FRANCIELLI MARIA DE SOUZA SILVA EFEITOS METABÓLICOS DA METFORMINA NO FÍGADO PERFUNDIDO ISOLADO DE RATO

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1 FRANCIELLI MARIA DE SOUZA SILVA EFEITOS METABÓLICOS DA METFORMINA NO FÍGADO PERFUNDIDO ISOLADO DE RATO Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Maringá, área de Concentração - Biologia Celular e Molecular, da Universidade Estadual de Maringá, para obtenção do grau de Mestre Maringá Agosto -2009

2 FRANCIELLI MARIA DE SOUZA SILVA EFEITOS METABÓLICOS DA METFORMINA NO FÍGADO PERFUNDIDO ISOLADO DE RATO Prof a Dr a Nair Seiko Yamamoto Orientadora

3 Biografia Francielli Maria de Souza Silva, filha de João do Carmo Silva e Alice Alves de Souza Silva, nascida em 1 de maio de 1978 em Centenário de Sul Paraná. Graduada em Farmácia com Habilitação em Análises Clínicas pela Universidade Estadual de Maringá PR no ano de Especialista em Farmacologia pelo Centro Universitário de Maringá CESUMAR, no ano de Docente do Centro Educacional Integrado CIES, Campo Mourão PR, atuando nas disciplinas de Saúde Pública e Farmacologia.

4 RESUMO GERAL INTRODUÇÃO A biguanida, metformina tem sido usada há mais de 30 anos como um agente antihiperglicemiante no tratamento da diabetes tipo 2, mas seu mecanismo de ação sobre a homeostasia da glicose é ainda pouco entendida. As propriedades antihiperglicemiantes da metformina são atribuídas principalmente à supressão da produção de glicose, especialmente a gliconeogênese e à sensibilidade periférica aumentada à insulina. O mecanismo exato através do qual a metformina decresce a gliconeogênese hepática é ainda obscuro, mas foi sugerido que o mecanismo é dependente da concentração da metformina. A droga é associada também com a condição potencialmente letal da acidose láctica que ainda não foi esclarecida. OBJETIVOS O presente estudo foi planejado para investigar os efeitos de diferentes concentrações de metformina sobre parâmetros relacionados ao metabolismo da glicose através da medida da glicogenólise, glicólise, gliconeogênese, ureogênese, ATP, ADP e AMP no fígado perfundido isolado de rato. MÉTODOS Ratos Wistar machos, com 200 a 280 g, alimentados com ração padronizada (Nuvital - Nuvilab CR-1 ) foram utilizados. O fígado foi perfundido isoladamente no modo não-recirculante. O líquido de perfusão foi o tampão Krebs/Henseleit-bicarbonato (ph 7,4), saturado com uma mistura de O 2 e CO 2 (95:5) através de um oxigenador de membrana e simultaneamente aquecido a 37 o C. Para medir o catabolismo do glicogênio (glicogenólise e glicólise) foram utilizados fígados de ratos alimentados ad libitum. Para medir a neoglicogênese, fígados de ratos em jejum de 24 horas foram utilizados. Os seguintes compostos foram dosados através de procedimentos enzimáticos padronizados: glicose, lactato, piruvato, uréia, amônia, AMP, ADP e ATP. A concentração de oxigênio no perfusado efluente foi monitorada continuamente por polarografia, utilizando um eletrodo de platina revestido com membrana de teflon. Este eletrodo estava posicionado adequadamente em uma câmara de acrílico na saída do perfusado. Fluxos metabólicos foram calculados a partir de diferenças porto-venosas e do fluxo total pelo fígado e referidos ao peso úmido do órgão. RESULTADOS E DISCUSSÃO - Os principais resultados foram os seguintes: 1) Em fígados de ratos alimentados a metformina (0,5 mm) não afetou a liberação de glicose, lactato e piruvato e o consumo de oxigênio que provavelmente representa a variação usual dos níveis basais. 2) O consumo de oxigênio foi decrescido de níveis basais de 1,90 µmoles min -1 g -1 para 1,33 µmoles min -1 g -1, 50 minutos após o início da infusão de metformina 5,0 mm. A produção de glicose foi aumentada de níveis basais de 1,09 ± 0.01 µmoles min -1 g -1 para 2,23 ± 0,17 µmoles min -1 g -1 no final da infusão da metformina 5,0 mm que representa um aumento de 105% (p = 0,044). Esta concentração alta de metformina também aumentou a produção de lactato 2,5 vezes (p = 0,003) de valores basais de 1,25 ± 0,075 µmoles min -1 g -1 para 3,12 ± 0,034 µmoles min -1 g -1 ao final da infusão de metformina. A liberação de piruvato não foi alterada significativamente.

