EDUARDO MACHADO HARTMANN

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1 EDUARDO MACHADO HARTMANN INVESTIGAÇÃO DA RECUPERAÇÃO DA GLICEMIA ATRAVÉS DA ADMINISTRAÇÃO ORAL DE GLICEROL, PIRUVATO E L-LACTATO DURANTE HIPOGLICEMIA INDUZIDA POR INSULINA Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Ciências Biológicas (Área de concentração - Biologia Celular e Molecular) da Universidade Estadual de Maringá, para obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas. Maringá 2008

2 EDUARDO MACHADO HARTMANN INVESTIGAÇÃO DA RECUPERAÇÃO DA GLICEMIA ATRAVÉS DA ADMINISTRAÇÃO ORAL DE GLICEROL, PIRUVATO E L-LACTATO DURANTE HIPOGLICEMIA INDUZIDA POR INSULINA Prof. Dr. Roberto Barbosa Bazotte Orientador Profª. Drª. Rosângela Fernandes Garcia - Co-orientadora

3 BIOGRAFIA Eduardo Machado Hartmann nasceu em Santa Rosa, RS, em 07 de fevereiro de Durante o período de graduação, na condição de bolsista do CNPq desenvolveu atividades de iniciação científica no grupo de pesquisa do prof. Dr. Roberto Barbosa Bazotte. Licenciado em Ciências Biológicas pelo Centro Universitário de Maringá CESUMAR (2005) deu prosseguimento a sua formação científica na condição de mestrando junto ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Maringá. Possui experiência na área de Biologia Celular e Bioquímica, atuando principalmente nos seguintes temas: Hipoglicemia Induzida por Insulina, Recuperação da Glicemia e Metabolismo Hepático.

4 Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá PR., Brasil) H333i Hartmann, Eduardo Machado Investigação da recuperação da glicemia através da administração oral de glicerol, piruvato e L-lactato durante hipoglicemia induzida por insulina / Eduardo Machado Hermann. -- Maringá : [s.n.], f. Orientador : Prof. Dr. Roberto Barbosa Bazotte. Co-orientador : Profª. Drª. Rosângela Fernandes Garcia. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Maringá, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Área de concentração - Biologia Celular e Molecular), Recuperação de glicemia. 2. Gliconeogênese. 3. Metabolismo hepático. 4. Hipoglicemia. 5. Hipoglicemia induzida por insulina. I. Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. II. Título. CDD 21.ed

5 Aos meus pais, irmão, amigos e mestres...

6 AGRADECIMENTOS À minha família, pelo apoio, compreensão e estímulo; Aos meus orientadores, Prof. Dr. Roberto B. Bazotte e Profª. Drª. Rosângela Fernandes Garcia, cuja paciência e dedicação contribuíram para a realização deste trabalho; À Universidade Estadual de Maringá, por colaborar em mais esta etapa de nossas vidas; Ao departamento de Ciências Morfofisiológicas, em especial ao laboratório de Fisiologia Humana, pelo acolhimento e apoio; À coordenação do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas; Aos amigos e colegas, pelos momentos que passamos juntos; Aos companheiros de trabalho dos laboratórios de Fisiologia Humana e Farmacologia Endócrina da Universidade Estadual de Maringá: Vilma, Helenton, Gabriela, Franciele, Elizete, Valéria, Fabiana, Kátia, e aos demais que partilham de nossa alegria; À todos que de alguma forma, auxiliaram na realização deste trabalho; Aos demais que de uma forma sutil, deixam marcas em nossas vidas...

7 APRESENTAÇÃO Esta dissertação de Mestrado foi redigida na forma de um artigo científico Investigation of glycemia recovery with oral administration of glycerol, pyruvate and L-lactate during insulin induced-hypoglycemia. Neste estudo investigou-se a recuperação da glicemia e a contribuição da neoglicogênese durante a administração de precursores de glicose nãoaminoácidos em ratos submetidos à hipoglicemia induzida por insulina (HII). Este trabalho representa a continuidade do trabalho Blood amino acids concentration during insulin-induced hypoglycemia in rats: the role of alanine and glutamine in glucose recovery, que investigou o efeito agudo da administração oral de L-alanina e L-glutamina e a contribuição destes aminoácidos para recuperação da glicemia. Em consonância com as normas estabelecidas pelo Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, o artigo foi redigido de acordo com as normas da revista Journal of diabetes and its complications. Eduardo M. Hartmann, Rosângela F. Garcia, Roberto B. Bazotte. Investigation of glycemia recovery with oral administration of glycerol, pyruvate and L- lactate during insulin induced-hypoglycemia. Journal of diabetes and its complications.

