c o n t r a m n a t u r a lm e n t e s int e t i z a d o s no c o r p o h u m a n o, p e l o q u e t ê m d e s e r s u p l e m e n t a d o s p e l a v ia n u t r ic i o n a l. Estes e s t ã o p r e s e n t e s e m e le v a d a s c o n c e n t r a ç õ e s e m o r g a n ism o s f itopla n t ó n i c o s c o m o a s m icr o a lg a s. A o s e r e m f i ltrador e s a t i v o s, a s h o lotúrias a l imentam - s e d e v á r ias e s p é c i e s d e m icr o a lg a s. S ã o e s c a s s o s o s e s t u d o s c e n t r a d o s n a c o m p o s i ç ã o n u t r ic i o n a l d a s h o l o t ú r i a s, a n ível g l o b a l. No e n t a n t o, a lg u n s a u t o r e s t ê m v in d o a d e d i c a r - s e a e s t a t e m á t ica. E m Po r t u g a l, o c o n s u m o d e h o lot ú r ia s é in e x ist e n t e. No e n t a n t o, e m E s p a n h a, m a i s p r e c is a m e n t e n a r e g i ã o d a C a t a lunha, a e s p é c ie St ichopus r e g a l is ( p e p ino r e a l) é c o n s id e r a d a u m a ig u a r i a g o u r m e t e c o n s t it u i u m d o s p r o d u t o s m a r in h o s m a i s c a r o s d o m e r c a d o, a t i n g in d o p r e ç o s d a o r d e m d o s e u r o s kg - 1. O s e u i n t e r e s s e e a lto v a l o r c o m e r c i a l e s t ã o a s s o c ia d o s a o f a c to do m ú s c u l o s e r c o n s iderado u m a ig u a r i a e d e n ã o s e r u m a e s p é c ie d e f á c i l a c e s s o ( h a b i t a p r o f u n d i d a d e s d e s d e 1 0 a m e t r o s ) ( Pa ws o n e t a l., 2009; R a m ó n e t a l., ). 10

33 Objetivos 2. 1 O b j e t i v o g e r a l A a q u a c u ltura t e m v i n d o a a p r e s e n t a r - s e c o m o a i n d ú s t r ia d e e x c e lência p a r a a p r e s e r v a ç ã o d a s e s p é c ie s. As t e c n o l o g i a s d e c u lt i vo t ê m s ido m e lh o r a d a s, n o s e n t i d o d a o t im i z a ç ã o d a p r o d u ç ã o. N o e n t a n t o, p a r a q u e e s t a in d ú s t r ia c o n t i n u e a s e r r e n t á v e l, e s t u d o s s o b r e a b i o log ia r e p r o d u t i v a d e v á r ia s e s p é c ies t e r ã o d e s e r r e a l i za d o s. A s h o l o t ú r i a s p o s s u e m a i n d a p o t e n c i a lidades r e c o n h e c i d a s n o c a m p o d a b i o t e c n o log ia, a o s i n t e t i z a r e m in ú m e r o s c o m p o s t o s s e c u n d á r io s c o m i m p o r t a n t e s a t ividades f u n c i o n a is. Est e s c o m p o s t o s t ê m v i n d o a s e r e s t u d a d o s t e n d o e m v i s t a a i m p l e m e n t a ç ã o d e n o v a s t e r a p ia s e d e s e n v o l v im e n t o d e n o v o s f á r m a c o s. A n ível a l im e n t a r, s ã o a m p l a m e n t e c o n s u m i d a s n a r e g ião a s iát ic a o n d e s ã o c o n s id e r a d a s u m a ig u a r ia, e c u j o v a lor n u t r ic i o n a l é d e e x c e l ê n c i a p a r a a s a ú d e h u m a n a, d a d o o s s e u s a lt o s n íveis em ácid o s g o r d o s e s s e n c ia i s c o m o E P A, DHA e ARA. N e s t e c o n t e xt o, t ivemos c o m o o b j e t ivo g e r a l a p r o f u n d a r o s c o n h e c im e n t o s d a b i o l o g i a r e p r o d u t iva d e d u a s d a s e s p é c ies d e h o lot ú r ia s c o m m a io r d i s t r ib u ição n a n o s s a c o s t a. A l é m d o o b j e t i vo a n t e r i o r t a m b é m n o s p r o p u s e m o s a v a l i a r o p o t e n c ial b i o t e c n o l ó g i c o e o p e r f i l l i p íd ic o d a s t r ê s e s p é c i e s, H o lot h u r ia f o r s k a li, H o l o t h u r ia mamma t a e St ic h o p u s r e g a l is. D e s t a f o r m a, o s o b j e t i v o s d e s t e t r a b a lh o c o n s i s t e m e m : a) E s t u d a r a b i o logia r e p r o d u t i v a d e d u a s e s p é c ie s d e g r a n d e d i s t r ib u i ç ã o e a b u n d â n c ia n a c o s t a p o r t u g u e s a e e s p e c if ic a m e n t e e m P e n i c h e, Ho l o t h u r i a f o r s k a l i e Ho l o t h u r ia m a m m a t a ; b) A v a l i a r o p o t e n c i a l b iot e c n o l ó g i c o d e t r ê s e s p é c ies e x i s t e n t e s n a c o s t a d e P e n i c h e, H o lot h u r i a f o r s k a li, H o l o t h u r i a m a m m a t a e St ic h o p u s r e g a l is, r e lat i v a m e n t e à s s u a s a t i v i d a d e s a n t i o x i d a n t e, a n t im icrobia n a e c itot ó x ic a ; c) A v a l i a r o p e r f i l l ip íd i c o d a s t r ê s e s p é c i e s s u p r a c itadas O b j e t i v o s e s p e c í f ic o s E s t e t r a b a l h o a s s u m e a s s im d u a s v e r t e n t e s d ist i n t a s, m a s q u e e s t ã o int e r l igadas, n a a q u is iç ã o d e n o v o s c o n h e c im e n t o s s o b r e u m a d a d a e s p é c i e. N a v e r t e n t e d a a q u a c u ltur a, p r e t e n d e - s e e s t u d a r a b i o l o g ia r e p r o d u t i v a d a s d u a s e s p é c i e s d e s c r itas n o p o n t o a ), a t r a vés d e : A v a l i a ç ã o d o Í n d ice Go n a d o s s o m á t ico; I d e n t if ic a ç ã o d o e s t a d o d e m a t u r a ç ã o d o s t ú b u lo s d a s g ó n a d a s ; A n á l i s e s h ist o lógicas. N a v e r t e n t e d a b i o t e c n o log ia, a p r o v e i t a n d o a s h o l o t ú r i a s c a p t u r a d a s p a r a a s a n á l i s e s h istológicas e a t r a v é s d a c a p t u r a 11

34 Objetivos de St ichopus r e g a lis p o r p e s c a d o r e s l o c a is, p r e t e n d e - s e e x t r a i r c o m p o s t o s b io a t i v o s, c o m r e c u r s o a s o l ve n t e s o r g â n i c o s d e d if e r e n t e s p o l a r i d a d e s ( m e t a n o l e d ic l o r o m e t a n o ). E s t e s e x t r a t o s s e r ã o u t i l izados p o s t e r iorme n t e p a r a : a) A v a l i a ç ã o d o p o t e n c i a l antioxidant e, p o r t r ê s m é t o d o s : Q u a n t if ic a ç ã o T o t a l d e P o lif e n ó is ( QT P), p e l o m é t o d o d e F o l in C i o c a lt e u ; A v a l i a ç ã o d a c a p a c i d a d e d e r e d u ç ã o d o R a d ic a l DPPH; A v a l i a ç ã o d a c a p a c i d a d e d e c a p t a ç ã o d o r a d ical p e r ó xi l o ( ROO ), pelo m é t o d o O R A C. b) A v a l i a ç ã o d a c a p a c i d a d e a n t imicrobiana: A v a l i a ç ã o d a c a p a c i d a d e a n t i b a c t e r i a n a a t r a v é s d a a v a l i a ç ã o d o c r e s c im e n t o d e b a c t é r i a s g r a m + e g r a m - r ef e r ê n c i a n a p r e s e n ç a e a u s ê n c ia d e e x t r a t o s ; A v a l i a ç ã o d a c a p a c id a d e a n t if ú n g ic a c o n t r a S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e e C a n d i d a a l b icans, na p r e s e n ç a e a u s ê n c ia d e e xt r a t o s ; R e a lização d e e n s a i o s d e d o s e - r e s p o s t a ( d e p e n d ê n c ia d e c o n c e n t r a ç ã o ), n a s f r a ç õ e s q u e e x i b irem m a i o r p o t e n c ia l, p a r a d e t e r m i n a ç ã o d a c o n c e n t r a ç ã o c a p a z d e r e d u z ir 5 0 % ( I C 50 ) n a r e d u ç ã o d o c r e s c imento d o s m icr o r g a n ism o s. c) A v a l i a ç ã o d a c a p a c i d a d e c itot ó x ic a : R e a lização d e e s t u d o s d e v ia b i l id a d e c e l u lar e d e p r o l if e r a ç ã o c e l u la r em c é lu la s H e p G - 2 ( c a r c inoma h e p a t o c e l u l a r d e f íg a d o h u m a n o ) e MC F - 7 ( c a r c in o m a d a m a m a ), p e lo m é t o d o d e f lu o r e s c ê n c i a ( d e s e s t e r if i c a ç ã o d a c a lc e ína AM) e p e l o m é t o d o e s p e t r o f o t o m é t r ic o ( r e d u ç ã o d o MT T ) ; R e a lização d e e n s a i o s d e d o s e - r e s p o s t a ( d e p e n d ê n c ia d e c o n c e n t r a ç ã o ) p a r a d e t e r m in a ç ã o d o I C 50, n a s f r a ç õ e s q u e e x i b ir e m m a ior e s e f e itos n a r e d u ç ã o d a v i a b i l id a d e e p r o l if e r a ç ã o c e lu l a r d a s l i n h a s t u m o r a i s e m e s t u d o. d) A v a l i a ç ã o d o p e r f i l l ip íd i c o : Q u a n t if ic a ç ã o d a g o r d u r a t o t a l e p e r f i l e m á c id o s g o r d o s p e lo s m é t o d o s d e B l ig h e D y e r ( ) e L e p a g e e Ro y ( ), r e s p e t i vamente. 12

