HELENTON CRISTHIAN BARRENA

Transcrição

1 HELENTON CRISTHIAN BARRENA AVALIAÇÃO DA CETOGÊNESE EM PERFUSÃO DE FÍGADO DE RATOS DIABÉTICOS SUBMETIDOS À HIPOGLICEMIA DE CURTO PRAZO INDUZIDA POR INSULINA Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Área de concentração - Biologia Celular e Molecular) da Universidade Estadual de Maringá, para obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas. Maringá 2009 HELENTON CRISTHIAN BARRENA

2 AVALIAÇÃO DA CETOGÊNESE EM PERFUSÃO DE FÍGADO DE RATOS DIABÉTICOS SUBMETIDOS À HIPOGLICEMIA DE CURTO PRAZO INDUZIDA POR INSULINA Prof. Dr. Roberto Barbosa Bazotte Orientador Profª. Drª. Vilma A F Godoi Gazola - Co-orientador

3 Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá PR., Brasil) B271a Barrena, Helenton Cristhian Avaliação da cetogênese em perfusão de fígado de ratos diabéticos submetidos à hipoglicemia de curto prazo induzida por insulina / Helenton Cristhian Barrena. -- Maringá : [s.n.], f. : il. Orientador : Prof. Dr. : Roberto Barbosa Bazotte. Co-orientadora: Prof. Dr.: Vilma A. F. Godoi Gazola Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Maringá, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, área de concentração Biologia Celular e Molecular, Diabetes - Corpos cetônicos. 2. Diabetes - Cetogênese. 3. Diabetes - Hipoglicemia - Insulina. 4. Diabetes tipo 1. I. Universidade Estadual de Maringá, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, área de concentração Biologia Celular e Molecular. II. Título. CDD 21.ed

4 BIOGRAFIA Helenton Cristhian Barrena nasceu em Maringá, PR, em 03 de março de Durante o período de graduação, na condição de bolsista do CNPq desenvolveu atividades de iniciação científica no grupo de pesquisa do prof. Dr. Roberto Barbosa Bazotte. Licenciado em Ciências Biológicas pela Universidade Estadual de Maringá UEM (2006) deu prosseguimento a sua formação científica na condição de mestrando junto ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas da mesma universidade. Possui experiência na área de Biologia Celular e Bioquímica, atuando principalmente nos seguintes temas: Diabetes, Hipoglicemia Induzida por Insulina e Metabolismo Hepático.

5 À minha família, que tem sido meu alicerce nessa caminhada árdua, porém gratificante de cientista, pelo apoio, compreensão e incentivo.

6 AGRADECIMENTOS À Deus, minha fonte de amor; Ao meu orientador, Prof. Dr. Roberto B. Bazotte, que abriu as portas para que eu pudesse ingressar no mundo da pesquisa e cuja paciência e dedicação contribuíram para a realização deste trabalho; A minha co-orientadora, Profª. Drª. Vilma A F Godoi Gazola, que com muito carinho, empenho e toda paciência do mundo me ensinou praticamente tudo que sei dentro do laboratório, tornando-se uma referência pessoal e profissional para mim; Às professoras de Fisiologia Humana, Rosângela e Montserrat, do Departamento de Ciências Morfofisiológicas, pela transmissão de conhecimentos nos momentos em que a dúvida se fazia presente; Às técnicas Elizete e Valéria, do laboratório de Fisiologia Humana, que desde a iniciação científica partilham momentos de trabalho e, principalmente, alegria; Aos companheiros de trabalho dos laboratórios de Fisiologia Humana e Farmacologia Endócrina da Universidade Estadual de Maringá: Carlos Eduardo, Solidalva, Fabiana, Adriana, Ananda, Franciele, Julio, Paulo, Antônio, Sandonaid, Gabriela, Simoni, e aos demais que partilham de nossa alegria;

7 Ao grande amor da minha vida, Leriane, que nos últimos dois anos tem partilhado comigo momentos bons e ruins, sonhos e realidades; À minha mais nova paixão, Beatriz Fernanda, minha sobrinha de dois anos, que sendo tão pequena me mostra a grandeza e perfeição de Deus em suas obras; Ao Departamento de Ciências Morfofisiológicas, em especial ao laboratório de Fisiologia Humana, pelo acolhimento e apoio; Ao Departamento de Bioquímica, em especial aos professores e técnicos do laboratório de metabolismo hepático, pelo auxílio nas horas de necessidade; Aos mestres e amigos do programa de pós-graduação em Biologia Celular e Molecular; Aos amigos e amigas Jeferson, João Paulo, Henrique, Mayse, Érica, Alyne, pelos momentos que passamos juntos; Àqueles que ao passar pelas nossas vidas, sutilmente, deixam marcas em nossos corações... MUITO OBRIGADO!!!

