FOTOESTABILIDADE DE EMULSÕES DE β-caroteno LIOFILIZADAS: ESTUDO DO EFEITO DO TIPO DE CONGELAMENTO ANTES DA LIOFILIZAÇÃO
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- Maria do Pilar Antunes Teixeira
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1 FOTOESTABILIDADE DE EMULSÕES DE β-caroteno LIOFILIZADAS: ESTUDO DO EFEITO DO TIPO DE CONGELAMENTO ANTES DA LIOFILIZAÇÃO A.C. P. Souza 1, B. O. Bittencourt 1, N. P. Rodrigues 1, P. D. Gurak 2, L. D. F. Marczak 1 1-Departamento de Engenharia Química Universidade Federal do Rio Grande do Sul CEP: Porto Alegre RS Brasil. Telefone: 55 (51) Fax: 55 (51) (ana.cardinale@hotmail.com) 2- Departamento de Nutrição - Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre CEP: Porto Alegre RS Brasil, RESUMO O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do método de congelamento (lento e rápido) na estabilidade das emulsões de β-caroteno antes da liofilização preparadas com três métodos de emulsificação (agitação magnética, ultrassom e ultra-turrax). Durante os testes de fotoestabilidade, as emulsões de β-caroteno liofilizadas foram avaliadas em relação ao teor total de β-caroteno e aos parâmetros de cor. A degradação deste composto exibiu uma cinética de primeira ordem após 15 dias de exposição à luz UV. O método de congelamento rápido antes da liofilização aumentou o tempo de meia-vida das emulsões liofilizadas entre 55 % e 154 % (dependendo da forma de emulsificação) quando comparado com o método de congelamento lento. O fenômeno de coalescência parcial foi observado apenas nas emulsões de β-caroteno liofilizadas submetidas ao método de congelação lenta. ABSTRACT The aim of the present study was to evaluate the freezing method (slow and fast) effect on the stability of β-carotene emulsions before freeze-drying prepared with different emulsification methods (magnetic stirring, ultrasound and ultra-turrax). During photostability tests, the β-carotene content and color parameters of the dehydrated β-carotene emulsions were evaluated. The degradation of this compound exhibited a first-order kinetics after 15 days under UV light exposition. The fast freezing method before freeze-drying increased the half-lives of the dehydrated emulsions between 55% and 154% (depending on the emulsification methods) when compared with the slow freezing method. The partial coalescence phenomenon was observed only in the dehydrated β-carotene emulsions submitted to slow freezing method. PALAVRAS-CHAVE: carotenoides; proteína isolada de soja; estabilidade físico-química; coalescência parcial. KEYWORDS: carotenoids; soy protein isolate; physical-chemical stability; partial coalescence. 1. INTRODUÇÃO O β-caroteno é um importante carotenoide presente em frutas e vegetais incluindo cenoura, abóbora, manga e mamão. É um corante natural promissor devido aos potenciais benefícios para a saúde, pois é precursor da vitamina A e apresenta capacidade antioxidante (Boon et al., 2010). Diversos estudos evidenciam que o consumo de alimentos ricos em β-caroteno pode ser benéfico para a saúde humana diminuindo o risco de câncer, doenças cardiovasculares, risco de diabetes tipo 2, síndrome metabólica em adultos de meia-idade e catarata (Liu et al., 2014; Hou et al., 2014; Sluijs et al., 2015). A partir das suas propriedades, o β-caroteno possui importantes aplicações comerciais como corante natural e antioxidante. No entanto, a sua manipulação industrial é limitada em virtude do alto
2 grau de insaturação de suas moléculas, pois se tornam instáveis na presença de calor, luz, oxigênio e metais de transição. A baixa solubilidade em água é outro fator que limita a utilização do β-caroteno em alimentos e bebidas à base de água (Boon et al., 2010). Uma alternativa para melhorar a estabilidade e a solubilidade do β-caroteno em produtos alimentares é incorporá-lo em emulsões. Assim, o β-caroteno é dissolvido em óleo (fase oleosa) e em seguida disperso em água contendo um emulsificante (fase aquosa) na forma de pequenas gotas de óleo usando processos de homogeneização (McClements, 2010). Dentre os diferentes tipos de emulsificantes, destaca-se o uso da proteína isolada