AVALIAÇÃO DA RESPOSTA HEPÁTICA AO AMPc E À INSULINA EM RATOS CAQUÉTICOS PORTADORES DE TUMOR WALKER-256.

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Maria do Mar Bastos
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1 AVALIAÇÃO DA RESPOSTA HEPÁTICA AO E À INSULINA EM RATOS CAQUÉTICOS PORTADORES DE TUMOR WALKER-256. Camila Oliveira de Souza (PIBIC/CNPq-UEL), Mirian Ayumi Kurauti (PIBIC/IC-UEL), Hely de Moraes, Gláucia Borba Murad (Co-orientadora); Helenir Medri de Souza (Orientador), hmedri@uel.br. Universidade Estadual de Londrina/Centro de Ciências Biológicas/ Departamento de Ciências Fisiológicas Londrina/PR. Área: Ciências Biológicas, Sub-área: Fisiologia Palavras-chave: caquexia, glicogenólise hepática, perfusão de fígado. Resumo: A caquexia é uma síndrome metabólica caracterizada por acentuada perda de peso decorrente do predomínio do catabolismo e anorexia. Uma das alterações metabólicas observadas nesta síndrome é a resistência à insulina. O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta hepática ao e à insulina em ratos no 5º dia de desenvolvimento do tumor Walker-256. Para tanto, fígados de ratos controle alimentados, controle com alimentação reduzida (pair fed) e portadores de tumor Walker-256 foram submetidos à perfusão in situ com o tampão Krebs/Henseleit-bicarbonato contendo (3 µm), na ausência ou presença de insulina (500 µu/ml). Animais com tumor Walker-256 apresentaram menor resposta ao na produção de glicose e glicogenólise hepática, em relação aos animais pair fed e controle alimentado. Similarmente, aos animais controle alimentado e pair fed a insulina promoveu efeito inibitório sobre a produção de glicose e glicogenólise hepática estimulada pelo em ratos no 5º dia de desenvolvimento tumoral. Conclui-se que animais com tumor possuem menor resposta hepática ao e não apresentam alteração da resposta a insulina, sugerindo ausência de resistência hepática a insulina no início do desenvolvimento tumoral (5º dia). Introdução A caquexia é uma síndrome caracterizada por perda de peso decorrente do predomínio do catabolismo e da anorexia. Compostos mediadores da caquexia, liberados na circulação pelas células tumorais ou pelo tecido do hospedeiro, tais como o fator mobilizador de lipídios (LMF), o fator indutor de proteólise e as citocinas pró-inflamatória, promovem várias anormalidades metabólicas. Dentre estas se encontram a resistência à insulina, intolerância à glicose e maior produção e liberação hepática de glicose provenientes da glicogenólise e neoglicogênese (TISDALE, 2005). Alguns trabalhos apontam as citocinas como possíveis causadoras da resistência periférica à insulina no câncer (TISDALE, 2010). Contudo, não há estudos avaliando a resistência hepática à insulina em portadores de câncer, particularmente no modelo de tumor Walker-256. Diante disto, o objetivo

2 deste trabalho foi investigar o efeito da insulina sobre a produção hepática de glicose e glicogenólise estimuladas pelo em estudos de perfusão de fígado de ratos no 5º dia de desenvolvimento tumoral. Materiais e métodos Nos experimentos foram utilizados ratos machos Wistar (210 a 230 g). Para implantação do tumor foram inoculadas 8,0x10 7 células Walker-256/animal, subcutaneamente, no flanco direito traseiro. Os grupos controle alimentado (ratos sem tumor) e controle pair fed (ratos sem tumor que receberam quantidade reduzida de ração, igual a que ingerem os animais com tumor portadores de anorexia) foram inoculados com PBS no mesmo local. No 5º dia após inoculação das células tumorais (WK 5 o ) ou PBS, os animais foram submetidos à técnica de perfusão de fígado in situ. O líquido utilizado para a perfusão do fígado foi o tampão Krebs/Henseleit-bicarbonato (KH), saturado de O 2 e CO 2 (95/5%), aquecido a 37ºC e com ph 7,4. Para a perfusão do fígado os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (40 mg/kg), laparotomizados e as veias porta e cava infra-hepática foram canuladas. O líquido de perfusão foi infundido na veia porta e coletado da veia cava, em intervalos de 2 min, para determinação da produção hepática de glicose, lactato e piruvato. A perfusão do fígado foi do seguinte modo: 10 min com KH, 15 min com KH contendo o (3 µm), seguida por 25 min com KH contendo (3 µm) ou (3 µm) + Insulina (500 μu/ml). As concentrações de glicose (BERGMEYER & BERNET, 1974), L-lactato (GUTMANN & WAHLEFELD, 1974) e piruvato (CZOK & LAMPRECHT, 1974) no líquido de perfusão efluente foram quantificadas por métodos enzimáticos. A taxa de glicogenólise hepática foi calculada pela soma das concentrações de glicose + ½ da soma das concentrações de piruvato e L- lactato. Testes estatísticos adequados foram empregados para análise das diferenças entre áreas sob as curvas (AUCs). Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM), ao nível de 5% de significância. Resultados e Discussões Os valores basais de produção de glicose e glicogenólise hepáticas, antes da infusão do, observados para os animais portadores de tumor Walker-256 (WK 5º) e pair fed foram inferiores ao do controle alimentado, e semelhantes entre si (Figura 1). Em concordância, Cassola (2008) demostrou que animais pair fed e WK 5º têm igual conteúdo de glicogênio hepático e menor do que os animais alimentados. A infusão de (3 µm) aumentou a produção hepática de glicose e glicogenólise em todos os grupos. Porém, estas respostas ao foram menores nos animais pair fed e WK 5º em relação a dos animais controle alimentado (Tabela 1), provavelmente devido ao menor conteúdo de glicogênio hepático desses animais, em decorrência da diminuição da ingestão alimentar (CASSOLA, 2008; HOLROYDE & REICHARD, 1981). Adicionalmente, no grupo WK 5º a produção hepática de glicose e glicogenólise foram inferiores em relação ao grupo pair fed (Tabela 1).