35 Materiais e Métodos

36

37 Materiais e Métodos 3. 1 Amostra g e m b i o ló g ica e d e t e r m i n a ç ã o d o Í n d ice G o n a d o s s o m á t ico (GI) O p e r ío d o e x p e r imental d e c o r r e u d e 2 9 d e s e t e m b r o d e a 2 9 d e j u n h o d e , t e n d o s id o o b t id o s u m t o t a l d e i n d i v í d u o s d a e s p é c ie H o l o t h u r i a f o r s k a li e 7 3 i n d ivíd u o s d a e s p é c ie Ho l o t h u r ia m a m m a t a. As a mo s t r a g e n s r e a l i zaram - s e d u a s v e z e s p o r m ê s ( à e x c e ç ã o d o m ê s d e d e z e m b r o e m a r ç o e m q u e a p e n a s f o i p o s s ível u m a ú n i c a r e c o lha d e o r g a n ism o s, d e v i d o à s c o n d ições m e t e o r o l ó g ic a s a d v e r s a s ve r if i c a d a s n a z o n a, s e n d o de r ef e r ir q u e a e s p é c i e H o lot h u r ia m a m m a t a a p e n a s c o m e ç o u a s e r r e c o l h id a e m n o vem b r o, u m a v e z q u e p r im e iramente o e s t u d o c e n t r o u - s e a p e n a s n a e s p é c i e H o l o t h u r i a f o r s k a l i ), m a is p r e c i s a m e n t e n o iníc i o e n o f in a l d e c a d a m ê s, 1 0 a 1 5 in d i v íd u o s de Ho lot h u r i a f o r s k a l i e 1 0 a 1 5 in d i v íd u o s d e H o lot h u r i a m a m m a t a f o r a m r e c o l h id o s a l e a t o r i a m e n t e n a r e g iã o i n t e r t id a l ( zo n a e n t r e m a r é s ). A s h o l o t ú r i a s f o r a m r e c o lh id a s n a p r a i a d o Q u e b r a d o e d o P o r t in h o d a Ar e ia N o r t e, Pe n ic h e ( Po r t u g a l) e f o r a m d e v i d a m e n t e a c o n d ic i o n a d a s e m r e c i p ie n t e s d e p l á s t ic o, c o m á g u a s a lg a d a e t r a n s p o r t a d a s v i v a s p a r a o L a b o r a t ó r i o d e Aq u a c u lt u r a d a Es c o la S u p e r io r d e T u r i s m o e T e c n o l o g ia d o Ma r d e P e n ic h e. Aq u i, f o r a m e f e t u a d a s p e s a g e n s in d i v id u a i s, p e s a n d o - s e i n i c ialmente o i n d i v íd u o i n t e iro, d e s e g u i d a f o i p e s a d o o i n d i v íd u o e v i s c e r a d o ( r e m o ç ã o d e t o d o o s e u c o n t e ú d o interno d e s d e á r vores r e s p ir a t ó r i a s, int e s t in o, e s t ô m a g o, e t c. ) e p o s t e r iorme n t e, o p e s o t o t a l d a g ó n a d a ( q u a n d o p r e s e n t e ), t e n d o s id o c a lc u l a d o o Í n d ice G o n a d o s s o m á t ico ( G I ), e x p r e s s o e m p e r c e n t a g e m d o p e s o h ú m ido d a g ó n a d a p e lo p e s o h ú m i d o e v is c e r a d o d o in d i v íd u o ( e q u a ç ã o 1 ) : ( Eq u a ç ã o 1 ) E m q u e : - Pg : p e s o d a g ó n a d a ( g r a m a s ) ; - P: peso h ú m i d o e v i s c e r a d o d o in d i v í d u o ( g r a m a s ). A s g ó n a d a s q u a n d o p r e s e n t e s f o r a m f o t o g r a f a d a s. N o s in d i v íd u o s c o m p r e s e n ç a d e g ó n a d a f o r a m e f e t u a d a s a s s e g u int e s m e d ições e a n o t a ç õ e s : 1 ) C o m p r imento d o s t ú b u los; 2 ) Pr e s e n ç a d e r a m if icações; 3 ) D i â m e t r o d o s t ú b u lo s. E s t a s m e d i ç õ e s f o r a m r e a l i z a d a s r e c o r r e n d o a u m a L u p a b i n o c u l a r ( L u p a B in o c u lar Z e is s, St e m i Dv4, L e n t e s C a r l Z e iss). A s g ó n a d a s f o r a m p o s t e r io r m e n t e r e c o l h id a s e f i x a d a s e m f o r m o l t a m p o n a d o a 1 0 %, d u r a n t e 2 4 h o r a s, a t é s e r e m s u j e it a s a d e s i d r a t a ç ã o e i n c lu íd a s e m p a r a f ina. F o r a m u t i l i z a d o s 1 0 i n d i v íd u o s d a e s p é c i e H o lothur ia f o r s k a li e 1 0 indivíd u o s d a e s p é c i e H o lot h u r ia m a m m a t a p a r a a s a n á l is e s b i o t e c n o l ó g i c a s. Est a s f o r a m e m b a la d a s e c o n g e la d a s a C ( T h e r m o, E l e c t r o n C o r p o r a t io n ) a t é p o s t e r i o r u t i l i z a ç ã o. 15

38 Materiais e Métodos F o i t a m b é m r e a l i z a d o u m c o n t a c t o c o m p e s c a d o r e s lo c a i s n a D o c a p e s c a d e Peniche, t e n d o e s t e s c a p t u r a d o 1 0 in d i v íd u o s d a e s p é c ie St ic h o p u s r e g a l i s, q u e f o r a m c o n g e l a d o s a C, d e p o is d e e f e t u a d a s a s r e s p e t i va s p e s a g e n s e r e m o ç ã o d e t o d o o s e u c o n t e ú d o i n t e r n o ( e v i s c e r a ç ã o ) An á l i s e s h ist o ló g ic a s A p ó s o p e r íodo d e 2 4 h o r a s e m f o r m o l t a m p o n a d o a 1 0 %, a s g ó n a d a s f o r a m d is s e c a d a s e, d e v idam e n t e i d e n t if i c a d a s, f o r a m c o lo c a d a s n o p r o c e s s a d o r d e t e c id o s ( L e ic a, T P ), s e n d o s u j e it a s a u m p r o g r a m a d e d e s i d r a t a ç ã o d e t e c i d o s, u t i l i z a n d o d if e r e n t e s c o n c e n t r a ç õ e s d e á l c o o i s ( An e xo I ). F indo o p e r ío d o d e c o r r e n t e d a d e s i d r a t a ç ã o, a s a m o s t r a s f o r a m incluíd a s e m p a r a f i n a ( L e ic a EG 1120, C). O s c o r t e s h i s t o lóg ic o s f o r a m e f e t u a d o s a 8 µ m n o m icr ó t o m o ( Sakura A c c u c u t SRM ) t e n d o s id o o b t id o s 5 c o r t e s h i s t o l ó g ic o s p a r a c a d a g ó n a d a. E s t a s p r e p a r a ç õ e s f o r a m c o r a d a s c o m H e m o t o x i l in a E o s in a ( An e x o I I ) e o b s e r v a d a s a o m icr o s c ó p i o ó t ic o ( A xo s t a r P lu s, l e n t e s C a r l Z e iss) p a r a m e d iç ã o d o s o ó c it o s e p a r a v e r if ic a ç ã o d a p r e s e n ç a d e e s p e r m a t ó c itos. F o r a m r e g ist a d a s m e d i ç õ e s d e 5 o ó c it o s d e c a d a u m a d a s 5 l â m i n a s d e c a d a i n d i v íd u o, s e n d o e s t a s f o t o g r a f a d a s ( c â m a r a f o t o g r á f ic a C a n o n P o wer s h o t G 5 ). E s t e s r e g i s t o s f o r a m e f e t u a d o s n o s e n t i d o d e, à s e m e lhan ç a d o q u e f o i r e a l i z a d o p a r a o s t ú b u l o s d a s g ó n a d a s, d e f in ir 5 e s t á g ios d e g a m e t o g é n e s e : r e c u p e r a ç ã o, c r e s c iment o, m a d u r o, p a r c i a lment e d e s o v a d o e d e s o v a d o, d e a c o r d o c o m a t é c n i c a r e a l i z a d a p o r o u t r o s a u t o r e s ( Se we ll e B e r g q u ist ; T u wo e C o n a n d ; Ramof a f ia e t a l ). F o i t a m b é m r e a l i z a d o u m c o n t a c t o c o m o I n s t itut o P o r t u g u ê s d o Ma r e d a Atmosf e r a ( I P MA ) n o s e n t i d o d a f a c u lt a ç ã o d e d a d o s s o b r e a a g it a ç ã o m a r ít i m a e a t e m p e r a t u r a s u p e r f i c ia l d a á g u a ( An e xo I I I ), o b s e r v a d o s n o p e r íodo e x p e r imental d e c o r r id o. Este p e d i d o f o i g e n t i lme n t e a c e d id o p e lo r ef e r id o I n s t it u t o, t e n d o s id o o b t id o s o s d a d o s c o m a lg u m a s l a c u n a s r e s u ltantes d e p e r íodos d e n ã o m e d iç ã o d e v ido a m a n u t e n ç ã o d a s b ó ia s. O s d a d o s r ef e r e n t e s à a g it a ç ã o m a r ítima f o r a m r e c o lh i d o s e m P e n ic h e. N o e n t a n t o, o s d a d o s r e f e r e n t e s à t e m p e r a t u r a s u p e r f ic i a l d a á g u a d o m a r f o r a m r e c o l h id o s n a e s t a ç ã o m a i s p r ó x ima que é a e s t a ç ã o d a N a z a r é Prepar a ç ã o d o s e x t r a t o s N a p r e p a r a ç ã o d o s e xt r a t o s d e h o lot ú r ia s, a lém d a s d u a s e s p é c ie s u t i lizadas n a s a n á l ises h istológ ic a s, f o i a d ic i o n a d a m a is u m a, St ic h o p u s r e g a l i s. Os e x t r a t o s d e h o l o t ú r ias f o r a m p r e p a r a d o s d e a c o r d o c o m o m é t o d o a d a p t a d o p o r Ma y a c h ie w e s e u s c o l a b o r a d o r e s ( ). A s h o l o t ú r ia s, p r e v i a m e n t e c o n g e la d a s a C, f o r a m liof i l i z a d a s ( L i o f ilizador d e b a n c a d a Sc a n v a c C o o lsaf e ) d u r a n t e 2 d ias a C. Seguidam e n t e f o r a m t r itur a d a s ( s e p a r a d a m e n t e ). A e s t a b i o m a s s a s e c a f o i a d i c io n a d o m l d e m e t a n o l n u m g o b e l é ( u m p a r a c a d a e s p é c ie) ( > 9 9 %, F is h e r S c ie n t if ic, U K) q u e f o i d e i xa d o e m a g itação o v e r n i g h t, p r o t e g ido 16

39 Materiais e Métodos d a lu z. Post e r iormente e s t a s s o l u ç õ e s f o r a m f i ltradas e e v a p o r a d a s n u m r o t a v a p o r ( L a b o r a t a He i d o lp h ) a C, o b t e n d o - s e a s s im a s f r a ç õ e s m e t a n ó l ic a s p a r a c a d a e s p é c ie. R e a lizou-se o m e s m o p r o c e d im e n t o p a r a o s o l v e n t e d ic lo r o m e t a n o ( % ; F i s h e r Scient if ic, U K), p a r a s e r e m o b t id a s a s f r a ç õ e s d i c lor o m e t a n o d e c a d a e s p é c i e. A s f r a ç õ e s f o r a m e n t ã o s o lubilizadas e m D MSO ( D imet i lsulf ó x id o ) ( %, S ig m a, Stein h e im, G e r m a n y) e m a n t i d a s a C a t é p o s t e r io r u t i l i za ç ã o Avaliação da capacid a d e a n t i o x i d a n t e Q u a n t if i c a ç ã o T o t a l de P o l ifenóis O s c o m p o s t o s f e n ó l i c o s o u p o l if e n ó is s ã o a n t io x i d a n t e s c o m u m e le v a d o p o t e n c i a l j á r e p o r t a d o p o r v á r ios a u t o r e s e q u e e s t ã o p r e s e n t e s e m a l imentos c o m o legum e s, f r u t a s, ó leo d e p e i xe, v i n h o, p lant a s, a lg a s, e n t r e o u t r o s ( S t e r n e t a l., ; Ma m e lona e t a l., ; O n o f rej o v á e t a l., ). A importâ n c ia d e u m a d ieta à b a s e d e a n t i o x idantes p r e n d e - s e c o m o s s e u s b e n e f íc i o s p a r a a s a ú d e, a o r e d u z i r o r is c o d e d o e n ç a s c r ó n ic a s e d e g e n e r a t i vas r e l a c i o n a d a s c o m a o x i d a ç ã o d e b iom o lécula s v itais ( D NA, p r o t e ín a s, l íp i d o s, e t c. ), c o m o p o r e x e m p lo Alzheimer, c a n c r o, d o e n ç a s c a r d i o v a s c u l a r e s, a t e r o s c le r o s e, e n t r e o u t r a s. A s u a p r o t e ç ã o c o n t r a o s t r e s s o x id a t i vo inter n o é c o n f e r id a a t r a v é s d e v á r io s p r o c e s s o s, c o m o a r e g e n e r a ç ã o i n s itu d e m o lé c u las a n t io x i d a n t e s ( v itam in a s e e n z im a s ) o u d ir e t a n e u t r a lização d e c o m p o s t o s o x i d a t i v o s ( Mam e l o n a e t a l., 2007). A Q u a n t id a d e T o t a l d e Po l if e n ó is ( Q T P ) f o i a va l i a d a a t r a v é s d o m é t o d o d e F o lin C i o c a lt e u, a d a p t a d o a p a r t ir d o t r a b a lho r e a l i z a d o p o r Yu e s e u s c o l a b o r a d o r e s ( ). N u m m icr o t u b o a d ic i o n o u - s e µ l d e á g u a d e s t i l a d a, 1 0 µl d e a m o s t r a e 5 0 µl de r e a g e n t e d e F o l in C i o c a l t eu ( F l u k a B io c h e m ik a, Sig m a, S witz e r la n d ). A p ó s 2 m in u t o s a d ic ionou - s e µl d e c a r b o n a t o s ó d i o, Na 2 CO 3 a 2 0 % ( p / v ) ( Me r c k, Darms t a d t, G e r m a n y). P o s t e r iorme n t e, a r e a ç ã o f o i i n c u b a d a à t e m p e r a t u r a a m b i e n t e, n o e s c u r o d u r a n t e 1 h o r a. F in d o e s t e p e r ío d o, p r o c e d e u - s e à m e d ição d a s a b s o r v â n c ia s a u m c o m p r imento d e o n d a d e n m, n u m e s p e t r o f o t ó m e t r o d e a b s o r ç ã o m o le c u l a r ( He ʎ i o s α, T h e r m o E l e c t r o n Cor p o r a t io n ). D e m o d o a e xt r a p o l a r o s r e s u lt a d o s u t i l i zo u - s e o á c id o g á l i c o ( S ig m a, Stein h e im, G e r m a n y) c o m o p a d r ã o, s e n d o r e a l izada u m a c u r v a d e c a l ibr a ç ã o c o m d i f e r e n t e s c o n c e n t r a ç õ e s ( ; ; 0. 1 e 0. 3 m g m l - 1 ). A q u a n t id a d e t o t a l d e p o lif e n ó is f o i e x p r e s s a e m m i lig r a m a s d e e q u i v a l e n t e s d e á c i d o g á l i c o p o r g r a m a d e e xt r a t o ( EAG g - 1 e xt r a t o ) e t o d a s a s a m o s t r a s f o r a m a n a lisadas e m t r ip l ic a d o s Av a l iação d a c a p a c id a d e d e r e d u ç ã o d o r a d ical D PPH A c a p a c i d a d e d e r e d u ç ã o d o r a d ic a l DPPH ( Sig m a, S t e in h e im, G e r m a n y ) p e la s a m o s t r a s e m e s t u d o f o i a v a l i a d a a p a r t ir d o m é t o d o r e p o r t a d o p o r Du a n e s e u s c o l a b o r a d o r e s ( ). 17