8 RESUMO GERAL INTRODUÇÃO A hipoglicemia induzida por insulina (HII) é o principal efeito adverso da insulinoterapia. Porém, considerando que durante a HII a administração de glicose (Glc) ou glucagon apresentam efeitos transitórios na recuperação da glicemia (RG), esforços têm sido dedicados à obtenção de antídotos mais eficientes. Assim, resultados promissores foram obtidos com L-alanina, lipídios, L-lactato (Lac), piruvato (Pir), terbutalina ou injeção combinada de hormônios contrarreguladores. De acordo com estes estudos, também demonstramos que a administração oral ou parenteral de L- alanina promoveu RG durante HII de curto e longo prazo. Além disso, demonstramos que a administração oral isolada ou combinada de glicerol, Lac e Pir promoveu RG durante HII de curto prazo. OBJETIVOS Portanto, visando ampliar estes estudos, o efeito agudo da administração oral isolada ou combinada de glicerol, Pir e Lac na RG durante HII de longo prazo e a participação da gliconeogênese hepática neste processo foi avaliado. MÉTODOS Utilizaram-se ratos machos Wistar ( g) em jejum de 24 h. O grupo hipoglicêmico (grupo HII) foi constituído de ratos que receberam uma injeção intraperitoneal (ip) de insulina regular (1.0 U/Kg). Os ratos que receberam injeção ip de salina constituíram o grupo normoglicêmico, ou seja, o grupo controle (grupo COG). A primeira série de experimentos caracterizou a resposta glicêmica após a injeção de insulina. A glicemia foi avaliada 0, 15, 30, 60, 120 e 180 min após a injeção ip de insulina (grupo HII) ou salina (grupo COG). Como a HII foi mantida até 180 min após a injeção de insulina, este tempo foi selecionado para avaliar os efeitos agudos dos substratos gliconeogênicos na RG e produção hepática de Glc. Além disso, neste tempo, avaliaram-se as concentrações sanguíneas de glicerol, Pir e Lac sendo os resultados obtidos utilizados como valores de concentração basal nos experimentos de perfusão de

9 fígado. Para investigar os efeitos do glicerol, Pir ou Lac (100 mg/kg cada) ou a combinação de glicerol + Pir + Lac (100 mg/kg cada) na RG, estas substâncias foram administradas via oral por gavagem. Além disso, para fins comparativos, três grupos adicionais foram incluídos: salina (veículo), Glc (100 mg/kg) e um grupo que recebeu glicerol + Pir + Lac (33,3 mg/kg cada). A administração ocorreu 15, 150 ou 165 min após a injeção de insulina e a coleta de sangue ocorreu 180 min após a injeção de insulina. Assim, realizaram-se as coletas de sangue 165, 30 ou 15 min após a administração oral dessas substâncias. Para os experimentos de perfusão de fígado, os ratos foram anestesiados e submetidos à laparotomia e os fígados perfundidos in situ. Após um período de pré-infusão, as substâncias (isoladas ou combinadas) foram dissolvidas no fluido de perfusão e infundidas durante 20 min, seguido por um período de pós-infusão. Amostras do fluido efluente de perfusão foram coletadas e as concentrações de Glc analisadas. As diferenças na produção de Glc durante e antes da infusão de cada substrato permitiram o cálculo da área sob a curva (AUC), expresso em µmol/g e da mesma maneira obteve-se a AUC para a produção de Pir ou Lac. Além disso, determinou-se a capacidade hepática máxima de produzir Glc a partir do glicerol, Pir e Lac. Para isto, utilizaram-se concentrações crescentes de glicerol, Pir ou Lac, cuja adição elevou a produção de Glc até alcançar a concentração saturante, isto é, a menor concentração na qual obteve-se a máxima produção de Glc. Sendo 2, 5 e 5 mmol/l os valores obtidos para o glicerol, Pir e Lac, respectivamente (grupo controle) e 2, 2, e 5 mmol/l, respectivamente para o grupo HII, estes valores foram utilizados nos experimentos de perfusão de fígado. RESULTADOS E DISCUSSÃO Ratos HII que receberam glicerol, Pir e Lac oral (isolados ou combinados) apresentaram maior glicemia 15 e 30 min após a administração destas substâncias, isto é, 165 e 150 min após a injeção de insulina. Além