de soja na indústria de alimentos para estabilizar emulsões óleo em água (O/A) devido às propriedades de superfície ativa das frações globulínicas da β- conglicinina (7S) e da glicina (11S). As propriedades funcionais da proteína isolada de soja podem ser modificadas quando estas são submetidas a tratamentos químicos, térmicos ou enzimáticos. O tratamento térmico, por exemplo, tem influência sobre a estabilidade de emulsões em relação à cremeação, coalescência e floculação em condições de repouso e também sob uma tensão de cisalhamento (Palazolo et al., 2011). Nesse contexto, o objetivo do trabalho foi avaliar a fotoestabilidade de emulsões de β-caroteno submetidas a diferentes métodos de homogeneização e expostas a dois métodos de congelamento antes da liofilização. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.2 Preparação das emulsões de β-caroteno As emulsões de β-caroteno foram preparadas de acordo com a metodologia descrita por Silva et al. (2015) com algumas modificações. A primeira etapa consistiu no preparo das fases aquosa e oleosa. A fase aquosa da emulsão foi preparada a partir da solubilização da proteína isolada de soja (PIS) em água destilada na concentração de 15 % com agitação magnética (Fisatom, São Paulo - Brasil) por 30 min a 35 C. Posteriormente, as soluções de PIS foram armazenadas por 24 h na geladeira visando à sua completa hidratação. Em paralelo, a fase oleosa da emulsão foi preparada a partir da solubilização completa de 0,1000 g do padrão de all-trans-β-caroteno (pureza de aproximadamente 93%, Sigma Aldrich) em óleo de soja comercial (300 ml) sob agitação magnética por 2 h a 30 C. Na etapa de pré-emulsão, a fase oleosa foi adicionada à fase aquosa na proporção 1:9 (v/v) e pré-emulsionadas com agitador mecânico por 5 min a 2000 rpm. A última etapa no preparo da emulsão de β-caroteno consistiu na homogeneização com três diferentes técnicas: agitação magnética (AM), ultrassom (US) e ultra-turrax (UT). Homogeneização com ultrassom: a pré-emulsão foi adicionada numa célula de vidro encamisada de 200 ml e colocada sobre um agitador magnético. A sonda foi submersa a 4 cm abaixo da pré-emulsão e a célula foi conectada a um banho termostático de modo que a temperatura foi mantida inferior a 35 ºC durante o experimento. As pré-emulsões foram homogeneizadas com ultrassom equipado com uma sonda de 12 mm de diâmetro e potência de 750 W (Sonics Vibracell modelo VC750, Newtown, USA) por 10 min com intensidade de 531 W.cm -2. Homogeneização com ultra-turrax: a pré-emulsão foi adicionada dentro de uma célula de vidro encamisada de 200 ml, conectada a um banho termostático e homogeneizada com ultra-turrax (T25 Ultra Turrax, Ika, Wilmington, USA) por 10 min na velocidade de agitação de rpm. Homogeneização com agitação magnética: a pré-emulsão foi adicionada dentro de uma célula de vidro encamisada de 200 ml, conectada a um banho termostático e homogeneizada com agitador magnético (Fisatom, São Paulo - Brasil) nas mesmas condições de temperatura e tempo. 2.3 Obtenção das emulsões de β-caroteno liofilizadas As emulsões de β-caroteno foram submetidas a dois métodos de congelamento diferentes antes da liofilização. No primeiro método, as amostras foram congeladas diretamente em ultrafreezer
3 (Coldlab, modelo CL , Brasil) a - 40 C por 24 h. No segundo método, as amostras foram précongeladas com nitrogênio líquido (-196 ºC) e posteriormente condicionadas em ultrafreezer a -40 C durante 24 h. Após o congelamento, as emulsões de β-caroteno foram liofilizadas (Terroni Equipamentos, modelo LS 6000, Brasil) por 96 h (-54 C, mmhg), reduzidas a pó utilizando almofariz e pistilo, condicionadas em sacos plásticos de polietileno e armazenadas em dessecador na temperatura ambiente protegidos da luz. 2.4 Fotoestabilidade das emulsões de β-caroteno liofilizadas A estabilidade frente à presença de luz foi conduzida conforme Kechinski (2011) com modificações. As emulsões liofilizadas foram armazenadas em placas Petri de polietileno transparentes e expostas a quatro lâmpadas UV de 40 W com intensidade de radiação 0,286 W.m -2, dispostas paralelamente e suspensas a 42 cm das