40 Materiais e Métodos C o m e ç o u - s e p o r p r e p a r a r u m a s o lu ç ã o d e D PPH 0. 1 m M e m e t a n o l. D e s e g u i d a, n u m m i c r o t u b o, ju n t o u - s e 1 0 µl d e a m o s t r a a µl d a s o l u ç ã o d e DPPH, t e n d o - s e v o r t e x a d o. I n c u b o u - s e d u r a n t e 3 0 m i n u t o s n o e s c u r o à t e m p e r a t u r a a m b ie n t e e m e d iu - s e a a b s o r vâ n c i a n u m e s p e t r o f o t ó m e t r o d e a b s o r ç ã o m o l e c u lar ( He ʎ i o s α, T h e r m o E l e c t r o n Cor p o r a t i o n ), a u m c o m p r imento d e o n d a d e n m. T o d a s a s a m o s t r a s f o r a m a n a l is a d a s e m t r ip l ic a d o s. A c a p a c i d a d e d e r e d u ç ã o d o r a d i c a l D P P H f o i c a lc u l a d a a t r a v é s d a s e g u int e e q u a ç ã o ( Eq u a ç ã o 2 ) : O n d e : ( Eq u a ç ã o 2 ) - Abs c o n t r o l o : a b s o r vâ n c i a d e D P PH; - Abs a m o s t r a : a b s o r v â n c i a d e µl d e D P P H + 10 µl d e e x t r a t o ; - Abs b r a n c o : a b s o r vância d e µl d e e t a n o l µl d e e xt r a t o A v a l i a ç ã o d a c a p a c i d a d e d e c a p t a ç ã o d o r a d i c a l p e r ó x i lo (ROO ) - M é t o d o O R A C. A c a p a c id a d e d e c a p t a ç ã o d o r a d ical p e r ó x i l o ( ROO ) t e m s i d o r e f e r i d a c o mo " Ca p a c i d a d e d e a b s o r ç ã o d e r a d ic a is d e o x ig é n i o " ( m é t o d o O R A C) ( Cao e t a l., ). O m é t o d o O R AC c o n s iste n a m o n it o r i z a ç ã o d a o x id a ç ã o d e u m a s o n d a f lu o r e s c e n t e p e lo r a d ic a l p e r ó x i l o ( ROO ), t r a d u z i d a p e l a d im inuição d a i n t e n s idade d a s u a f l u o r e s c ê n c i a. A in i b iç ã o d e s s a o x i d a ç ã o, p o r u m a s u b s t â n c i a a n t io x i d a n t e é, n o m é t o d o O R A C, u m a m e d id a d a c a p a c id a d e a n t io x i d a n t e d e s s a s u b s t â n c i a p e r a n t e o r a d ic a l. A p a r t ic u lar id a d e d o m é t o d o O RA C é q u e a r e a ç ã o e n t r e a s o n d a e o r a d ic a l é l e v a d a a t é a o f i m, o u s e j a a t é à c o m p let a in i b iç ã o d a f lu o r e s c ê n c i a, s e n d o a q u a n t if icação d a i n ib iç ã o c o n s e g u id a p e lo c á lc u l o d a á r e a a b a i x o d a c u r v a ( AUC) d a r e a ç ã o. Est e c á l c u lo p e r m ite c o m b i n a r o t e m p o e o g r a u d e in ib i ç ã o d o s r a d i c a is p e lo a n t io x i d a n t e ( H u a n g e t a l., ). A f l u o r e s c e ín a é u m a m o l é c u la f lu o r e s c e n t e q u e t e m v indo a s e r u t i l i z a d a n e s t e t i p o d e m e t o d o l o g ia s. A s u a f l u o r e s c ê n c ia d im i n u i a p ó s o x i d a ç ã o p o r e s p é c ie s r e a t i v a s, n o m e a d a m e n t e p e lo r a d ic a l p e r ó x i l o ( R O O ) ( Hu a n g e t a l., ). Em g e r a l, o r a d ical p e r ó x i l o ( ROO ) é u m f o r t e a g e n t e o x i d a n t e. Este r a d i c a l t e m a c a p a c id a d e d e r e m o v e r H d e o u t r a s m o l é c u l a s, c o n s t ituindo u m a r e a ç ã o importante n a p e r o x id a ç ã o l i p íd i c a ( Me n é n d e z, ; S p iteller, 2003) E s t e t e s t e f o i r e a l i z a d o a p a r t ir d o m é t o d o d e s c r ito p o r D á v a lo s e s e u s c o l a b o r a d o r e s ( ). Numa p laca d e 9 6 p o ç o s, c o lo c o u - s e 2 0 µl d e c a d a a m o s t r a e a d ic i o n o u - s e µl de f lu o r e s c e ín a p r e v iam e n t e d i lu íd a e m t a m p ã o f o s f a t o a 7 5 n M. F o i r e a l i z a d a u m a le itura d u r a n t e 1 5 m in u t o s a C n u m l e it o r d e e s p e t r o f l u o r imetria ( S yn e r g y H 1 H y b r id Re a d e r, B i o t e k ) e, a p ó s e s s e p e r ío d o, c o lo c o u - s e 60 µl de AAP H ( Diclor i d r a t o d e 2. 2'- a z o b is-2 - a m id i n o p r o p a n o ) ( Aldr ic h Sig m a, Steinheim, G e r m a n y) ( 3 2 m M ) e m c a d a p o ç o e p r o c e d e u - s e à l e itur a d a f lu o r e s c ê n c ia d u r a n t e u m a c inét i c a d e 4 h o r a s e 1 5 m i n u t o s, c o m l e ituras r e a l i z a d a s a c a d a m in u t o. A l e itur a f o i r e a l i z a d a a n m e

41 Materiais e Métodos n m, c o m o c o m p r i m e n t o d e o n d a d e e x c it a ç ã o e e m i s s ã o, r e s p e t i vam e n t e ( C ). D e m o d o a e xt r a p o l a r o s r e s u ltados o b t i d o s u t i l i z o u - s e t r o l o x ( A ldr ic h - S ig m a, S t e i n h e im, G e r m a n y) c o m o p a d r ã o, s e n d o r e a l i z a d a u m a c u r v a d e c a l ibr a ç ã o c o m d if e r e n t e s c o n c e n t r a ç õ e s d e t r o lo x ( 0 ; 5 ; 1 0 ; 2 0 ; 4 0 e 80 µm ml - 1 ). A c a p a c id a d e a n t io x i d a n t e f o i e x p r e s s a e m m i c r o m o l a r d e e q u i v a le n t e s d e t r o lo x p o r g r a m a d e e x t r a t o e t o d a s a s a m o s t r a s f o r a m a n a l i s a d a s e m t r ip l ic a d o s. Par a t o d o s o s e n s a i o s a a v a liação f o i f e i t a c o m o c á lc u l o d a á r e a a b a i x o d a c u r v a d e o x id a ç ã o ( r e d u ç ã o d a f lu o r e s c ê n c i a ) d a f lu o r e s c e ín a Avaliação da capacid a d e a n t im icrobia n a Pr e p a r a ç ã o d o s m e io s d e c u lt u r a F o r a m u t i l i z a d o s t r ê s m e io s d e c u ltura dist int o s : o m e i o L u r ia - B e r t a n i ( L B) ( Me r c k, W h it e h o u s e St a t io n, NJ, U SA), p a r a o c r e s c im e n t o d e Escher i c h ia c o l i ( ATCC ), Escher ic h ia c o l i ( AT C C ), Ba c i l l u s s u b t i l is ( A T C C ), Pseudomonas a e r u g in o s a ( AT C C ) e Sa lm o n e lla e n t é r i c a ( AT CC ), o m e i o Y P D ( Ye a s t P e p t o n e D e xt r o s e ) p a r a o c r e s c imento d a l e v e d u r a S a c c h a r o m y c e s c e r e v is a e ( A T CC ) e C a n d id a a l b ic a n s ( AT C C ) e o m e i o T SB e n r iq u e c i d o c o m e x t r a t o d e l e v e d u r a p a r a o c r e s c im e n t o d e Staphylococcus a u r e u s ( AT C C ). T o d o s o s m e io s f o r a m p r e p a r a d o s d e a c o r d o c o m a s i n s t r u ç õ e s d o f o r n e c e d o r Av a l iação d a c a p a c id a d e a n t ib a c t e r i a n a E s t e e n s a i o f o i r e a l i z a d o u t i lizando, E s c h e r ichia c o l i ( A T CC ), Escher i c h ia c o l i ( A T C C ), B a c i l lu s s u b t ilis ( A T CC ), Ps e u d o m o n a s a e r u g inosa ( AT C C ), S a lmonella e n t é r i c a e St a p h y lo c o c c u s a u r e u s ( AT C C ). Est a s b a c t é r ias e n c o n t r a v a m - s e e m s t o c k a C. A a v a l i a ç ã o d a c a p a c i d a d e a n t i b a c t e r ia n a d o s e xt r a t o s d e h o lot ú r ia s, c o n s o a n t e a s d if e r e n t e s f r a ç õ e s o r g â n i c a s, f o i r e a l i z a d a a t r a vé s d o m é t o d o d e c r e s c iment o e m p la c a s d e 9 6 p o ç o s p a r a c a d a micr o r g a n ism o. F o i colocado em c a d a p o ç o 193 µ l d e m e io ( c o n s o a n t e c a d a m i c r o r g a n ism o ), a o q u a l s e j u n t o u 2 µ l e x t r a t o ( 1 m g m l - 1 ) e 5 µ l de i n ó c u l o ( m i c r o o r g a n i s m o ). F o i u t i l i z a d o u m f á r ma c o c o m o c o n t r o lo p o s itivo, o c lor o a n f e n ic o l à c o n c e n t r a ç ã o d e m g m l - 1 e f o r a m p r e p a r a d o s o s b r a n c o s p a r a c a d a a m o s t r a. T o d a s a s a m o s t r a s f o r a m f i ltradas e s t e r i lmente ( 0. 2 μ m, W h a t m a n, U. K.) e o s e n s a io s for a m r e a lizados e m 8 e x p e r iê n c ia s in d e p e n d e n t e s, e m c o n d i ç õ e s d e e s t e r ilidade. F o r a m f e it a s l e itur a s a o t e m p o z e r o e a o t e m p o c o r r e s p o n d e n t e a u m p o n t o n a f a s e e xp o n e n c ia l d e c r e s c i m e n t o d e c a d a m ic r o r g a n i s m o ( d e f in i d o e m e n s a i o s p r e l iminar e s ), n u m le itor de e s p e t r o f lu o r imetria ( S y n e r g y H1 H y b r i d R e a d e r, B iot e k ) a n m. A c a p a c id a d e a n t ib a c t e r ia n a f o i c a lculada p e la r e d u ç ã o d o c r e s c im e n t o e m r e l a ç ã o a o c o n t r o lo ( % d o c o n t r o lo) a t r a v é s d a s e g u int e e q u a ç ã o ( Eq u a ç ã o 3 ) : 19