5 3) O consumo de oxigênio foi inibido, enquanto a glicólise e a glicogenólise foram estimuladas 212,4 % e 151% respectivamente pela metformina 5 mm. 4) A gliconeogênese a partir de lactato e piruvato em fígados de ratos jejuados foi inibida pela metformina. Concentrações maiores que 1,0 mm causaram inibição do consumo de oxigênio que foi associado aos decréscimos na produção de glicose. A inibição máxima da produção de glicose de 85% (p<0,001) foi obtida com a concentração de 5,0 mm. 5) O consumo de oxigênio previamente estimulado pela infusão de alanina foi inibida pela adição de metformina 2,5 and 5,0 mm aproximadamente 31% e 49% respectivamente. A metformina nas concentrações de 5,0 e 2,5 mm inibiram a produção de glicose a partir de alanina (2,5 mm) em 70-74% (p = 0,006 and p = 0,004). Concentrações menores de metformina (1,0 mm) não exerceram efeitos significantes. Na presença de metformina 2,5 mm, a produção de uréia a partir de alanina foi decrescida 69% no final da infusão (t = 50 min), de 0,44 ± 0,0589 µmoles min -1 g -1 para 0,14 ± 0,0128 µmoles min -1 g -1 (p = 0,029). Uma inibição similar foi produzida pela metformina 5,0 mm (p = 0,038). 6) Os níveis de AMP tenderam a ser levemente afetados pela metformina em fígados alimentados, mas sem significância estatística. A metformina causou um decréscimo de 24,0% (p<0.001) no conteúdo de ATP e um aumento de 42,6%(p = 0,014) nos níveis de ADP. 7) Os níveis de ATP e AMP foram afetados pela metformina 5,0 mm em fígados perfundidos isolados de ratos jejuados na presença de lactato 2,0 mm + piruvato 0,2 mm. Os níveis de ATP foram reduzidos 31,9% (p<0.005) 30 minutos após a infusão de lactato + piruvato. Esta redução nos níveis de ATP foi contrabalançada pelos aumentos nos níveis de AMP (57,9%, p = 0,029). Estas alterações também resultaram em um decréscimo significante na razão ATP/AMP e em pequenos decréscimos no conteúdo total de adenina nucleotídeos. A razão ATP/ADP foi também decrescida pela metformina. O efeito estimulatório da metformina sobre a glicogenólise e glicólise parece ser a conseqüência de uma fosforilação oxidativa reduzida que foi manifestada pela inibição simultânea do consumo de oxigênio. O efeito inibitório sobre a cadeia respiratória poderia afetar o metabolismo energético do fígado intacto, especialmente o nível de ATP cuja concentração foi decrescida pela metformina. É esperado que processos biossintéticos como a gliconeogênese e a ureogênese sejam também negativamente afetados pela disponibilidade diminuída de ATP, considerando-se que ambas são vias metabólicas dependentes de produção mitocondrial de ATP. A metformina poderia inibir a gliconeogênese por aumentos no fluxo piruvatoquinase, não diretamente, mas provocando decréscimos na concentração celular de ATP, um inibidor alostérico conhecido desta enzima. CONCLUSÕES - Os dados do trabalho sugerem que o efeito inibitório da metformina sobre a produção hepática de glicose é devido à redução da fosforilação oxidativa ao invés de inibição direta da glicogenólise ou gliconeogênese hepática. A redução da disponibilidade de energia celular parece ser o principal mecanismo através

6 do qual a metformina, estimula a glicólise e glicogenólise; inibe a gliconeogênese e a ureogênese; e ativa a AMPK (proteína quinase dependente de AMP). A cascata AMPK poderia ser ativada indiretamente pelo súbito declínio nas razões ATP/ADP e ATP/AMP.