amostras. As placas contendo as amostras também foram colocadas em ambiente com ausência de luz como controle. O teste de estabilidade se estendeu por um período de 15 dias à temperatura média de 25 ± 2 C. As amostras foram quantificadas nos tempos 0, 1, 2, 4, 7, 10, 12 e 15 dias em relação ao teor de β-caroteno total e à cor. A modelagem matemática dos perfis de degradação do β-caroteno foi realizada utilizando uma reação de primeira ordem e o tempo de meia vida foram calculados de acordo com a Equação 1 e 2, respectivamente: ln (C/C 0 ) = k x t (1) t 1/2 = ln (2)/k (2) Determinação do teor de β-caroteno total: Inicialmente foi realizada a extração exaustiva do β- caroteno das emulsões em pó para a posterior quantificação. Cerca de 0,15 g de pó foram suspensos em 3 ml de solução de éter de petróleo e éter etílico (2:1, v/v) e agitados com vórtex (Phoenix Luferco, modelo AP 56, Brasil) por 3 min em temperatura ambiente. O sobrenadante foi coletado e o precipitado foi submetido novamente a extração por três vezes, momento em que o sobrenadante ficava incolor. Os sobrenadantes foram homogeneizados e o solvente foi completamente removido em evaporador rotativo a vácuo (Fisatom, modelo 803, São Paulo - Brasil) na temperatura de 30 C. Em seguida, as amostras foram ressuspendidas com éter de petróleo em balão volumétrico de 5 ml. A quantificação do teor de β-caroteno total foi realizada em espectrofotômetro UV/VIS (PG Instruments T80) a 450 nm e os resultados foram apresentados na forma de μg de β-caroteno por g de emulsão liofilizada (μg. g -1 ) em base seca, conforme a Equação 3: Teor de carotenoides totais (μg/g) = [A x 10 4 x FD x V ]/A 1% x m (3) onde A representa a absorbância (unidades de absorbância), 1% A representa o coeficiente de absortividade molar (2592), FD representa o fator de diluição, V representa o volume de ressuspensão (ml) da amostra em análise e m representa a massa (g) da amostra em análise (emulsão liofilizada). Análise colorimétrica: A cor das emulsões de β-caroteno liofilizadas foi medida em espectrocolorímetro Color Quest XE (Hunter Lab, EUA) equipado com iluminante D65 e ângulo de observação de 10. Os parâmetros colorimétricos L *, a * e b * da escala CIELAB foram determinados a partir das leituras diretas das amostras no modo reflectância com especular excluída. Os valores de croma (C ab * ), ângulo de tonalidade (h ab ) e diferença total de cor (ΔE * ab) foram calculados de acordo com Equações 4, 5 e 6, respectivamente. C * ab = [(a * ) 2 + (b * ) 2 ] 1/2 (4) h ab = tg -1 (a * /b * ) (5) E * ab = [(Δa * ) 2 + (Δb * ) 2 + (ΔL * ) 2 ] 1/2 (6)
4 2.5 Análise estatística A preparação das emulsões de β-caroteno foi realizada em duplicata enquanto que as análises foram realizadas em triplicata. Os resultados foram avaliados estatisticamente através de uma análise de variância (ANOVA) utilizando o software Statistica 10. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey e os resultados foram expressos como a média ± desvio padrão (DP). Um valor de p<0,05 foi considerado significativo. 3. RESULTADOS E DISCUSSÕES A Figura 1 apresenta a degradação do β-caroteno presente nas emulsões liofilizadas durante 15 dias de exposição à luz UV e preparadas com diferentes métodos de homogeneização (agitação magnética, ultrassom e ultra-turrax). As emulsões liofilizadas apresentaram comportamentos diferentes em relação à fotodegradação do β-caroteno quando submetidas aos dois tipos de congelamento (rápido e lento). Na Figura 1-a, verifica-se que após sete dias de exposição à luz UV, as concentrações de β-caroteno das amostras submetidas ao congelamento lento reduziram em 45 % (AM 15 CL), 51 % (US 15 CL) e 68 % (UT 15 CL) quando comparados com os valores iniciais e, após 10 dias, nas emulsões liofilizadas homogeneizadas com ultra-turrax (UT 15) o β-caroteno foi totalmente degradado. Por outro lado, as amostras submetidas ao congelamento rápido as concentrações de β- caroteno reduziram em 16 % (US 15 CR), 18 % (MS 15 CR) e 26 % (UT 15 CR) considerando o mesmo período (Figura 1-b). Assim, observa-se que a fotodegradação do β-caroteno nessas emulsões foi menor, e após 