42 Materiais e Métodos ( ) ( Eq u a ç ã o 3 ) O n d e : - A b s c o n t r o l o : a b s o r vâ n c i a d o c r e s c iment o d e c a d a i n ó c u l o ( m icr o r g a n ism o ), c o n s o a n t e o m e io d e c u lt u r a ; - Ab s a m o s t r a : a b s o r v â n c ia d o c r e s c imento d e c a d a i n ó c u lo na p r e s e n ç a d o s e xt r a t o s ; - Abs b r a n c o : a b s o r vância d o s e xt r a t o s n o m e io d e c u ltur a u t i l i za d o Av a l iação d a c a p a c id a d e a n t ifúngica A c a p a c i d a d e a n t if ú n g i c a d o s e xt r a t o s d e h o lot ú r ias f o i a v a l i a d a a t r a v é s d a m o n it o r i z a ç ã o d o c r e s c imento d e S a c c h a r o m y c e s c e r e v is ia e ( AT CC ) e Ca n d i d a a l b icans ( A T CC ) q u e s e e n c o n t r a v a m e m s t o c k a C. F o r a m u t i l i za d a s d u a s p la c a s d e 9 6 p o ç o s ( u m a p a r a c a d a m icr o r g a n i s m o ) e f o r a m f e it o s 8 e n s a i o s independentes c o m u m v o lume d e µl p o r p o ç o ( µl d e m e io Y P D + 2 µl d e c a d a e x t r a t o + 5 µ l d e i n ó c u l o ). F o i p r e p a r a d o o c o n t r o l o p o s it i v o e m q u e f o i u t i l i z a d o o f á r m a c o A n f o t e r ic i n a B à c o n c e n t r a ç ã o d e µ g m l - 1 e o s b r a n c o s d e c a d a a m o s t r a. As p l a c a s f o r a m i n c u b a d a s a C ( S. c e r e v i s iae ) e C ( C. a l b icans ) a r p m d u r a n t e 2 0 h o r a s e 8 h o r a s, r e s p e t i vam e n t e. E s t e s t e m p o s e s t ã o d e a c o r d o c o m o s o b s e r v a d o s p a r a a s c u r v a s d e c r e s c imento r e a l i z a d a s e m e n s a ios p r e l iminar e s, d e n o t a n d o a f a s e e x p o n e n c i a l d e c r e s c i m e n t o d e c a d a m i c r o r g a n ismo. Ant e s d a in c u b a ç ã o f o i r e a l i z a d a u m a l e it u r a a o t e m p o z e r o. F indo este per ío d o a s p l a c a s f o r a m l id a s n u m le it o r de e s p e t r o f lu o r imetria ( S yn e r g y H 1 H y b r i d R e a d e r, B iot e k ) a u m c o m p r imento d e o n d a d e n m. A s c o n d ições d e e s t e r i l id a d e f o r a m s e m p r e g a r a n t i d a s. A c a p a c id a d e a n t if ú n g i c a f o i c a lculada p e l a r e d u ç ã o d o c r e s c im e n t o e m r e l a ç ã o a o c o n t r o lo ( % d o c o n t r o lo) atr a v é s d a s e g u int e e q u a ç ã o ( Eq u a ç ã o 4 ) : ( ) ( Eq u a ç ã o 4 ) O n d e : - A b s c o n t r o l o : a b s o r v â n c ia d o c r e s c imento d e S. c e r e v is ia e o u C a n d i d a a l b ic a n s, e m m e io YPD; - Ab s a m o s t r a : a b s o r v â n c ia d o c r e s c imento d e S. c e r e v is i a e o u C. a l b ic a n s n a p r e s e n ç a d o s e xt r a t o s ; - Abs b r a n c o : a b s o r vância d o s e xt r a t o s n o m e io YPD. P a r a a s f r a ç õ e s q u e d e m o n s t r a r a m u m m a i o r p o t e n c ial s o b r e r e d u ç ã o d o c r e s c i m e n t o d o s m i c r o r g a n i s m o s r e l a t i vamente a o c o n t r o lo ( 5 0 % ), r e a l i z a r a m - s e e n s a ios d e d o s e - r e s p o s t a ( d e p e n d ê n c i a d a c o n c e n t r a ç ã o ) d e m a n e ir a a d e f inir o I C 50, i n c u b a n d o - s e a s c é l u la s c o m d if e r e n t e s c o n c e n t r a ç õ e s d e e x t r a t o ( 3 0 μ g m l - 1 e μ g m l - 1 ) d u r a n t e o s r e s p e t i vo s t e m p o s d e i n c u b a ç ã o e t e m p e r a t u r a s p a r a c a d a m icr o r g a n ism o. 20

43 Materiais e Métodos 3. 6 Avaliação do pot e n c ia l cit o t ó x i c o A a v a l iação d o p o t e n c ia l c it o t ó x i c o ( p r o l if e r a ç ã o c e lu l a r e t o x i c id a d e ) d o s d if e r e n t e s e xt r a t o s d e h o l o t ú r i a s f o i t e s t a d a e m d u a s l i n h a s c e lu lar e s t u m o r a i s h u m a n a s, a s c é l u las M C F - 7 e a s c é lu l a s He p G - 2. O m o d e l o c e lu l a r p r o ve n ie n t e d o c a r c i n o m a d a m a m a ( c é lu l a s MC F - 7 ) f o i o b t id o a t r a v é s d o L e ib n i z - I n s t i t u t D S MZ D e u t s c h e ( DSMZ n º A CC ). R e l a t i v a m e n t e a o c a r c i n o m a h e p a t o c e l u l a r d e f íg a d o h u m a n o ( c é l u l a s HepG - 2 ) a s c é lu l a s f o r a m o b t id a s a t r a v é s d a Am e r ic a n T yp e Cu lt u r e Co l l e c t io n ( AT C C H B ). A s c é lu l a s f o r a m c u lt i va d a s e m m e io R P MI ( Sig m a, U. S. A.) s u p lementado c o m 1 0 % d e s o r o f e t a l b o v in o ( F B S) ( G i b c o, U. S. A) e 1 % d e a n t ib i ó t i c o / a n t im icót i c o ( S ig m a, U. S. A), p a r a a l i n h a c e l u lar H e p g - 2. R e l a t i v a m e n te à l in h a c e l u lar MC F - 7, a s c é lu l a s f o r a m t a mb é m c u lt i v a d a s e m m e io RPMI ( S ig m a, U. S. A.) e f o r a m s u p lem e n t a d a s c o m 1 0 % d e s o r o f e t a l b o v ino ( F B S) ( G ib c o, U.S.A), 1 % d e a n t i b i ó t ico/ a n t im ic ó t ico ( Sig m a, U. S. A), 5 m l d e ME M ( a m i n o á c id o s n ã o e s s e n c ia i s ), 5 m l de p ir u v a t o d e s ó d i o a 1 m M e 0. 5 m l d e i n s u l in a h u m a n a a 1 0 µ g m l - 1 O m e i o d e c u lt u r a f o i s e m p r e m u d a d o 1 2 h o r a s a p ó s a s c é l u las s e r e m s e m e a d a s e p o s t e r iorme n t e d e t r ê s e m t r ê s d i a s p a r a a m b a s a s l i n h a s c e l u l a r e s. A s c é l u l a s f o r a m m a n t id a s e m c u ltur a n u m a i n c u b a d o r a d e CO 2 ( CO 2 Un it h e r m ) c o m 5 % d e CO 2, 9 5 % d e h u m i d a d e e uma t e m p e r a t u r a c o n s t a n t e d e 3 7 º C E n s a i o d e p r o l if e r a ç ã o c e l u lar e v ia b ilidade c e lu la r n a s c é lu l a s MC F - 7 e He p G - 2 A a v a l ia ç ã o d o e f e it o d o s e x t r a t o s d e h o l o t ú r ia s s o b r e a p r o l if e r a ç ã o c e lu l a r e v ia b i l id a d e c e l u lar d a s c é l u la s MC F - 7 e H e p G - 2 f o i a d a p t a d o d o m é t o d o r e a l i z a d o p o r Yu a n e W a ls h ( ). As c é lu la s MC F - 7 e He p G - 2 f o r a m s e m e a d a s e m p l a c a s d e 2 5 c m 2 c o m m e io R P MI ( p la c a s d if e r e n t e s p a r a l inhas c e lu l a r e s d if e r e n t e s ), d e m o r a n d o c i n c o a s e is d ias a t é a t ingir a c o n f l u ê n c ia t o t a l d a s p la c a s. A p ó s e s t e p e r ío d o, a s c é l u las p r e s e n t e s n a s p lacas d e 2 5 c m 2 f o r a m l e v a n t a d a s c o m t r ip s i n a ( S ig m a, U. S.A) e s e m e a d a s e m p lacas d e 9 6 p o ç o s, a d ic i o n a n d o - s e 2 0 μ l d e s u s p e n s ã o c e l u l a r e μ l d e m e i o R P MI c o m s o r o e m c a d a p o ç o. P a r a t e s t a r o e f e ito d o s e xt r a t o s d e h o l o t ú r ias na p r o l if e r a ç ã o c e lu l a r d a s li n h a s c e l u la r e s e m e s t u d o, o s e xt r a t o s ( d i s s o l v i d o s e m D MS O e c o n s o a n t e a s d if e r e n t e s f r a ç õ e s o r g â n ic a s ) f o r a m p r e p a r a d o s e m m e io d e c u ltur a s e m F B S e m e i o d e c u ltur a c o m F BS. A p ó s 3 6 h d a s c é lu l a s s e r e m s e m e a d a s e m p l a c a s d e 9 6 p o ç o s, r e m o ve u - s e o m e i o d e s t a s e a d ic ionou - s e μl d e m e io c o m F BS ( p a r a a s s e g u r a r o c r e s c imento c e l u l a r ) e μl d e m e io s e m F B S c o m e x t r a t o s de h o l o t ú r i a s, p r e v i a m e n t e f i ltrados ( 0. 2 μ m, W h a t m a n, U.K.). T o d a s a s f r a ç õ e s t e s t a d a s f o r a m i n c u b a d a s à c o n c e n t r a ç ã o d e 1 m g m l - 1 d u r a n t e 2 4 h o r a s. P a r a a v a l iar o e f e it o d o s e xt r a t o s d e h o l o t ú r i a s s o b r e a v i a b i l id a d e c e l u lar d a s l in h a s c e l u l a r e s e m e s t u d o f o i n e c e s s á r io e s p e r a r c e r c a d e 5 a 6 d i a s a t é q u e a s p la c a s d e 9 6 p o ç o s 21