10 disso, exceto para o grupo que recebeu a combinação dos precursores (glicerol + Pir + Lac, 100 mg/kg cada), os valores da glicemia foram similares aos do grupo HII-salina quando estas substâncias foram administradas 165 min antes da coleta de sangue, isto é, 15 min após a injeção de insulina. Os fígados de ratos submetidos à HII e seus respectivos grupos controle apresentaram elevada produção de Glc, Pir e Lac quando infundidos com níveis saturantes de glicerol, Pir e Lac isolados ou combinados. Além disso, em linhas gerais, os fígados de ratos HII e seus respectivos grupos controle mostraram uma produção similar de Glc, Pir e Lac quando infundidos com concentrações basais ou supra-fisiológicas de glicerol, Pir e Lac isolados ou combinados. Portanto, como demonstrado anteriormente na HII de curto prazo, a administração oral de glicerol, Pir e Lac (isolados ou combinados), promoveu RG. Além disso, a melhor RG obtida com glicerol + Pir + Lac (100 mg/kg cada) oral pode ser atribuída à maior disponibilidade de precursores de hepáticos de glicose. Para verificar esta possibilidade, comparou-se a produção de Glc a partir de níveis basais e supra-fisiológicos (isolados ou combinados) de glicerol, Pir ou Lac. Não somente a produção de Glc, mas também a produção de Pir e Lac foram maiores para concentrações supra-fisiológicas de substratos gliconeogênicos (Basal vs. Suprafisiológico). Além disso, os níveis de glicerol e Lac necessários para obter a máxima produção de Glc foram similares para os grupos HII e COG. Mas, para o Pir, a produção máxima de Glc no grupo HII foi obtida com 40% da concentração no grupo COG. Assim, ao contrário do glicerol e Lac, a eficiência hepática em produzir Glc a partir do Pir durante HII foi mais elevada. CONCLUSÕES A disponibilidade de glicerol, Pir e Lac no sangue não foi suficiente para fornecer precursores de glicose em quantidade suficiente para promover RG. Porém, a administração oral de glicerol, Pir e Lac durante a HII poderia auxiliar na RG

11 em função da mais elevada disponibilidade portal destes substratos gliconeogenicos. Portanto, estes resultados abrem a possibilidade para a administração oral (isolada ou combinada) de glicerol, Pir e Lac no tratamento da HII.

12 GENERAL ABSTRACT AIMS Insulin induced hypoglycemia (IIH) is the major adverse effect of insulin therapy. However, since during IIH, the administration of glucose (Glc) or glucagon shown transitory effects on glucose recovery (GR), much effort is being devoted to obtain better antidotes. Thus, encouraging results were acquired with L-alanine, lipids, L-lactate (Lac), pyruvate (Pyr), terbutaline or combined administration of counterregulatory hormones. In agreement, we also demonstrated that oral and parenteral administration of L-alanine promoted GR during short term and long-term IIH. Moreover, we demonstrated that the isolated or combined oral administration of glycerol, Pyr and Lac promoted GR during short term IIH. Thus, to expand this previous study, the acute effect of isolated or combined oral administration of glycerol, Pyr and Lac on GR during long term IIH and the participation of hepatic gluconeogenesis in this process were done. METHODS Male Wistar 24 h fasted rats ( g) were used. The hypoglycemic group (IIH group) was composed by rats, which received an intraperitoneal (ip) injection of regular insulin (1.0 U/Kg). Rats that received an ip injection of saline composed the normoglycemic group, i.e., the control group (COG group). The first set of experiments characterized the glycemic response after the injection of insulin. Glycemia was measured 0, 15, 30, 60, 120 and 180-min after ip insulin (IIH group) or saline (COG group) injection. Since hypoglycemia was maintained until 180 min after insulin injection, this time was selected to evaluate the acute effects of gluconeogenic substrates on GR and liver Glc production. Moreover, at this time the blood concentration of glycerol, Pyr and Lac were measured and the values obtained were used as basal concentrations to the liver perfusion experiments. To investigate the effect of isolated glycerol, Pyr and Lac or combined glycerol + Pyr + Lac (each 100 mg/kg) on