8 APRESENTAÇÃO Esta dissertação de Mestrado foi redigida na forma de um artigo científico Ketogenesis evaluation in perfused liver of diabetic rats submitted to short term insulin-induced hypoglycaemia. Este estudo representa a continuidade dos trabalhos desenvolvidos pelo grupo de pesquisa do Laboratório de Farmacologia Endócrina que investigam os mecanismos de manutenção e recuperação da glicemia durante hipoglicemia induzida por insulina (HII) e, de certa forma, é uma extensão do trabalho Gluconeogenesis and ketogenesis in perfused liver of rats submitted to short-term insulin-induced hypoglycemia, que investigou a contribuição da administração oral de glicerol, lactato e piruvato para recuperação da glicemia, além de avaliar a capacidade cetogênica hepática durante a administração de octanoato em ratos não diabéticos submetidos a HII de curto prazo. No presente estudo investigou-se a capacidade cetogênica hepática durante a administração de octanoato (precursor de corpos cetônicos) em ratos diabéticos submetidos à HII de curto prazo. Esse trabalho tem grande importância, pois ajuda a explicar a exagerada taxa de cetogênese durante a fase de recuperação da hipoglicemia em pacientes diabéticos. Em consonância com as normas estabelecidas pelo Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, o artigo foi redigido de acordo com as normas da revista Cell Biochemistry and Function. Helenton Cristhian Barrena, Vilma Aparecida Ferreira de Godoi Gazola, Maria Montserrat Diaz Pedrosa Furlan, Rosângela Fernandes Garcia, Roberto Barbosa Bazotte. Ketogenesis evaluation in perfused liver of diabetic rats submitted to short term insulin-induced hypoglycaemia. Cell Biochemistry and Function.

9 RESUMO GERAL INTRODUÇÃO A hipoglicemia induzida por excesso de insulina administrada e a hipercetonemia resultante da severa deficiência de insulina são as principais complicações agudas de pacientes diabéticos tipo 1. Além disso, pacientes diabéticos tipo 1 mostram uma exagerada cetogênese após a hipoglicemia induzida por insulina (HII). Considerando que a cetogênese elevada é o principal fator para o desenvolvimento da cetoacidose diabética, a obtenção de informações sobre a capacidade cetogênica hepática durante a HII pode ajudar a entender a fisiopatologia da cetoacidose nestes pacientes. Dentro deste contexto, demonstramos em estudo anterior que a capacidade hepática em produzir acetoacetato e ß-hidroxibutirato a partir de octanoato durante a HII em ratos não-diabéticos foi mantida. No entanto, há uma carência em estudos mostrando o efeito da HII sobre a cetogênese hepática em ratos diabéticos. OBJETIVOS Uma vez que o diabetes induzido pela aloxana constitui modelo adequado para o estudo do diabetes tipo 1, nos propomos investigar a capacidade cetogênica hepática a partir de octanoato em ratos diabéticos submetidos à HII de curto prazo. Além disso, considerando que a administração de glicose reduz a cetogênese, decidimos avaliar, através do mesmo protocolo, o efeito da oferta oral de glicose sobre a capacidade cetogênica hepática. MATERIAIS E MÉTODOS Utilizamos nesse estudo ratos machos Wistar (Rattus norvegiccus) pesando entre g. O diabetes foi induzido por injeção intravenosa de aloxana (40 mg kg -1 dissolvida em salina). Os ratos diabéticos foram jejuados a partir das 8 h da manhã e os experimentos começaram 24 h depois. Os procedimentos experimentais seguiram as leis brasileiras de proteção de animais e foram aprovados pelo comitê de ética. A HII em ratos diabéticos (grupo HII) foi obtida por injeção intraperitoneal (i.p) de insulina regular (1.0 U kg -1 ). O grupo controle (grupo COG) recebeu o mesmo volume de salina. Um grupo adicional que recebeu glicose via oral (gavagem) (100 mg kg -1 ) 15 min após injeção de insulina (grupo HII + glicose) foi incluído nos estudos. Uma vez que a HII está bem estabelecida 15 min após injeção de insulina, este foi o tempo escolhido para a administração oral de glicose (100 mg kg -1 ) (grupo HII + glicose). Trinta minutos após injeção de insulina ou salina os ratos foram anestesiados com injeção i.p de tiopental sódico (40 mg kg -1 ). Após laparotomia, foi coletado sangue da veia cava para determinação da concentração sanguínea de acetoacetato e ß-hidroxibutirato. Os fígados de ratos diabéticos em jejum de 24 h, 30 min após receber insulina ou salina, foram

