EFEITOS DA MO OCROTALI A SOBRE O METABOLISMO HEPÁTICO EFFECTS OF MO OCROTALI E O LIVER METABOLISM

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1 Dracena, 9 a de setembro de 8. EFEITOS DA MO OCROTALI A SOBRE O METABOLISMO HEPÁTICO EFFECTS OF MO OCROTALI E O LIVER METABOLISM Maioli, M.A. ; Mingatto, F.E. ; Ishii-Iwamoto, E.L. Faculade de Zootecnia, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Campus de Dracena, Dracena, SP e Departamento de Bioquímica, UEM, Maringá, PR, Brazil. fmingatto@dracena.unesp.br RESUMO Monocrotalina (MCT) é um alcalóide pirrolizidínico sintetizado por plantas do gênero Crotalaria. No fígado, ao ser metabolizada pelas monooxigenases do citocromo P45 a MCT origina um pirrol altamente reativo, a dehidromonocrotalina, responsável pelos efeitos tóxicos da MCT in vivo. Nesse trabalho, avaliamos os efeitos da monocrotalina sobre o metabolismo hepático utilizando fígados isolados de ratos em perfusão. A monocrotalina (5 µm) não induziu alterações no consumo de oxigênio e no catabolismo do glicogênio em ratos alimentados normais, mas em fígados perfundidos de ratos alimentados e previamente tratados com fenobarbital, um indutor do citocromo P45, a monocrotalina estimulou a formação de glicose a partir do glicogênio endógeno (glicogenólise). Esses efeitos provavelmente estão relacionados com uma diminuição na produção de ATP mitocondrial. Os resultados mostram que a interferência no metabolismo de carboidratos pode estar envolvida na citotoxicidade apresentada pela MCT. Palavras-Chave: Monocrotalina; citotoxicidade; fígado de rato perfundido, metabolismo de carboidratos. ABSTRACT Monocrotaline (MCT) is a pyrrolizidine alkaloid synthesized by plants of Crotalaria species. In the liver, MCT is metabolized by cytochrome P45 monooxygenases to a highly reactive pyrrole, dehydromonocrotaline which is thought to be responsible for the toxicity of MCT in vivo. In this work, we evaluated the effects of monocrotaline on hepatic metabolism using isolated perfused rat liver. Monocrotaline (5 µm) did not induce alterations in the oxygen consumption or glycogen catabolism in the liver from normal fed rats, but in perfused livers of fed rats previously treated with phenobarbital, a cytochrome P45 inductor, monocrotaline stimulated glucose release from endogenous glycogen (glycogenolysis) probably as a response to diminished mitochondrial ATP production. The results show that an interference with carbohydrate metabolism may be involved in the MCT citotoxicity. Keywords: Monocrotaline; citotoxicity; perfused rat liver, carbohydrate metabolism. I TRODUÇÃO Monocrotalina (MCT) é um alcalóide pirrolizidínico sintetizado por plantas do gênero Crotalaria. Em muitos organismos afetados pela exposição à MCT foram encontradas lesões notáveis no fígado e pulmão (SCHULTZE e ROTH, 998). No fígado, a MCT é metabolizada pelas monooxigenases do