44 Materiais e Métodos a t i n g i s s e m a c o n f lu ê n c ia t o t a l. O s e xt r a t o s, dis s o l v i d o s e m D MSO, e c o n s o a n t e a s d iferent e s f r a ç õ e s o r g â n i c a s, f o r a m d issolvid o s e m m e i o s e m F BS e f i l t r a d o s e s t e r i lmente ( 0. 2 μ m, W h a t ma n, U.K.). A p ó s a s p la c a s a t ing i r e m a c o n f lu ê n c i a c e lu l a r t o t a l e m t o d o s o s p o ç o s, r e m o ve u - s e o m e i o d e c u lt u r a e d e s e g u ida a d i c i o n o u - s e μ l d a s o l u ç ã o a n t e r i o r m e n t e p r e p a r a d a ( m e io s e m s o r o + e x t r a t o d e h o lotúria). T o d a s a s f r a ç õ e s f o r a m t e s t a d a s à c o n c e n t r a ç ã o d e 1 m g m l - 1 e i n c u b a d a s d u r a n t e 2 4 h o r a s. P a r a o s e xt r a t o s q u e d e m o n s t r a r a m m a i o r a t i v i d a d e s o b r e a i n i b içã o d a p r o l if e r a ç ã o c e lu l a r o u r e d u ç ã o d a v ia b i l id a d e c e lular d a s l i n h a s c e l u lares e m e s t u d o, r e a l i z a r a m - s e e n s a io s d e d o s e - r e s p o s t a ( d e p e n d ê n c ia d a c o n c e n t r a ç ã o ) d e m a n e ir a a d e f in ir o IC 50, in c u b a n d o - s e a s c é lu la s c o m d if e r e n t e s c o n c e n t r a ç õ e s d e e x t r a t o ( 1 0 μ g m l - 1 e μ g m l - 1 ) d u r a n t e 2 4 h o r a s. O e f e ito d a s d if e r e n t e s f r a ç õ e s d e h o l o t ú r ia s s o b r e a s l in h a s c e lu l a r e s e m e s t u d o f o i r e v e la d o p e l o m é t o d o d e MT T e p e lo m é t o d o d e c a lc e ína - A M. O p r o c e d imento p a r a o m é t o d o d e MT T e p a r a o m é t o d o d a c a lc e ín a - A M e n c o n t r a - s e d e s c r it o n o s p o n t o s e , r e s p e t i vam e n t e M é t o d o d e 3 - [ d imet h y lthiazo l y l]-2, 5 - d i p h e n y l tetra zo l i u m b r o m id e ( M T T ) E s t e m é t o d o b a s e ia - s e n a r e d u ç ã o d e s a is t e t r a z ó l ic o s d e MT T p o r d e s i d r o g e n a s e s m itocondr i a is m e t a b o l ic a m e n t e a t i v a s e m c r i s t a is d e f o r m a z a m. Po s t e r i o r m e n t e, e s t e s c r istais s ã o d i s s o l v i d o s n u m s o l v e n t e o r g â n i c o d e m o d o a s e r e m m e d i d o s e s p e t r o f o t o m e t r i c a m e n t e, p e r m it i n d o c o n s t a t a r u m a r e l a ç ã o c o m o n ú m e r o d e c é lu l a s v i á v e is, p o is q u a n t o m a ior a q u a n t i d a d e d e c é lu l a s v i á v e is m a io r o n ú m e r o d e c r ist a is f o r m a d o s ( R o t t e r e t a l., ; Cast e l l e Gómez- L e c h ó n, ). A p ó s o p e r ío d o d e e x p e r iê n c i a d e f in i d o, a s p ir o u - s e o m e io c o n t e n d o o s e xt r a t o s d e h o l o t ú r i a s e l a v o u - s e a s c é lu las c o m μ l d e t a m p ã o H a n k s. Após e s t a l a vag e m a d i c io n o u - s e μ l d e MT T ( 1. 2 m M) ( S ig m a, G e r m a n y), p r e v i a m e n t e d i s s o l v i d o e m t a m p ã o H a n k s ( c o m p o s i ç ã o d o m e io e m m M: Na C l 1 3 7, K C l 5, Mg SO , N a 2 H PO , KH 2 PO , C a C l ; Mg C l , T r i s H C l e b u t ir a t o d e s ó d i o 1. 0, p H=7. 4 ) e f i ltrado e s t e r i lmente ( 0. 2 μ m, W h a t m a n, U.K.). D e s e g u i d a, a s c é l u las f o r a m in c u b a d a s 2 h o r a s a 3 7 º C, c o m 5 % CO 2, e m a t m o s f e r a h u m id if ic a d a ( 9 5 % ). P a r a s o l u b i l i zar o s c r ist a i s d e f o r m a zan r e s u lt a n t e s d a r e a ç ã o, a d i c io n o u - s e a t o d o s o s p o ç o s μ l de i s o p r o p a n o l ( Panreac, Es p a n h a ) c o n t e n d o M H C l, h o m o g e n e i z a n d o c o m o a u x íl i o d e u m a m icr o p i p e t a. Este p r o c e s s o f o i r e a l i z a d o e m g e l o. Post e r iorme n t e a s c é l u l a s f o r a m i n c u b a d a s 1 h o r a, à t e m p e r a t u r a a m b i e n t e, p r o t e g id a s d a lu z. F i n a lm e n t e o s r e s u lt a d o s f o r a m l i d o s n u m le itor d e e s p e t r o f l u o r imetria ( S y n e r g y H1 H yb r i d Re a d e r, B i o t e k ) a u m c o m p r imento d e o n d a d e n m Mét o d o d e c a lceí n a AM E s t e m é t o d o t e m p o r b a s e o f l u o r ó f o r o d a c a lc e ín a - AM. A c a lc e ína n a s u a f or m a n a t u r a l a p r e s e n t a f lu o r e s c ê n c i a, n o e n t a n t o 22

45 Materiais e Métodos u m a v e z e s t e r if i c a d a p e r d e e s t a c a r a c t e r íst i c a m a s g a n h a a c a p a c id a d e d e p e n e t r a r n a m e m b r a n a d a c é l u la. No i n t e r ior d e s t a, a s e s t e r a s e s e x ist e n t e s n o c itopla s m a q u e b r a m a s l ig a ç õ e s e s t é r e s, v o ltando a c a l c e ín a à s u a f o r m a n a t u r a l, e m it indo f lu o r e s c ê n c i a. Para a s e s t e r a s e s t e r e m u m a a t i v id a d e n o r m a l, a s c é lu l a s t ê m d e e s t a r v iá v e is, l o g o q u a n t o m a ior f o r a f l u o r e s c ê n c ia m a i o r s e r á o n ú m e r o d e c é l u l a s v i á v e is (Haye s, ). A s s im, f in d o o p e r ío d o d e e x p e r i ê n c i a d e f in id o, a s c é l u las f o r a m la v a d a s d u a s v e z e s c o m μ l d e t a m p ã o Ha n k s. De s e g u id a, f o i a d ic io n a d o a c a d a p o ç o μ l d e u m a s o l u ç ã o d e c a lc e ína 2 μ M ( p r e v i a m e n t e p r e p a r a d a e m t a m p ã o Ha n k s ), e x c e t o n o s p o ç o s d e f in id o s p a r a a va l i a r a a u t o f lu o r e s c ê n c i a c e l u lar, n o s q u a i s s e a d i c i o n o u μ l d e t a m p ã o H a n k s. A s p lacas d e 9 6 p o ç o s f o r a m i n c u b a d a s à t e m p e r a t u r a a m b ie n t e, p r o t e g i d a s d a lu z, d u r a n t e 3 0 m i n u t o s. Ap ó s e s t e p e r íodo o s r e s u lt a d o s f o r a m o b t id o s p e la le it u r a d e f lu o r e s c ê n c i a n u m l e it o r d e e s p e t r o f l u o r i m e t r i a, u t i l i z a n d o c o m o c o m p r im e n t o d e o n d a d e e x c itação 485 n m e u m c o m p r im e n t o d e o n d a d e e m issão 530 n m. O s r e s u ltados d o e f e ito d o s e xt r a t o s d e h o lot ú r ias s o b r e a p r o l if e r a ç ã o e a v i a b i l id a d e c e lu l a r d a s c é lu l a s MC F - 7 e H e p G - 2 s ã o a p r e s e n t a d o s e m p e r c e n t a g e m d o c o n t r o l o, s e n d o c a lc u l a d o s a t r a v é s d a s e g u inte e q u a ç ã o ( Eq u a ç ã o 5 ) : ( ) ( Eq u a ç ã o 5 ) O n d e F c o n t r o l o c o r r e s p o n d e à f l u o r e s c ê n c ia d o c o n t r o lo ( c é lu las c u lt i va d a s e m m e io d e c u lt u r a c o n t e n d o o c o n t r o l o ) e a F a m o s t r a c o r r e s p o n d e à f lu o r e s c ê n c i a d a a m o s t r a e m t e s t e ( c é l u las c u lt i va d a s e m m e i o d e c u ltur a c o n t e n d o o s e xt r a t o s d e h o l o t ú r ia s ) Q u a n t if i c a ç ã o d a g o r d u r a t o t a l e a v a l i a ç ã o d o p e r f i l e m á c idos g o r d o s d a s e s p é c ies e m e s t u d o P a r a a q u a n t if i c a ç ã o d a g o r d u r a t o t a l f o i n e c e s s á r i o p e s a r 1 0 g d e a m o s t r a n u m a b a la n ç a a n a l ít ic a ( Me t t l e r T o l e d o, d = 0. 1 m g ) e a d ic i o n a r 3 0 m l d e m e t a n o l:clorof ó r m io ( 2 : 1 ) ( F is h e r S c i e n t if ic, H P L C g r a d e / A n a lyt i c a l r e a g e n t g ra d e ), c o m h o m o g e n e i z a ç ã o p o s t e r i o r d u r a n t e 5 m in u t o s. D e s e g u id a, a d ic i o n o u - s e 4 m l de u m a s o lu ç ã o s a t u r a d a d e c l o r e t o d e s ó d io e m a g itação c o n t ínua, 1 0 m l d e c lor o f ó r m io e 1 0 m l d e á g u a ( F is h e r Sc ie n t if ic, HPLC g r a d e ). A m ist u r a f o i h o m o g e n e i z a d a d u r a n t e 5 m in u t o s e c o l o c a d a n u m b a n h o d e u ltra-sons ( VW R 4 5 K Hz, W ) d u r a n t e o m e s m o t e m p o. O c o n t e ú d o e x i s t e n t e f o i f i ltrado a t r a v é s d e p a p e l d e f i ltro (W h a t m a n, n. º 4 0 ) e o f i ltrado f o i t r a n s f e r i d o p a r a u m a a m p o l a d e d e c a n t a ç ã o. A f a s e o r g â n i c a f o i r e c o l h id a p a r a u m p a p e l d e f iltro (W h a t m a n, n. º 4 0 ) c o m s u lf a t o d e s ó d i o a n i d r o ( Pa n r e a c, Reag. U S P; P A - ACS-ISO) e f i ltrado p a r a u m v ia l p r e v i a m e n t e p e s a d o. O s o l v e n t e o r g â n ic o e x i s t e n t e n a m i s t u r a f o i e v a p o r a d o n u m r o t a v a p o r ( He id o lp h L a b o r o t t a e f f i c ient) à t e m p e r a t u r a m á x im a d e 4 0 º C. E s t e p r o c e s s o d e u - s e p o r c o n c lu íd o a q u a n d o d a p e s a g e m r ig o r o s a d o v ia l c o m a g o r d u r a e xt r a íd a ( Manir a k i z a e t. a l., ; Ba n d a r r a e t. a l., ). 23