10 perfundidos in situ usando sistema de perfusão livre de hemoglobina. Amostras do líquido efluente da perfusão foram coletadas em intervalos de 5 min e a concentração de acetoacetato e ß-hidroxibutirato foram determinadas. A diferença na produção de corpos cetônicos antes e durante a infusão de octanoato permitiu calcular a área sob a curva (AUC), expressa em µmol g -1. Foi realizada a infusão de concentrações crescentes de octanoato (0.15 mm, 0.30 mm e 1.50 mm) até que o nível saturante fosse alcançado, ou seja, a menor concentração do precursor na qual a máxima produção de corpos cetônicos era obtida. A produção máxima de corpos cetônicos, alcançada com octanoato 0.30 mm, o qual reflete a capacidade hepática máxima de produzir acetoacetato + ß- hidroxibutirato a partir de níveis saturantes de octanoato, foi obtida tanto para o grupo COG quanto para o grupo HII. RESULTADOS A administração de insulina e insulina + glicose em ratos diabéticos diminuiu (p<0.05) a concentração sanguínea de glicose (COG vs. grupo HII e COG vs. grupo HII + glicose), mas a concentração de corpos cetônicos no sangue não foi alterada (COG vs. grupo HII e COG vs. HII + glicose). A cetogênese hepática basal, ou seja, antes da infusão de octanoato, mostrou diminuída (p<0.05) produção de β-hidroxibutirato e β-hidroxibutirato + acetoacetato no grupo que recebeu insulina (COG vs. grupo HII) ou insulina + glicose (COG vs. grupo HII + glicose). A razão β-hidroxibutirato:acetoacetato diminuiu (p<0.05) no grupo que recebeu insulina (COG vs. grupo HII), mas não se modificou no grupo que recebeu insulina + glicose (COG vs. Grupo HII + glicose). Por outro lado, a produção de acetoacetato apresentou-se diminuída (p<0.05) no grupo que recebeu insulina + glicose (COG vs. Grupo HII + glicose), mas sem alterações no grupo que recebeu apenas insulina (COG vs. grupo HII) (Table 3). A cetogênese hepática durante infusão de octanoato, ou seja, produção de β-hidroxibutirato e β-hidroxibutirato + acetoacetato, não difere (COG vs. grupo HII e COG vs. grupo HII + glicose). Além disso, fígados do grupo HII mostraram menor (p<0.05) produção de acetoacetato e maior (p<0.05) razão β-hidroxibutirato:acetoacetato (HII vs. grupo COG e HII vs grupo HII + glicose). DISCUSSÃO Os resultados demonstraram que apesar de a insulina inibir a cetogênese hepática basal, a concentração sanguínea de corpos cetônicos não foi influenciada pela administração da mesma. Assim, é provável que o aumento na liberação de hormônios contrarreguladores durante HII sobrepõe o efeito inibitório da insulina e/ou glicose sobre a cetogênese hepática em ratos diabéticos, como mostrado anteriormente em ratos não-diabéticos. Além disso, a cetogênese basal (antes da infusão de octanoato) a partir de ácidos graxos endógenos claramente foi menor em fígados de