3 Segundo Hirai et al (1997) o LMF produzido pelo tumor, por estimular a adenilato ciclase, pode elevar as concentrações intracelulares de e, desse modo, ativar as enzimas glicogenolíticas e a glicogenólise. Portanto, nos animais no 5º dia de tumor as enzimas glicogenolíticas estariam em sua atividade máxima, explicando a ausência de efeito aditivo do exógeno. A insulina (500 µu/ml) teve um efeito inibitório sobre a produção de glicose e glicogenólise hepática em todos os grupos (Figura 1), conforme demonstrado pelas AUCs (Tabela 1). A insulina reduz a concentração intracelular de por ativar a PD3B, enzima promove sua degradação (PILKIS & GRANNER, 1992). O efeito inibitório da insulina sobre o catabolismo do glicogênio nos animais com tumor sugere ausência de resistência hepática à insulina no início do desenvolvimento tumoral (5º dia). A + Insulina Glicogenólise (µ mol min -1 g -1 ) B + insulina 0 C + Insulina Glicogenólise (µ mol min -1 g -1 ) D + Insulina 0 E WK 5 + Insulina Figura 1 - Efeito da insulina sobre a produção de glicose (A, C E), e glicogenólise (B, D e F) estimulada por. Fígados de ratos controle, pair fed e portadores de tumor Walker-256 no 5º dia de desenvolvimento tumoral. Ratos alimentados foram submetidos à perfusão in situ como descrito em Material e Métodos. foi infundido no intervalo entre 10 e

4 24 minutos e ou + insulina 500 µu/ml foram infundidos dos 24 aos 50 minutos. Cada ponto representa a média + EPM de 7 a 11 experimentos. Tabela 1 - AUC da produção de glicose e glicogenólise hepática de ratos controle, pair fed e no 5º dia de desenvolvimento tumoral (WK 5º). Fígados foram submetidos à perfusão in situ pelo protocolo ilustrado na figura 1. No intervalo entre 10 e 24 minutos foi infundido (3 µm). De 24 à 50 minutos foi infundido (3 µm) ou (3 µm) + insulina (500 µu/ml). AUC (µmol.g -1 ) min min Glicose Glicogenólise Glicose Glicogenólise 9.32 ± ± ± ± Ins ± ± ± 0.85*** 3.60 ± 0.89*** ± ± Ins ± ± ± 0.42*** ## 0.32 ± 9*** # -6 ± ± 0.78 WK 5º +Ins ± ± 1.17 Valores representam a média + EPM de 7 a 20 experimentos. Diferenças entre as AUCs foram analisadas pelo teste t de Student não-pareado para amostras independentes, **p < 0,01 e ***p< 0,001 versus controle; # p< 0,05 e ## p < 0,01 versus pair fed; p < 0,05 e p<0,01 versus correspondente. Conclusões A resposta hepática ao foi menor em animais com tumor Walker-256, porém não houve alteração da resposta do fígado à insulina, sugerindo ausência de resistência hepática a este hormônio no início do desenvolvimento tumoral (5º dia). Referências bibliográficas BERGMEYER, H. U.; BERNET, E. Determination of glucose with glucoseoxidase and peroxidase. In: Bergmeyer H. U. (Editor), Methods of Enzymatic Analysis, Vol. 2. Academic Press, New York, , CASSOLA, P. Alterações metabólicas na caquexia induzida por tumor Walker-256 em ratos: anormalidades de parâmetros plasmáticos e hepáticos. Dissertação de mestrado UEL, Londrina, CZOK, R. & LAMPRECHT, W. Pyruvate, phosphoenolpyruvate and D glycerate-2-phosphate. In: Bergmeyer, H. U. (Editor), Methods of Enzymatic Analysis, Vol. 2. Academic Press, New York, , GUTMANN, I. & WAHLEFELD, W. L-(+)-Lactate. Determination with lactate dehydrogenase and NAD. In: Bergmeyer H. U. (Editor), Meth of Enzym Anal, Vol. 2. Academic Press, New York, , HIRAI, K.; ISHIKO, O.; TISDALE, M. Mechanism of depletion of liver glycogen in cancer cachexia. Biochem. Biop. Res. Com., 241: 49-52, HOLROYDE, C. P.; REICHARD, G. A. carbohydrate metabolism in cancer cachexia. Cancer. Treat. Rep., 65(5): 55-9, PILKIS.J.; GRANNER, D.K.; Molecular physiology of the regulation of hepatic gluconeogenesis and glycolysis. Ann Rev of Physiol, 54: , TISDALE, M.J. Molecular pathways leading to cancer cachexia. Physio, 20: , 2005.

5 TISDALE, M.J. Are tumoral factors responsible for host tissue wasting in cancer cachexia? Fut Oncol, 6(4): , 2010.

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