46 Materiais e Métodos A p e r c e n t a g e m d e g o r d u r a t o t a l f o i e n t ã o c a l c u l a d a s e g u n d o a e q u a ç ã o ( Eq u a ç ã o 6 ) d e s c r ita a b a i x o. T o d o s o s e n s a i o s f o r a m r e a l i z a d o s e m t r i p l ic a d o s. O n d e : - V f : Pe s o d o v i a l f in a l (gramas); - V i : Pe s o d o v i a l in i c ia l (gramas); - P: Peso da a m o s t r a ( g r a m a s ). ( ) ( Eq u a ç ã o 6 ) A a v a l ia ç ã o d o p e r f i l l ip íd i c o a t r a vés d a a n á l is e d o s á c i d o s g o r d o s p a r a a s t r ê s e s p é c i e s d e h o l o t ú r i a s f o i r e a l i za d a a p a r t ir d a a d a p t a ç ã o d o m é t o d o d e L e p a g e e R o y ( ). C o m e ç o u - s e p o r p e s a r m g d e b i o m a s s a f r e s c a. De s e g u i d a, a d ic io n o u - s e 5 m l d e u m a s o lução p r e v iam e n t e p r e p a r a d a d e m e t a n o l e c l o r e t o d e a c e t i l o ( 2 0 : 1 ) ( Acros, 9 8 % ; F is h e r S c i e n t if ic, H PL C G r a d e ) p a r a t u b o s d e v i d r o r o s c a d o s. A m ist u r a f o r m u l a d a d a e t a p a a n t e r ior f o i h o m o g e n e i z a d a e m v ó r t e x d u r a n t e 3 0 s e g u n d o s, s e n d o d e s e g u id a o s t u b o s c o lo c a d o s em b a n h o - m a r ia a 8 0 º C d u r a n t e 1 h o r a. F i n d o e s t e p e r ío d o, e s t e s f o r a m d e i x a d o s a a r r e f e c e r e m g e l o. De s e g u id a, a c r e s c e n t o u - s e 2 m l d e n - h e p t a n o ( F luka, % ) e 1 m l d e á g u a d e HPLC ( F i s h e r Sc i e n t if ic, HPLC g r a d ie n t g r a d e ). Ag itous e n o v ó r t e x d u r a n t e 1 m in u t o. A s a m o s t r a s f o r a m e n t ã o c e n t r if u g a d a s a r p m d u r a n t e 1 0 m in u t o s a 4 º C, p a r a s e p a r a ç ã o d a s f a s e s a q u o s a e o r g â n i c a. A f a s e s u p e r i o r f o i r e m o v i d a c o m u ma m i c r o p ip e t a p a r a u m a c o l u n a d e s u lf a t o d e s ó d i o a n i d r o e f i l t r a d a p a r a v i a l s c o m m icro-insert ( T h e r m o U n ic a m ), p r e v iam e n t e p e s a d o s. O c o n t e ú d o l ip íd i c o e x i s t e n t e n a s a m o s t r a s f o i a n a l i s a d o e m c r o m a t ó g r a f o g a s o s o F i n n ig a n T r a c e G C U ltra c o m Autosampler A S d a m a r c a T h e r m o Electron Cor p o r a t ion. A c o l u n a c r o m a t o g r á f ica T r a c e T R - F A ME a c o p la d a a o c r o m a t ó g r a f o p o s s u i a s s e g u i n t e s d imensões: 3 0 m d e c o m p r iment o, m m d e d i â m e t r o int e r n o e μ m d e e s p e s s u r a d o f i lme d a m a r c a T h e r m o E l e c t r o n C o r p o r a t i o n ( An e x o I V). T o d o s o s e n s a i o s f o r a m r e a l i z a d o s e m t r i p l ic a d o s An á l i s e e s t a t í s t ic a O s d a d o s o b t id o s r e f e r e n t e s a o Í n d ice G o n a d o s s o m á t ico ( G I ) e a o p e s o ( e v i s c e r a d o ) d e a m b a s a s e s p é c ies e m e s t u d o f o r a m a n a l i s a d o s a t r a v é s d e u m a a n á l is e d e v a r iâ n c ia d e 2 f a t o r e s ( ANO VA) ( Z a r, ). Esta a n á lise t e v e c o m o o b j e t i vo a v e r ig u a r s e h a v e r iam d i f er e n ç a s e s t a t i s t icamente s ig n if i c a t i va s n o G I, q u a n d o c o m p a r a d o s a m b o s o s s e x o s, a s s im c o m o a s e s t a ç õ e s d o a n o ( u m a ve z q u e o n ú m e r o d e r é p licas d e m a c h o e f ê m e a p o r m e s e s d o a n o, e m a lg u n s m e s e s f o i m e n o r q u e 5 i n d i v íd u o s, o p t o u - s e p o r e f e t u a r a a n á l is e a g r u p a n d o o s d a d o s e m e s t a ç õ e s d o a n o, e v it a n d o - s e a s s im l im itações a o e s t u d o ). O m e s m o p r o c e d im e n t o f o i t id o e m c o n t a r e lat i v a m e n t e a o p e s o ( e v i s c e r a d o ) d o s e s p é c imes. T o d o s o s p r e s s u p o s t o s in e r e n t e s à A NO VA - 2 f a t o r e s f o r a m d e vi d a m e n t e v a l id a d o s e s e m p r e q u e a d e q u a d o 24

47 Materiais e Métodos r e a l i z o u - s e o t e s t e d e c o m p a r a ç õ e s m ú lt i p l a s d e B o n f e r r o n i ( Z a r, ). O s d a d o s o b t i d o s r e lat i v o s à c a p a c i d a d e a n t im icr o b ia n a e a n t itum o r a l f o r a m a n a lisados m e d ia n t e u m a A NOVA - 1 f a t o r, s e g u id a p e lo t e s t e d e Du n n e t t ( Z a r, ) ( p o r f o r m a a c o m p a r a r o s d a d o s e xp e r iment a i s c o m o s d o g ru p o c o n t r o l o ). D e ig u a l m o d o s e p r o c e d e u p a r a o s d a d o s o b t id o s p a r a a p e r c e n t a g e m d e g o r d u r a t o t a l n a s 3 e s p é c i e s e m e s t u d o t e n d o ig u a lm e n t e s i d o g a r a n t id o t o d o s o s p r e s s u p o s t o s inerent e s à r ef e r id a a n á l is e. P o r ú lt im o, r e lat i v a m e n t e a o s d a d o s o b t i d o s p a r a o p e r f i l e m á c id o s g o r d o s p a r a a s 3 e s p é c i e s e m e s t u d o, p r e t e n d e u - s e p e r c e b e r s e e x i s t ir a m d if e r e n ç a s e s t a t i s t i c a m e n t e s ignif i c a t i v a s e n t r e o s á c id o s g o r d o s s a t u r a d o s, m o n o in s a t u r a d o s e p o l in s a t u r a d o s, e p o r c o n s e g u i n t e f o i r e a l i z a d a u m a ANOVA 2 f a t o r e s. D e s a l i e n t a r q u e, m u it o e m b o r a p a r a e s t a a n á l is e o r e q u i s ito r e l a t i v o h o m o g e n e i d a d e d e v a r iâ n c ia s n ã o t e n h a s i d o g a r a n t i d o, o d e s e mp e n h o d o m é t o d o n ã o é p r o f u n d a m e n t e a f e t a d o p o r d e s v i o s m o d e r a d o s a o s s e u s p r e s s u p o s t o s. T a l j u s t if ica-se p e lo f a t o d a a m o s t r a e m a n á l is e a p r e s e n t a r u m p la n e a m e n t o e q u i l i b r a d o, p e l o q u e n ã o h a v e r á c o mp r o m e t im e n t o d o s r e s u lt a d o s ( Un d e r wo o d, ). Um a ve z m a is, e s e m p r e q u e a d e q u a d o, o t e s t e d e c o m p a r a ç õ e s m ú l t ip l a s d e B o n f e r r o n i f o i r e a lizado ( Z a r, ). F o i r e a l i z a d o o t e s t e d o Q u i q u a d r a d o ( X 2 ) r e l a t i v a m e n t e à r a zã o m a c h o / f ê m e a t o t a l o b t i d o p a r a a m b a s a s e s p é c i e s d u r a n t e a s a m o s t r a g e n s, n o s e n t i d o d e a v a l ia r a p r e s e n ç a d e d if e r e n ç a s e s t a t ist i c a m e n t e s ig n if ic a t i v a s e m r e la ç ã o à u n i d a d e. E m t o d a s a s a n á l i s e s e f e t u a d a s, o s r e s u lt a d o s f o r a m c o n s iderados e s t a t i s t icam e n t e s ig n if i c a t i v o s a o nív e l d e s ig n if ic â n c i a d e 5 % ( p < ). T o d o s o s r e s u lt a d o s f o ram o b t i d o s m e d ia n t e a u t i l i za ç ã o d o s o f t w a r e I B M SPSS St a t i s t ics

48

49 Resultados

50

51 Índice Gonadossomático (GI) Resultados 4. 1 Amostra g e m b io l ó g i c a e Í n d i c e G o n a d o s s o m á t i c o d a s d u a s e s p é c ie s e m e s t u d o D a s h o l o t ú r ia s a m o s t r a d a s d a e s p é c i e Ho l o t h u r ia f o r s k a li, 5 6 i n d i v íd u o s e r a m f ê m e a s, 3 5 e r a m m a c h o s e 4 6 n ã o c o n t i n h a m g ó n a d a p e lo q u e f o i impossível d e f i n i r o s e x o. A r a z ã o m a c h o / f ê m e a f o i d e a p r o x imadam e n t e 1 m a c h o p a r a 2 f ê m e a s (razão = ), s e n d o e s t e va l o r e s t a t ist ic a m e n t e s ig n if ic a t i vo e m r e l a ç ã o à u n i d a d e ( X 2 ( 1 ) = , p < ). R e l a t i v a m e n t e à e s p é c i e Ho l o t h u r ia m a m m a t a, d o t o t a l d e 7 3 i n d i v íd u o s a m o s t r a d o s, 2 2 e r a m m a c h o s, 2 9 e r a m f ê m e a s e 2 2 n ã o c o n t i n h a m g ó n a d a. A r a z ã o m a c h o / f êm e a f o i d e 3 m a c h o s p a r a 4 f ê m e a s ( r a z ã o = ) e n ã o f o r a m e n c o n t r a d a s d if e r e n ç a s e s t a t ist i c a m e n t e s ig n if ic a t i v a s e m r e la ç ã o à u n idade ( X 2 (1)= , p > 0. 05). O p a d r ã o d e m a t u r a ç ã o d a g ó n a d a a o l o n g o d o s m e s e s p a r a a e s p é c ie Ho l o t h u r i a f o r s k a li a p r e s e n t o u 2 v a lor e s m á x i m o s ( p i c o s ) d e m a t u r a ç ã o. O p r imeir o c o r r e s p o n d e u a o m ê s d e n o v e m b r o e o s e g u n d o a o m ê s d e f e ve r e iro, s e n d o a i n d a p o s s í v e l o b s e r v a r u m t e r c e i r o v a lor, a p e n a s p a r a a s f ê m e a s n o m ê s d e m a r ç o. C o m o é p o s s ível o b s e r v a r n a f ig u r a 3, o s i n d i v íd u o s d e H o l o t h u r i a f o r s k a li a p r e s e n t a r a m s i n c r o n ismos n o p e r íodo d e m a t u r a ç ã o d a g ó n a d a, c o r r e s p o n d e n d o a p e r c e n t a g e n s d e G I d e % ( n o v e m b r o ), % ( f e v e r e ir o ) e % ( m a r ç o ) p a r a f ê m e a s e % ( n o v e m b r o ) e % ( f e ver e iro) p a r a ma c h o s. P e lo s r e s u lt a d o s a l c a n ç a d o s, n ã o f o i p o s s ível o b s e r var d if e r e n ç a s e s t a t ist i c a m e n t e s ig n if i c a t i va s n o G I, q u a n d o c o m p a r a d o s o s g é n e r o s, e s t a ç õ e s d o a n o e os g é n e r o s e m s im u lt â n e o c o m a s e s t a ç õ e s d o a n o ( ANO VA, F géneros( 1, 85) = 0.038, F e s t a ç õ e s d o a n o ( 2, 8 5 ) = ; F géneros* e s t a ç õ e s d o a n o ( 2, 8 5 ) = , p > ) A S O N D J F M A M J J Meses Macho Fêmea Figura 3. Variação mensal do Índice Gonadossomático (GI) da espécie Holothuria forskali, com os correspondentes valores máximos de maturação. Os valores apresentados encontram-se em % média de GI por mês para cada género ± desvio padrão (SD) correspondendo às barras verticais (não sendo possível visualizar uma vez que o seu valor é muito pequeno) (n=91). 29