11 ratos HII (HII vs. grupo COG) e essa redução foi intensificada pela administração oral de glicose. Isto ocorreu provavelmente devido ao mais intenso efeito inibitório residual da insulina do que propriamente dos hormônios contrarreguladores sobre o complexo carnitina aciltransferase o qual está envolvido no transporte de ácidos graxos de cadeia longa através da membrana mitocondrial. Além do mais, a intensificação do efeito anticetogênico da insulina após administração de glicose oral pode ser consequência do aumento transitório da glicemia, o qual promove uma redução dos níveis sanguíneos dos hormônios contrarreguladores e conseqüente redução da atividade cetogênica. Assim, para simular uma acelerada mobilização de ácidos graxos livres do tecido adiposo, como ocorre no diabetes tipo 1 não tratado com insulina, fígados isolados foram infundidos com uma concentração saturante de octanoato. A infusão de octanoato provocou um aumento acentuado na produção de ß-hidroxibutirato como conseqüência da maior disponibilidade de equivalentes redutores mitocondriais, demonstrado pelo aumento da razão ß-hidroxibutirato:acetoacetato. No entanto, estes resultados não podem ser atribuídos à reação da carnitina aciltransferase, uma vez que o octanoato entra na mitocôndria por um mecanismo independente da carnitina. Em suma, a capacidade cetogênica a partir do octanoato em fígados de ratos diabéticos não foi afetada pela administração de insulina (grupo HII) ou insulina mais glicose (grupo HII + glicose) em comparação ao grupo COG. CONCLUSÕES Os resultados obtidos sugerem que apesar de a insulina inibir a cetogênese, fígado de ratos submetidos a HII de curto prazo apresentam mantida capacidade de produzir acetoacetato e ß- hidroxibutirato a partir do octanoato. Além disso, nossos dados são de grande interesse uma vez que ajudam a explicar a exagerada taxa de cetogênese durante a fase de recuperação da hipoglicemia em pacientes diabéticos e sugerem um controle mais rígido dos níveis sanguíneos de ácidos graxos livres e de corpos cetônicos durante o tratamento da HII.

12 GENERAL ABSTRACT INTRODUCTION Hypoglycaemia induced by excess of administered insulin and hyperketonemia developed as consequence of severe insulin deficiency are the main acute complication in type 1 diabetic patients. Moreover, type 1 diabetic patients shown an exaggerated ketogenesis after insulin induced hypoglycemia (IIH). Considering that elevated ketogenesis is the main factor for the development of diabetic ketoacidosis, information about the hepatic ketogenic capacity during IIH could help to understand the pathophysiology of ketoacidosis in type 1 diabetic patients. In this context, we previously demonstrated that during short term IIH the ability to produce acetoacetate and ß-hydroxybutyrate from octanoate in livers of non diabetic rats was maintained. However, studies showing the effect of short term IIH on liver ketogenesis in diabetic rats are lacking. AIM - Since alloxan-diabetic rats is a suitable animal model of type 1 diabetes we investigated the hepatic capacity to produce ketone bodies from octanoate in livers from diabetic rats submitted to short term IIH. Moreover, considering that glucose administration reduces ketogenesis we also evaluated the effect of oral glucose on the liver capacity to produce ketone bodies in alloxan-diabetic rats submitted to short term IIH. MATERIAL AND METHODS - Male Wistar rats (Rattus norvegiccus), weighing g were used in this study. Diabetes was induced by intravenous alloxan (40 mg kg -1 dissolved in saline). The diabetic rats were food deprived from 8:00 a.m. and the IIH protocol started 24 h later. The experimental procedures followed the brazilian laws on the protection of animals and were approved by the Ethics Committee. IIH in diabetic rats (IIH group) was obtained with an intraperitoneal (i.p) injection of regular insulin (1.0 U kg -1 ). Diabetic control group (COG group) received an equal volume of saline. An additional group which received oral glucose (gavage) (100 mg kg -1 ) 15 min after insulin administration (IIH + glucose group) was included. Since IIH was well-established 15 min after insulin injection this time was selected for the oral administration of glucose (100 mg kg -1 ) (IIH + glucose group). Thirty min after the administration of insulin or saline the rats were anesthetized with i.p sodium thiopental (40 mg kg -1 ). After laparotomy, blood was collected from the cava vein for the determination of the blood concentration of acetoacetate and ß-hydroxybutyrate. Livers from 24 h fasted diabetic rats, 30 min after receiving insulin or saline, were perfused in situ using haemoglobin-free liver perfusion. Samples of the effluent perfusion fluid were collected at 5 min intervals and the concentration of acetoacetate and ß-