2 Dracena, 9 a de setembro de 8. citocromo P45, sendo transformada em um pirrol altamente reativo, a dehidromonocrotalina, que tem sido apontada como responsável pela toxicidade da MCT in vivo (BUTLER; MATTOCKS; BARNES, 97). Em um trabalho prévio desenvolvido em nosso laboratório utilizando mitocôndrias isoladas de fígado de rato demonstrou-se que a dehidromonocrotalina, mas não a monocrotalina, possui atividade inibidora da enzima NADH-desidrogenase, o que conseqüentemente ocasiona uma significante redução na síntese de ATP (MINGATTO et al., 7). Contudo, o exato mecanismo de ação da substância ainda não está precisamente descrito, visto que os resultados obtidos com mitocôndrias isoladas não podem ser extrapolados em sua totalidade para o fígado intacto, devido à presença de inúmeros compartimentos e membranas celulares que compõem a célula, por isso esse trabalho foi realizado com o intuito de ajudar na elucidação dos mecanismos de toxicidade da substância. Após a perfusão da MCT (5 µm) o fluxo metabólico foi medido, com ênfase nos parâmetros relacionados ao metabolismo energético. A produção dos metabólitos da monocrotalina pelos fígados perfundidos foi estimulada por um pré-tratamento com fenobarbital, que é um conhecido indutor das isoenzimas do citocromo P-45 A (VLASUK et al., 98), que sabidamente são responsáveis pelo metabolismo da MCT (REID et al., 998). MATERIAL E MÉTODOS Perfusão do fígado: A técnica cirúrgica foi a mesma descrita por Scholz e Bücher (965). O fluido de perfusão foi o tampão bicarbonato de Krebs/Henseleit (ph 7,4), saturado com uma mistura de oxigênio e dióxido de carbono (95:5). Tratamento dos ratos: Os ratos foram tratados por três dias com fenobarbital (9 mg/kg), e a perfusão foi realizada 4 horas após a última dose. Dosagens bioquímicas: Os componentes do perfusado foram dosados por meio de reações enzimáticas, sendo estes: glicose (BERGMEYER e BERNET, 974), ʟ-lactato (GUTMAN e WAHLEFELD, 974) e piruvato (CZOK e LAMPRECHT, 974). As taxas metabólicas foram calculadas considerando-se a velocidade do fluxo e foram normalizadas em relação ao peso do fígado e expressas em µmol min - (grama de fígado) -. Consumo de oxigênio: A concentração de oxigênio foi monitorada continuamente na saída do perfusado por um eletrodo de platina revestido com Teflon adequadamente posicionado na câmara do fígado na saída do perfusado. RESULTADOS E DISCUSSÃO A infusão da monocrotalina na concentração de 5 µm durante 4 min em fígados de animais sem prévio tratamento com fenobarbital não provocou alterações significativas nos parâmetros avaliados (resultados não apresentados). Por esse motivo os experimentos passaram a ser desenvolvidos com animais pré-tratados com fenobarbital, um estimulador da produção do citocromo P45, para assim obter uma maior metabolização da MCT. Os fígados dos animais tratados com fenobarbital e sem a infusão da substância (série controle), não apresentaram alterações no consumo de oxigênio e na produção de piruvato durante a perfusão (9 min), porém a produção de glicose e ʟ-lactato sofreram uma diminuição progressiva, sendo este um reflexo do baixo conteúdo de glicogênio hepático dos animais tratados com o indutor (Fig. A).