52 Índice Gonadossomático (GI) Resultados R e l a t i v a m e n t e à s e g u n d a e s p é c i e e m e s t u d o, H o lothur ia m a m m a t a, o p a d r ã o d e m a t u r a ç ã o d a g ó n a d a a o l o n g o d o s m e s e s a p r e s e n t o u 1 ú n ico v a l o r m á x imo d e m a t u r a ç ã o ( p ico) ( f ig u r a 4 ). E s t e v a l o r f o i e v i d e n t e n o m ê s d e a b r i l, q u a n d o f o r a m o b s e r v a d o s Í n d ic e s G o n a d o s s o m á t i c o s e l e v a d o s d e % e % p a r a f ê m e a s e m a c h o s, r e s p e t i vam e n t e. É p o s s ível v e r if ic a r a e x i s t ê n c i a d e u m p a d r ã o d e s i n c r o n i s m o n a m a t u r a ç ã o s e xu a l, o n d e e m f e v e r e iro, m a r ç o e j u n h o a s f ê m e a s e x i b iram u m G I e l e v a d o, d e m o n s t r a n d o a m a t u r a ç ã o s e x u a l, n o e n t a n t o o m e s m o f o i v e r if ic a d o p a r a o s m a c h o s m a s c o m m e n o r p e r c e n t a g e m d e G I. P e la a n á l is e r e a l i za d a c o n c l u i - s e q u e não e x ist e m d if e r e n ç a s e s t a t ist i c a m e n t e s ig n if i c a t i v a s p a r a o GI, q u a n d o c o m p a r a d o s a m b o s o s g é n e r o s, a s s im c o m o a s e s t a ç õ e s d o a n o e a c o m b i n a ç ã o e n t r e e s t a ç õ e s d o a n o e g é n e r o s ( A NO VA, F géneros( 1, 45) = , F e s t a ç õ e s d o a n o ( 2, 4 5) = ; F g é n e r o s * e s t a ç õ e s d o ano(2,4 5)= , p > ) O N D J F M A M J J Meses Macho Fêmea Figura 4. Variação mensal do Índice Gonadossomático (GI) para a espécie Holothuria mammata, com o correspondente valor máximo de maturação. Os valores apresentados encontram-se em % média de GI por mês para cada género ± desvio padrão (SD) correspondendo às barras verticais (não sendo possível visualizar uma vez que o seu valor é muito pequeno) (n=51). N a f ig u r a 5 é p o s s ível o b s e r v a r a va r i a ç ã o d e p e s o ( e v iscerado) m e n s a l d o s i n d i v íd u o s d a e s p é c i e Ho lot h u r i a f o r s k a li, a s s im c o m o o p e s o d o s e s p é c imes q u e n ã o c o n t in h a m g ó n a d a, p e lo que fo r a m c o n s i d e r a d o s in d e f e r e n c ia d o s. C o m o é p o s s ível v i s u a l i z a r n ã o s e v e r if icar a m g ra n d e s d i s c r e p â n c i a s d e p e s o e n t r e m a c h o s e f ê m e a s, à e x c e ç ã o d o m ê s d e m a io o n d e s e o b s e r v o u u m v a lo r m á x im o d e p e s o p a r a a s f ê m e a s. R e lat i v a m e n t e a o p e s o d o s i n d i v íd u o s in d if e r e n c ia d o s, é p o s s ível v e r if icar q u e o s e u p e s o m e n s a l é l ig e iram e n t e inf e r ior a o v e r if icado p a r a f ê me a s e m a c h o s, à e xc e ç ã o d o m ê s d e m a r ç o. C o n t u d o, p e l a a n á l i s e r e a l i z a d a o b t i v e r a m - se d if e r e n ç a s e s t a t ist i c a m e n t e s ig n if ic a t i v a s q u a n d o c o m p a r a d o s o s g é n e r o s e a s e s t a ç õ e s d o a n o, r e lat i v a m e n t e a o p e s o ( e v i s c e r a d o ) d o s i n d i v íd u o s ( ANO VA, F géneros( 1, 8 4 ) = 6.518, F e s t a ç õ e s d o a n o ( 2, 8 4 ) = 30

53 Peso (g) Resultados , p < 0.05). N o e n t a n t o, a c o m b i n a ç ã o e n t r e o g é n e r o d o s i n d i v íd u o s e a s e s t a ç õ e s d o a n o, n ã o d e t e t o u d if e r e n ç a s e s t a t ist i c a m e n t e s ig n if i c a t i v a s ( A NOVA, F g é n e r o s * e s t a ç õ e s d o a n o ( 2, 8 4 ) = , p > 0. 05) S O N D J F M A M J Meses Macho Fêmea Indiferenciados Figura 5. Variação mensal do peso (gramas) para machos e fêmeas e para os indivíduos indiferenciados de Holothuria forskali. Os valores apresentados encontram-se em média de peso por mês ± desvio padrão (SD) correspondendo às barras verticais (n=137). N a f ig u r a 6 o b s e r v a - se a v a r ia ç ã o d e p e s o ( e v is c e r a d o ) m e n s a l d e m a c h o s e f ê m e a s d a e s p é c ie H o lot h u r ia m a m m a t a, a s s im c o m o o p e s o d o s e s p é c im e s q u e n ã o c o n t i n h a m g ó n a d a ( in d if e r e n c i a d o s ). N ã o f o r a m v e r if ic a d a s g r a n d e s d i s c r e p â n c i a s d e p e s o e n t r e o s v a lor e s e n c o n t r a d o s p a r a m a c h o s e f ê m e a s, à e xc e ç ã o d o s m e s e s de n o v e m b r o e d e zem b r o o n d e o p e s o d o s m a c h o s f o i m e n o r q u e o p e s o d a s f ê m e a s. R e l a t i v a m e n t e a o p e s o d o s i n d i v íd u o s i n d if e r e n c ia d o s, é p o s s ív e l v e r if ic a r q u e o s e u p e s o m e n s a l a p r e s e n t a g r a n d e s o s c i la ç õ e s, c o m p a r a t i vam e n t e a o p e s o d o s m a c h o s e f ê m e a s. F o i d e t e t a d o a in d a q u e n o m ê s d e f e ver e iro e m a r ç o n ã o f o r a m e n c o n t r a d o s in d i v íd u o s s e m g ó n a d a. A a n á l is e e f e t u a d a p e r m itiu o b s e r v a r a e x ist ê n c i a d e d if e r e n ç a s e s t a t ist ic a m e n t e s ig n if icat ivas n o g é n e r o r e lat i v a m e n t e a o p e s o ( e v i s c e r a d o ) d o s in d i v íd u o s ( ANO VA, F g é n e r o (1,4 5) = 5.325, p < ). N o e n t a n t o, p a r a a s e s t a ç õ e s d o a n o, a s s im c o m o p a r a a c o m b i n a ç ã o d e e s t a ç õ e s d o a n o c o m o g é n e r o d o s i n d i víd u o s, n ã o f o r a m d e t e t a d a s d if e r e n ç a s e s t a t i s t icam e n t e s ig n if i c a t i vas ( ANO VA, F e s t a ç õ e s d o a n o ( 2, 4 5) = ; F g é n e r o * e s t a ç õ e s d o ano(2,4 5)= , p > ). 31

54 Comprimento dos Túbulos das Gónadas (mm) Peso (g) Resultados O N D J F M A M J J Meses Macho Fêmea Indiferenciados Figura 6. Variação mensal do peso (gramas) para machos e fêmeas e para os indivíduos indiferenciados de Holothuria mammata. Os valores apresentados encontram-se em média de peso por mês ± desvio padrão (SD) correspondendo às barras verticais (n=73). A v a r ia ç ã o m e n s a l d o c o m p r imento d o s t ú b u l o s d a s g ó n a d a s d a e s p é c i e H o lot h u r i a f o r s k a l i t a m b é m f o i a v a l ia d a c o m o e s t á p r e s e n t e n a f i g u r a 7. A n a l i s a n d o e s t a f ig u r a, v e r if ic o u - s e q u e o c o m p r imento d o s t ú b u l o s d o m a c h o f o i s u p e r ior r e l a t i vam e n t e a o c o m p r imento d o s t ú b u l o s d a s f ê m e a s, à e x c e ç ã o d o m ê s d e a b r i l e j u n h o, e m q u e s e o b s e r v o u o c o n t r á r io. D e r e f e r i r a i n d a q u e o m ê s d e m a i o a p r e s e n t o u u m v a l o r m á x imo n o c o m p r iment o d o s t ú b u lo s p a r a o s m a c h o s, s e n d o a v a r ia ç ã o m e n s a l d o c o m p r imento d o s t ú b u l o s d a s f ê m e a s r e l a t i v a m e n t e s e me l h a n t e S O N D J F M A M J Macho Meses Fêmea Figura 7. Variação mensal do comprimento (milímetro) dos túbulos das gónadas para machos e fêmeas da espécie Holothuria forskali. Os valores apresentados encontram-se em média de comprimento dos túbulos por mês ± desvio padrão (SD) correspondendo às barras verticais (n=91). N o q u e d i z r e s p e it o à e s p é c i e Ho l o t h u r ia m a m m a t a, a v a r ia ç ã o m e n s a l d o c o m p r imento d o s t ú b u lo s d a s g ó n a d a s p a r a m a c h o s e f ê m e a s t a m b é m f o i a n a l isada c o m o é p o s s ível v i s u a l i zar n a f ig u r a 8. N e s t a f ig u r a, v e r if ic a - se q u e o c o m p r imento d o s t ú b u l o s d a s f ê m e a s f o i s u p e r ior r e l a t i v a m e n t e a o c o m p r i m e n t o d o s 32

55 Comprimento dos Túbulos das Gónadas (mm) Resultados t ú b u l o s d o s m a c h o s, à e x c e ç ã o d o s m e s e s d e n o v e m b r o e d e z e m b r o, e m q u e o s c o m p r imentos foram pr a t icam e n t e ig u a i s O N D J F M A M J J Meses Macho Fêmea Figura 8. Variação mensal do comprimento (milímetro) dos túbulos das gónadas para machos e fêmeas da espécie Holothuria mammata. Os valores apresentados encontram-se em média de comprimento dos túbulos por mês ± desvio padrão (SD) correspondendo às barras verticais (n=51) Morfo m e t r ia d o s T ú b u l o s d a s G ó n a d a s e An á l ises Hist o ló g icas A s g ó n a d a s d e Ho l o t h u r ia f o r s k a l i e Ho l o t h u r ia m a m m a t a a p r e s e n t a m a c o n f o r m a ç ã o d e u m ú n ic o t u f o c o m n u m e r o s o s t ú b u l o s r a m if i c a d o s, d o l a d o d ireit o d o m e s e n t é r io d o r s a l, c o m o é p o s s ível v i s u a l i zar na fig u r a 9 e 1 0. Figura 9. Morfologia dos túbulos das gónadas de Holothuria forskali dissecada (fêmea), com a presença de gónada (g) e intestino (in). Figura 10. Morfologia dos túbulos das gónadas de Holothuria mammata dissecada (macho), com a presença das árvores respiratórias (ar), intestino (in) e gónada (g). 33

56 Resultados E m g e r a l, o s t ú b u lo s d e s e n v o l v e r a m - s e u n if o r m e m e n t e, p a r a a m b a s a s e s p é c ie s, s e g u n d o o s 5 e s t á g ios d e m a t u r a ç ã o d e s ig n a d o s. A p e n a s p a r a o e s t á g i o I ( i n d e t e r m in a d o ) n ã o f o r a m i d e n t if ic a d o s in d i v íd u o s. D e r e f e r ir, v i s u a l i za n d o a s d u a s e s p é c i e s e m c o n j u n t o, q u e o p e s o d a g ó n a d a d e H o lot h u r i a m a m m a t a é s u p e r ior a o p e s o d a g ó n a d a d e H o l o t h u r i a f o r s k a l i. Em r e l a ç ã o a o c o m p r imento d o s t ú b u l o s, a e s p é c ie Ho l o t h u r i a m a m m a t a a p r e s e n t o u u m c o m p r iment o d o s t ú b u l o s lig e ir a m e n t e s u p e r ior a o o b s e r v a d o p a r a a e s p é c i e H o lot h u r i a f o r s k a l i e r e l a t i vam e n t e à c o r o b s e r v a d a n a s g ó n a d a s d e a m b a s a s e s p é c i e s a d if e r e n ç a c e n t r a - s e n o s m a c h o s, c o r d e s a lmão p a r a H o lot h u r i a f o r s k a l i e b r a n c o c r e m e p a r a H o l o t h u r i a m a m m a t a. O b s e r v a n d o o t a m a n h o d o s o ó c itos ( m e d ido a t r a v é s d o s e u d iâmetro ), v e r if ica - s e q u e n ã o e x i s t e m d if e r e n ç a s s u b s t a n c ia is e n t r e a s d u a s e s p é c ie s e m e s t u d o c o n s o a n t e o s 5 e s t á g ios d e m a t u r a ç ã o p r e s e n t e s. 34

57 Tabela III. Cinco estágios de maturação da gónada, no ciclo reprodutivo de Holothuria forskali, baseado na morfologia dos túbulos da gónada Estado de maturação, sexo Peso da gónada (g) Comprimento (mm) Diâmetro (mm) Túbulos Ramificações Condição Cor I - Indeterminado Não foram encontrados indivíduos neste estágio II Crescimento Fêmea Sim Oócitos em desenvolvimento ( µm) Espermatócitos em desenvolvimento Laranja claro Macho Branco transparente III Maduro Fêmea Macho Sim Oócitos visíveis através dos túbulos ( µm) Túbulos preenchidos com espermatozoa (espermatócitos maduros) e aspeto opaco Laranja vivo Salmão IV Parcialmente desovado Fêmea Macho Sim Túbulos reduzem de tamanho. Regiões vazias do lúmen visíveis. Possível observar alguns oócitos maduros Túbulos reduzem de tamanho. Possível ver alguns espermatozoa Laranja vivo Salmão claro V Desovado Fêmea Macho Sim Túbulos de reduzido tamanho. Oócitos vestigiais presentes Túbulos de reduzido tamanho. Espermatozoa vestigial presente Laranja claro e transparente Rosa claro 35