7 GENERAL ABSTRACT INTRODUCTION - The biguanide, metformin has been used for more than 30 years as an antihyperglycemic agent in the treatment of type 2 diabetes, but its mechanism of action on glucose homeostasis is still poorly understood. The antihyperglicemic properties of metformin are mainly attributed to a supressed hepatic glucose production, especially hepatic gluconeogenesis and increased peripheral tissue insulin sensitivity. The exact mechanism by which metformin decreases hepatic gluconeogenesis is still unclear, but it was suggested that the mechanism is dependent on the metformin concentrations. The drug is also associated with the potentially lethal condition of lactic acidosis which remains unclear. AIMS - The present study was planned to investigate the effects of different concentrations of metformin on parameters related to hepatic glucose metabolism through the measurement of glycogenolysis, glycolysis, gluconeogenesis, ureogenesis, ATP, ADP and AMP in the isolated perfused rat liver. METHODS - Male Wistar rats, weighing 200 to 280 g, fed with a standard laboratory diet (Nuvital - Nuvilab CR-1 ) were utilized. The isolated liver was perfused in the non-recirculating system. The perfusion fluid was Krebs/Henseleit-bicarbonate buffer (ph 7.4), saturated with a mixture of O 2 and CO 2 (95:5) by means of a membrane oxygenator and simultaneously heated to 37 o C. For measuring glycogen catabolism (glycogenolysis and glycolysis) livers from ad libitum fed rats were utilized. Livers from 24-hours fasted rats were used for measuring gluconeogenesis. The following compounds were assayed by means of standard enzymatic procedures: lactate, pyruvate, urea, ammonia, AMP, ADP and ATP. The oxygen concentration in the outflowing perfusate was monitored continuously by means of polarography using a teflon coated platinum electrode. This electrode was positioned in a plexiglass chamber at the exit of the perfusate. The metabolic fluxes were calculated from the porto-venous differences and the total flow through the liver and referred to the wet weight of the organ. RESULTS AND DISCUSSION The main results were the following: 1) In livers from fed rats 0.5 mm metformin did not affect glucose release, lactate and pyruvate production and oxygen consumption which is likely to represent the usual base line shift. 2) Oxygen consumption was decreased from basal levels of 1.90 µmol min -1 g -1 to 1.33 µmol min -1 g minutes after the onset of 5.0 mm metformin infusion. Glucose production was increased from basal levels of 1.09 ± 0.01 µmol min -1 g -1 to 2.23 ± 0.17 µmol min -1 g -1 at the terminus of 5.0 mm metformin infusion which represents an increment of 105% (p = 0.044). This high concentration of metformin also increased lactate production 2.5 times (p = 0.003) from basal values of 1.25 ± µmol min -1 g - 1 to 3.12 ± µmol min -1 g -1 at the end of metformin infusion. Pyruvate release was not significantly altered. 3) Oxygen consumption was inhibited while glycolysis and glycogenolysis were stimulated 212% and 251% respectively by metformin 5 mm.

8 4) Gluconeogenesis from lactate and pyruvate in the liver from fasted rats was inhibited by metformin. Concentrations higher than 1.0 mm caused inhibition of oxygen consumption which was associated to decreases in glucose production by the livers. Maximal inhibition of glucose production (85%, p<0.001) was obtained with the concentration of 5.0 mm. 5) Oxygen consumption previously stimulated by alanine infusion was inhibited by the addition of metformin 2.5 and 5.0 mm by nearly 31% and 49% respectively. Metformin concentrations of 5.0 and 2.5 mm inhibited glucose production from alanine (2.5 mm) by 70-74% (p = and p = 0.004). Lower concentrations of metformin (1.0 mm) did not exert significant effects. In the presence of 2.5 mm metformin, urea production from alanine was decreased by 69% at the end of the perfusion (t = 50 min), from 0.44 ± µmol min -1 g -1 to 0.14 ± µmol min -1 g -1 (p = 0.029). A similar inhibition was produced by 5.0 mm metformin (p = 0.038). 6) The AMP levels tended to be slightly affected by metformin in fed livers, but without statistical significance. Metformin caused a decrease of 24.0% (p < 0.001) in the content of ATP and an increase of 42.6% (p = 0.014) in the ADP levels. 7) The ATP and AMP levels were affected by 5.0 mm metformin in perfused livers isolated from fasted rats in the presence of 2.0 mm lactate mm pyruvate. The levels of ATP were reduced 31.9% (p<0.005) after 30 min of lactate + pyruvate infusion. This reduction in the ATP levels was counterbalanced by increases in the AMP levels (57.9%, p = 0.029). These changes also resulted in a significant decrease in the ATP/AMP ratio and small decreases in the total adenine nucleotide contents. The ATP/ADP ratio was also decreased by metformin. The stimulatory effect of metformin on glycogenolysis and glycolysis seems to be the consequence of a reduced oxidative phosphorylation which was manifested by the simultaneous inhibition of oxygen consumption. The inhibitory effect on the respiratory chain could affect the whole energy metabolism of the intact liver, especially the ATP status whose concentration was decreased by metformin. It is expected that biosynthetic processes like gluconeogenesis and ureogenesis are also negatively affected by reduced ATP availability, considering that both are metabolic pathways dependent on mitochondrial ATP production. Metformin could inhibit gluconeogenesis by enhancing the pyruvate kinase flux, not directly, but causing decreases in the cellular ATP concentration, a known allosteric inhibitor of this enzyme. CONCLUSIONS The data of this work suggest that the inhibitory effect of metformin on hepatic glucose output is due to the reduction of oxidative phosphorylation rather than any direct inhibition of hepatic glycogenolysis or gluconeogenesis. The reduction of cellular energy availability appears to be the main mechanism by which metformin stimulates glycolysis and glycogenolysis, inhibits gluconeogenesis and ureogenesis and activate AMPK (AMP-activated kinase). The AMPK cascade could be indirectly activated by the subtle decline in the free ATP/ADP and ATP/AMP ratios.