3 Dracena, 9 a de setembro de 8. Contudo, quando a substância foi infundida nos fígados dos animais tratados, como mostra a Fig. B, a produção de glicose sofreu um aumento progressivo, sendo este em torno de 7% em comparação às taxas basais. Mesmo após o término da infusão da substância, a produção de glicose permaneceu elevada por min. A monocrotalina apresentou um pequeno estímulo no consumo de oxigênio e na produção de ʟ-lactato, porém a produção de piruvato não foi alterada pela substância. A relação glicose liberada + ½ (ʟ-lactato + piruvato) (Fig. ) é uma boa forma de representação da atividade glicogenolítica sobre as condições utilizadas no experimento, já que uma pequena fração do piruvato passa pela via de transformação em glicose (KIMMIG et al., 98). Sendo assim, ao comparar a série de animais controle com a de animais onde a droga foi infundida, a razão dos catabólitos do glicogênio na série controle diminui progressivamente durante o período experimental, contudo, na série de animais onde a substância foi infundida ocorre um estímulo na liberação desses catabólitos, representando um aumento de 78%. Essa ativação na glicogenólise caracteriza a ação de agentes inibidores ou desacopladores da fosforilação oxidativa, sendo que esta substância, de acordo com Mingatto et al. (7) em trabalho desenvolvido com mitocôndrias isoladas de fígado de rato apresenta-se como um inibidor da fosforilação oxidativa. CO CLUSÃO Os resultados apresentados sugerem que a interferência no metabolismo de carboidratos pode estar envolvida nos efeitos tóxicos apresentados pela MCT no fígado, sendo os metabólitos da MCT e não o composto em si são os responsáveis pelos efeitos observados. REFERÊ CIAS BIBLIOGRÁFICAS BERGMEYER, H.U., BERNT, E., Methods of Enzymatic Analysis. Academic Press, New York, 974. Determination of glucose with glucose oxidase and peroxidise, p COPPLE, B.L., RONDELLI, C.M., MADDOX, J.F., HOGLEN, N.C., GANEY, P.E., ROTH, R.A. Modes of cell death in rat liver after monocrotaline exposure. Toxicology Science, v. 77, p. 7-8, 4. GUTMAN, J., WAHLEFELD, A.W. Methods of Enzymatic Analysis. Academic Press, New York, 974. L-(+)-Lactate determination with lactate dehydrogenase and NAD +, p KIMMIG, R., MAUCH, T.J., KERZL, W., SCHWABE, U., SCHOLZ, R. Actions of glucagon on flux rates in perfused rat liver. Kinetics of the inhibitory effect on glycolysis and the stimulatory effect on glycogenolysis. European Journal of Biochemistry, v. 6, p , 98. MINGATTO, F.E., DORTA, D.J., SANTOS, A.B., CARVALHO, I., SILVA, C.H.T.P., SILVA, V.B., UYEMURA, S.A., SANTOS, A.C., CURTI, C. Dehydromonocrotaline inhibits mitochondrial complex I. A potential mechanism accounting for hepatotoxicity of monocrotaline. Toxicon, v. 5, p. 74-7, 7. SCHOLZ, R., BÜCHER, T. Control of Energy Metabolism. Academic Press, 965, NewYork, Hemoglobin-free perfusion of rat liver, p

4 Dracena, 9 a de setembro de 8. VLASUK, G.P., GHRAYEB, J., RYAN, D.E., REIK, L., THOMAS, P.E., LEVIN, W., WALZ JR., F.G. Multiplicity strain differences and topology of phenobarbital-induced cytochromes P45 in rat liver microsomes. Biochemistry, v., p , 98. REID, M.J., LAMÉ, M.W., MORIN, D., WILSON, D.W., SEGALL, H.J. Involvement of cytochrome P45 A in the metabolism and covalent binding of 4 C-monocrotaline in rat liver microsomes. Journal of Biochemisty and Molecular Toxicology, v., p , 998. SCHULTZE, A. E.; ROTH, R. A. Chronic pulmonary hypertension-the monocrotaline model and involvement of the hemostatic system. Journal of Toxicology Environment Health B. Critic Revew, v., p.7-46, 998. BUTLER, W. H.; MATTOCKS, A. R.;BARNES, J. M. Lesions in the liver and lungs of rats given pyrrole derivatives of pyrrolizidine alkaloids. Journal of Pathology, v., p.69 75, 97. Oxigênio A Glicose Lactato Piruvato B 5 µm M CT Produção de glicose, L-lactato ou piruvato (µmol min - g - ) (µmol min - g - ) Consumo de Oxigênio Tempo de perfusão Tempo de perfusão (min) Fig. Efeitos da MCT sobre a produção de glicose, lactato, piruvato e sobre o consumo de oxigênio. Sendo que A representa os fígados dos animais controle e B o dos animais infundidos com MCT.

5 Dracena, 9 a de setembro de 8. Glicogenólise (glicose + /[lactato + piruvato produzidos]) Fígados controle Fígados infundidos com MCT P, Pe rfusion time (min ) Fig. Efeitos da MCT sobre a produção total de glicose, expressos em unidades de glicosil.