58 Tabela IV. Cinco estágios de maturação da gónada, no ciclo reprodutivo de Holothuria mammata, baseado na morfologia dos túbulos da gónada. Estado de maturação, sexo Peso da gónada (g) Comprimento (mm) Diâmetro (mm) Túbulos Ramificações Condição Cor I - Indeterminado Não foram encontrados indivíduos neste estágio II Crescimento Fêmea Oócitos em desenvolvimento ( µm) Laranja claro Sim Macho Espermatócitos em desenvolvimento Transparente III Maduro Fêmea Macho Sim Oócitos visíveis através dos túbulos ( µm) Túbulos preenchidos com espermatozoa e aspeto opaco Laranja vivo Branco creme IV Parcialmente desovado Fêmea Macho Sim Túbulos reduzem de tamanho. Regiões vazias do lúmen visíveis. Possível observar alguns oócitos maduros Túbulos reduzem de tamanho. Possível ver alguns espermatozoa Laranja vivo Branco V Desovado Fêmea Macho Sim Túbulos de reduzido tamanho. Oócitos vestigiais presentes Túbulos de reduzido tamanho. Espermatozoa vestigial presente Laranja claro e transparente Transparente 36

59 Resultados A n a l i s o u - s e a m a t u r a ç ã o d o s t ú b u lo s d a g ó n a d a d e H o l o t h u r i a f o r s k a li e m c a d a m ê s c o m o é p o s s ível v i s u a l i z a r n a s f ig u r a s 1 1 e 1 2 p a r a f ê m e a s e m a c h o s, r e s p e t i vam e n t e e p a r a a e s p é c ie H o lot h u r i a m a m m a t a, f ig u r a s 1 3 e 1 4 ( f ê m e a s e m a c h o s r e s p e t i vam e n t e ). O b s e r v a - s e m a i s d o q u e u m e s t á g i o d e m a t u r a ç ã o d a g ó n a d a e m a lg u n s m e s e s. N o e n t a n t o, p a r a a s f ê m e a s ( f ig u r a 1 1 ) n o m ê s d e s e t e m b r o a p e n a s s e o b s e r v o u e s p é c imes c o m a g ó n a d a e m c r e s c im e n t o ( e s t á g i o I I ). Em n o v e m b r o, f e ve r e iro e m a r ç o, a s f ê m e a s c o l e c t a d a s a p r e s e n t a v a m u m a g ó n a d a m a d u r a ( e s t á g io I I I ) e p o r f im, n o m ê s d e j u n h o, s ó f or a m o b t id a s f ê m e a s c o m o s t ú b u l o s d e s o v a d o s ( e s t á g i o V). R e l a t i v a m e n t e a o s m a c h o s ( f ig u r a 1 2 ), u m a v e z m a i s n o m ê s d e s e t e m b r o a p e n a s s e o b t e ve e s p é c imes c o m a g ó n a d a e m c r e s c imen t o ( e s t á g io I I ). Em n o v e m b r o t o d o s o s i n d i v íd u o s a m o s t r a d o s a p r e s e n t a v a m u m a g ó n a d a m a d u r a ( e s t á g io I I I ) e n o s m e s e s d e a b r i l e m a io s ó f o r a m e n c o n t r a d o s t ú b u lo s d a s g ó n a d a s p a r c i a lment e v a z io s ( e s t á g io I V). 100% 80% 60% 40% 20% 0% Figura 11. Percentagem de estágios de maturação dos túbulos da gónada, consoante os diferentes meses em estudo para as fêmeas de Holothuria forskali (n=56). 100% 80% 60% 40% 20% S O N D J F M A M J Crescimento Maduro Parcialmente Desovado Desovado 0% S O N D J F M A M J Crescimento Maduro Parcialmente Vazio Vazio Figura 12. Percentagem de estágios de maturação dos túbulos da gónada, consoante os diferentes meses em estudo para os machos de Holothuria forskali (n=35). 37

60 Resultados A s s im, é p o s s ível r ef e r ir q u e, p a r a a s f ê m e a s, o b t e v e - s e u m t o t a l d e % d e i n d i v íd u o s n o e s t á g io d e c r e s c imento ( I I ), % n o e s t á g io I I I, % n o e s t á g i o I V e % n o e s t á g io V. R e l a t i v a m e n t e a o s m a c h o s, o b t e ve - s e u m t o t a l d e % d e i n d i v íd u o s n o e s t á g i o d e c r e s c imento I I, % n o e s t á g i o I I I, % n o e s t á g i o I V e 0 % n o e s t á g i o V. R e l a t i v a m e n t e à e s p é c ie H o l o t h u r ia m a m m a t a, u m a v e z m a is f o i o b s e r v a d o m a is d o q u e u m e s t á g i o d e m a t u r a ç ã o d a g ó n a d a e m a lg u n s m e s e s. Para a s f ê m e a s ( f ig u r a 1 3 ) n o m ê s d e d e z e m b r o a p e n a s s e o b s e r v o u e s p é c im e s c o m a g ó n a d a d e s o v a d a ( e s t á g io V ) e e m m a r ç o, a b r i l e j u n h o, a s f ê me a s c o l e c t a d a s a p r e s e n t a vam u m a g ó n a d a m a d u r a ( e s t á g io I I I ). R e l a t i vam e n t e a o s m a c h o s ( f ig u r a 1 4 ), n o m ê s d e n o v e m b r o, d e z e m b r o, a b r i l e m a i o a p e n a s s e o b t i v e r am e s p é c im e s c o m a g ó n a d a m a d u r a ( e s t á g io I I I ) e n o s m e s e s d e m a r ç o e j u n h o t o d o s o s i n d i v íd u o s a m o s t r a d o s a p r e s e n t a v a m u m a g ó n a d a e m c r e s c ime n t o ( e s t á g i o II). 100% 80% 60% 40% 20% 0% N D J F M A M J Crescimento Maduro Parcialmente Desovado Desovado Figura 13. Percentagem de estágios de maturação dos túbulos da gónada, consoante os diferentes meses em estudo para as fêmeas de Holothuria mammata (n=29). 100% 80% 60% 40% 20% 0% N D J F M A M J Crescimento Maduro Parcialmente Vazio Vazio Figura 14. Percentagem de estágios de maturação dos túbulos da gónada, consoante os diferentes meses em estudo para os machos de Holothuria mammata (n=22). 38

61 Resultados A s s im, é p o s s ível r ef e r ir q u e, p a r a a s f ê m e a s, o b t e v e - s e u m t o t a l d e % d e i n d i v íd u o s n o e s t á g io d e c r e s c i m e n t o (II), % n o e s t á g io I I I, % n o e s t á g io I V e % n o e s t á g io V. R e lat i v a m e n t e a o s m a c h o s, o b t e ve - s e u m t o t a l d e % d e i n d i v íd u o s n o e s t á g io d e c r e s c im e n t o, % n o e s t á g i o III, 9.09% n o e s t á g io IV e 0 % n o e s t á g i o V. R e l a t i v a m e n t e à s a n á l i s e s h i s t o l ó g icas e f e t u a d a s, n a f ig u r a 1 5, é p o s s ível o b s e r var d if e r e n t e s e t a p a s d a o o g é n e s e, o u s e j a, o d e s e n v o l v im e n t o d o s o ó c itos d a s f ê m e a s d e H o lothur ia f o r s k a li. N e s t a f ig u r a o b s e r v a - s e o s 4 e s t a d o s d e o ó g e n e s e : c r e s c imento ( A), m a d u r o ( B), p a r c ia l m e n t e d e s o va d o ( C) e d e s o v a d o ( D). Não f o i o b s e r v a d o o p r i m e i r o e s t a d o ( r e c u p e r a ç ã o ). A B C D Figura 15. Observação dos 4 estados de oogénese nas fêmeas de Holothuria forskali. A Ovário com oócitos em crescimento e presença de primeiros oócitos vitelogénicos (pov) e oócitos vitelogénicos intermédios (ovi). B Ovário com oócitos maduros, com presença de folículos (f) e vesícula germinal (vg). C - Ovário parcialmente desovado, presença de oócitos residuais (or). D - Ovário desovado, sem presença de oócitos. A: 27.1 µm, B: 113 µm; C: 76.4 µm, D: 24.8 µm. N a f ig u r a 16, p o d e m o b s e r var - s e d if e r e n t e s e t a p a s d a e s p e r m a t o g é n e s e, o u s e j a, o d e s e n v o l v i m e n t o d o s e s p e r m a t ó c itos d o s m a c h o s d e H o l o t h u r i a f o r s k a li. N e s t a f ig u r a é p o s s ível o b s e r v a r o s 4 e s t a d o s d e e s p e r m a t o g é n e s e : c r e s c imento ( A), 39

62 Resultados m a d u r o ( B), p a r c ialmente v a z i o ( C) e v a z i o ( D). N ã o f o i o b s e r v a d o o p r imeir o e s t a d o ( r e c u p e r a ç ã o ). A B C e Figura 16. Observação dos 4 estados de espermatogénese nos machos de Holothuria forskali. A Espermatócitos (esp) em crescimento tardio (acumulação de espermatozoa (e) nos túbulos. B - Presença de espermatozoa (espermatócitos (esp) evidentes). C - Testículos parcialmente vazios e presença de espermatozoa (e). D - Testículos vazios (podem conter espermatozoa não libertado (e) Escala A: 30.1 µm; B: 97.7 µm; C: 46.2 µm; D: 20.3 µm. N a f ig u r a 17, o b s e r v a - se d if e r e n t e s e t a p a s d a o o g é n e s e, o u s e j a, o d e s e n vo l v imento d o s o ó c it o s d a s f ê m e a s d e H o l o t h u r i a m a m m a t a. N e s t a f ig u r a o b s e r v a - s e o s 4 e s t a d o s d e o ó g e n e s e : c r e s c im e n t o ( A), m a d u r o ( B), p a r c i a lment e d e s o v a d o ( C) e d e s o v a d o ( D). Nã o f o i o b s e r v a d o o p r imeir o e s t a d o ( r e c u p e r a ç ã o ). 40

63 Resultados A B.vg.f C D Figura 17. Observação dos 4 estados de oogénese nas fêmeas de Holothuria mammata. A Ovário com oócitos em crescimento e presença de primeiros oócitos vitelogénicos (pov) e oócitos vitelogénicos intermédios (ovi). B Ovário com oócitos maduros, com presença de folículos (f) e vesícula germinal (vg). C - Ovário parcialmente desovado, presença de oócitos residuais (or). D - Ovário desovado, sem presença de oócitos. A: 35.1 µm, B: µm, C: 86.3 µm, D: 43.7 µm. N a f ig u r a 18, v i s u a l i z a - se o e s t a d o d e e s p e r m a t o g é n e s e, o u s e j a, o d e s e n v o lvime n t o d o s e s p e r m a t ó c itos d o s m a c h o s d e H o l o t h u r i a m a m m a t a. Nest a f ig u r a é p o s s ível o b s e r v a r o s 4 e s t a d o s d e e s p e r m a t o g é n e s e : c r e s c iment o ( A ), m a d u r o ( B), p a r c i a lment e v a z io ( C ) e v a z i o ( D). N ã o f o i o b s e r v a d o o p r imeiro e s t a d o ( r e c u p e r a ç ã o ). 41

64 Resultados A B C D e Figura 18. Observação dos 4 estados de espermatogénese nos machos de Holothuria mammata. A Espermatócitos (esp) em crescimento tardio (acumulação de espermatozoa (e) nos túbulos. B - Presença de espermatozoa (espermatócitos (esp) evidentes). C - Testículos parcialmente vazios e presença de espermatozoa (e). D - Testículos vazios (podem conter espermatozoa não libertado (e). Escala A: 18.6 µm; B: 55.4 µm; C: 32.1 µm; D: 23.8 µm Avaliação da capacid a d e A n t ioxidante Q u a n t if i c a ç ã o T o t a l de Polifenóis A q u a n t if ic a ç ã o t o t a l d e p o l if e n ó is d a s t r ê s e s p é c ie s d e h o lot ú r ia s e m e s t u d o f o i r e a lizada a t r a vé s d o m é t o d o d e F o l in C i o c a lteu, t e n d o s i d o o b t i d o o s r e s u ltados e m m i l igr a m a s d e e q u i v a l e n t e s d e á c i d o g á l i c o p o r g r a m a d e e xt r a t o ( m g E AG g - 1 de e x t r a t o ) ( f ig u r a 1 9 ). 42