13 GR, these substances were orally administrated (gavage). Moreover, for comparative purpose 3 additional groups were included: saline (vehicle), Glc (100 mg/kg) and a group which received glycerol + Pyr + Lac (each 33.3 mg/kg). The administration of all these substances occurred 15 min, 150 min or 165 min after insulin injection and the blood collection occurred 180 min after insulin injection. Thus, the blood collection occurred 165, 30 or 15 min after the oral administration of these substances, respectively. For liver perfusion experiments the rats were anaesthetized and submitted to laparotomy and the livers were perfused in situ. After a pre-perfusion period, the gluconeogenic substrates (isolated or combined) were dissolved in the perfusion fluid and infused during 20 min, followed by a post-infusion period. Samples of the effluent perfusion fluid were collected and the concentrations of Glc were analyzed. The differences in the Glc production during and before the infusion of substrate allowed calculation the areas under the curves (AUC), expressed as µmol/g. Therefore, the AUC which shown the liver production Pyr and Lac were obtained from similar procedure. Furthermore, the maximal hepatic capacity to produce Glc from glycerol, Pyr and Lac was determined. For this purpose, increasing concentrations of glycerol, Pyr or Lac were used. The addition of these substances increased the Glc production until saturating concentration was reached, i.e., the lowest concentration at which the maximal Glc production was obtained. The saturating concentrations obtained to glycerol, Pyr and Lac in the COG group were 2 mmol/l, 5 mmol/l and 5 mmol/l, respectively, whereas for the IIH group, the values were 2 mmol/l, 2 mmol/l and 5 mmol/l, respectively. These values were used in the liver perfusion experiments. RESULTS AND DISCUSSION IIH rats that received oral glycerol, Pyr or Lac (isolated or combined) showed higher glycemia when administered 15 and 30 min before the blood collection, i.e, 165 and 150 min after insulin injection, respectively.

14 Furthermore, except to the group which received combined glycerol + Pyr + Lac (each 100 mg/kg), the values of glycemia were similar to saline-iih group when these substances were administered 165 min before the blood collection, i.e, 15 min after insulin injection. Livers of rats submitted to IIH and their respective COG groups shown higher production of Glc, Pyr and Lac when infused with saturating concentrations of isolated or combined glycerol, Pyr and Lac. On the other hand, in general terms, livers from IIH rats and their respective COG groups showed similar production of Glc, Pyr and Lac when infused with basal or supraphysiological concentrations of isolated or combined glycerol, Pyr and Lac. Therefore as previously demonstrated to short term IIH, isolated or combined oral glycerol, Pyr, and Lac promoted GR. Moreover, the best GR, obtained with oral glycerol + Pyr + Lac (each 100 mg/kg) could be attributed to the higher liver availability of Glc precursors. To verify this possibility, Glc production from basal and supraphysiological levels (isolated or combined) of glicerol, Pyr and Lac were compared. Not only Glc production, but also Pyr and Lac production were higher to supraphysiological levels of gluconeogenic substrates (Basal vs. Supraphysiological). Furthermore, the concentration of glycerol and Lac necessary to obtain the maximal Glc production was not different (IIH vs. COG group). But, to Pyr, the maximal Glc production from livers of IIH rats was obtained with 40% of the concentration to COG rats. Thus, in contrast with glycerol and Lac, the hepatic efficiency to produce Glc from Pyr during IIH was increased. CONCLUSIONS The blood availability of glycerol, Pyr and L-lac was not enough to furnish an amount the glucose precursor enough to help glucose recovery. However, the oral administration of glycerol, Pyr and L-lac during IIH could help GR due to the increased portal blood availability of these gluconeogenic substrates. Therefore, these data open the possibility to the oral administration of glycerol, Pyr and Lac (isolated or

15 combined) in the treatment of IIH.