13 hydroxybutyrate were determined. The differences in the concentration of ketone bodies production during and before the infusion of octanoate allowed to calculate the area under the curves (AUC), expressed as µmol g -1. Liver infusion of octanoate up to a saturating concentration (0.15 mm, 0.30 mm and 1.50 mm) were done. The addition of increasing concentrations of octanoate augmented the rate of ketone bodies production until a saturating level was reached, i.e., the lowest concentration at which the maximal ketone bodies production was obtained. The maximal ketone bodies production, i.e., 0.30 mm, which reflects the liver capacity to produce acetoacetate + ß-hydroxybutyrate from a saturating level of octanoate were obtained not only to COG but also to IIH group. RESULTS - Insulin and insulin plus glucose administration in diabetic rats decreased (p<0.05) the blood concentration of glucose (COG vs. IIH group and COG vs. IIH + glucose group), but those of ketone bodies remained unchanged (COG vs. IIH group and COG vs. IIH + glucose group). Liver ketogenesis before octanoate infusion (basal values) shown decreased (p<0.05) β-hydroxybutyrate production and β- hydroxybutyrate + acetoacetate production in the group which received insulin (COG vs. IIH group) or insulin + glucose (COG vs. IIH + glucose group). The β- hydroxybutyrate:acetoacetate ratio was decreased (p<0.05) in the group which received insulin (COG vs. IIH group) but unchanged in the group which received insulin + glucose (COG vs. IIH + glucose group). On the other hand, the acetoacetate production was decreased (p<0.05) in the group which received insulin + glucose (COG vs. IIH + glucose group) but unchanged in the group which received insulin (COG vs. IIH group) (Table 3). Liver ketogenesis during octanoate infusion, i.e., β-hydroxybutyrate production, β-hydroxybutyrate + acetoacetato, was not different (COG vs. IIH group and COG vs. IIH + glucose group). Moreover, livers from IIH group showed lower (p<0.05) acetoacetate production and higher (p<0.05) β-hydroxybutyrate:acetoacetate ratio (IIH vs. COG group and IIH vs IIH + glucose group). DISCUSSION - Our results demonstrated that in spite the fact that insulin inhibits liver ketogenesis, the blood levels of ketone bodies were not influenced by the administration of insulin. Thus, it seems, that the increased release of counterregulatory hormones during IIH overcome the inhibitory effect of insulin and/or glucose on liver ketogenesis also in diabetic rats, as previously demonstrated to non diabetic rats. The basal ketogenesis (i.e., before octanoate infusion) from endogenous fatty acids was clearly decreased in livers of IIH rats (COG vs. IIH group) and this change was intensified by oral glucose administration (COG vs. IIH + glucose group). This was probably due to the more intense residual

14 inhibitory effect of insulin than counteregulatory hormones on carnitine acyltransferase complex wich is envolved in the transport of long-chain fatty acids across the mitochondrial membrane. Moreover, the intensification of the antiketogenic effect of insulin after oral glucose administration could be the consequence of the transitory increase of glycemia which promotes a decreasing in the blood levels of counterregulatory hormones and their ketogenic activities. In addition, to simulate an accelerated mobilization of free fatty acid from adipose tissue, as occurs in type 1 diabetes not treated with insulin, isolated livers were infused with a constant and saturating concentration of octanoate. The infusion of octanoate caused a sharp increase in ß-hydroxybutyrate production as consequence of the higher availability of mitochondrial reducing equivalent, demonstrated by the increased ß- hydroxybutyrate:acetoacetate ratio. However, these results could not be attributed to the carnitine acyltransferase reaction, since octanoate enters in the mitochondria by a carnitine independent mechanism. In summary, the ketogenic capacity from octanoate in livers from diabetic rats was not affected by insulin (IIH group) or insulin plus glucose administration (IIH + glucose group) in comparison with COG group. CONCLUSION - Taken together, the results suggest that in spite the fact that insulin inhibits ketogenesis, livers from rats submitted to short term IIH showed maintained capacity to produce acetoacetate and ß-hydroxybutyrate from octanoate. Also, our data is the of great interest because they help to explain the exaggerated rates of ketogenesis during the recovery phase of hypoglycemia in diabetic patients and suggest a more rigid control of FFA and ketone bodies blood levels during the treatment of IIH.