15 dias de armazenamento, as concentrações de β-caroteno foram de 20 ± 6 μg.g -1 (US 15 CR), 32 ± 4 μg.g -1 (UT 15 CR) e 44 ± 3 μg.g -1 (AM 15 CR). Figura 1 Degradação do β-caroteno em emulsões liofilizadas submetidas a dois métodos de congelamento: (a) lento (CL) e (b) rápido (CR) antes da liofilização quando expostas à luz UV durante 15 dias. A Tabela 1 apresenta os parâmetros cinéticos de degradação do β-caroteno e parâmetros de cor de emulsões de β-caroteno liofilizadas expostas à luz UV no tempo inicial e no tempo de 15 dias. Os parâmetros cinéticos de degradação do β-caroteno das emulsões liofilizadas foram calculados através do ajuste dos dados experimentais para um modelo cinético de primeira ordem. Para as emulsões liofilizadas submetidas ao congelamento lento, os valores da constante cinética de degradação do β-caroteno (k) variaram entre 0,097 ± 0,003 a 0,130 ± 0,002 dias-1 e o tempo de meiavida (t 1/2 ) variou de 5,35 a 7,17 dias. As amostras submetidas ao congelamento rápido, por sua vez, apresentaram valores da constante cinética de degradação do β-caroteno (k) na faixa de 0,038 ± 0,002 a 0,083 ± 0,010 dias -1 e tempo de meia-vida (t 1/2 ) de 8,34 a 18,24 dias. A análise estatística dos resultados mostrou que a emulsão US 15 CL submetida ao congelamento lento é estatisticamente diferente da emulsão US 15 CR submetida ao congelamento rápido (p<0,05). Observa-se o mesmo comportamento nas emulsões homogeneizadas com ultra-turrax (UT 15 CL e UT 15 CR) e agitação magnética (AM 15 CL e AM 15 CR). Com o congelamento rápido das emulsões antes da liofilização,
5 as velocidades de degradação do β-caroteno diminuíram em aproximadamente 36 % (US 15 CL), 55 % (UT 15 CR) e 61 % (AM 15 CR) quando comparados aos valores obtidos com o congelamento lento. Em relação ao tempo de meia-vida, houve um aumento de 55 % (US 15 CR), 123 % (UT 15 CR) e 154 % (AM 15 CR) (Tabela 1). Tabela 1 - Parâmetros cinéticos de degradação do β-caroteno e parâmetros de cor de emulsões de β- caroteno liofilizadas expostas à luz UV no tempo inicial e no tempo de 15 dias. Parâmetros Tempo (dias) Amostras US 15 CL UT 15 CL AM 15 CL US 15 CR UT 15 CR AM 15 CR k (dias -1 0,130 ± 0,121 ± 0,097 ± 0,083 ± 0,054 ± 0,038 ± ) 0,002 a 0,010 a 0,003 b 0,010 b 0,010 c 0,002 d t 1\2 (dias) 5,35 5,75 7,17 8,34 12,84 18,24 R 2 0,991 0,946 0,975 0,879 0,844 0,910 L t 0 70,6 ± 0,5 A 64 ± 2 C,D 59 ± 2 D 70 ± 4 A,B 69 ± 3 A,B 65 ± 1 B,C t 15 72,6 ± 0,3 A 67,4 ± 0,5 B 57 ± 1 C 71 ± 4 A,B 71 ± 4 A,B 68 ± 1 B a* t 0 11 ± 1 B,C 12,3 ± 0,5 A,B 13,2 ± 0,6 A 8 ± 1 D 10 ± 1 C 11,2 ± 0,4 B,C t 15 4,1 ± 0,1 D 3,8 ± 0,3 D 12 ± 1 A 4,7 ± 0,1 C,D 6 ± 2 B,C 7,6 ± 0,3 B b* t 0 47,8 ± 0,7 B,C 51 ± 2 A,B,C 48 ± 3 B,C 46 ± 4 C 52 ± 4 A,B 54 ± 2 A t ± 1 C 26 ± 1 C 41 ± 2 A,B 31 ± 1 C 36 ± 6 B 42 ± 1 A C ab * t 0 50 ± 2 A,B,C 50 ± 2 A,B,C 50 ± 3 B.C 47 ± 4 C 53 ± 4 A,B 55 ± 2 A t ± 1 C 26 ± 1 C 43 ± 2 A 31 ± 1 C 37 ± 6 B 42 ± 1 A h ab t 0 76 ± 1 C 75,7 ± 0,2 C,D 75 ± 1 D 80 ± 1 A 79,0 ± 0.4 A,B 78,3 ± 0,1 B t 15 81,5 ± 0,3 A 82 ± 1 A 74 ± 1 C 81,4± 0,2 A 81 ± 1 A,B 79,7 ± 0,2 B ΔE ab * 33 ± 1 A 33,0 ± 0,4 A 16 ± 2 B 16 ± 5 B 17 ± 4 B 13 ± 2 B * Média de três repetições ± desvio padrão. a,b,c; A,B,C Letras iguais na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (p > 0,05). US 15 CL: ultrassom, 15 % de proteína isolada de soja e submetida ao congelamento lento; UT 15 CL: ultra-turrax, 15 % de proteína isolada de soja e submetida ao congelamento lento; AM 15 CL: agitação magnética, 15 % de proteína isolada de soja e submetida ao congelamento lento; US 15 CR: ultrassom, 15 % de proteína isolada de soja submetida ao congelamento rápido; UT 15 CR: ultra-turrax e 15 % de proteína isolada de soja submetida ao congelamento rápido e AM 15 CR: agitação magnética e 15 % de proteína isolada de soja submetida ao congelamento rápido. Esse comportamento pode estar associado ao fenômeno de coalescência parcial das gotas de óleo durante a etapa de congelamento realizada antes do processo de liofilização. À medida que uma emulsão é congelada, diversos processos físico-químicos podem ocorrer incluindo a cristalização da fase oleosa, a formação de gelo, a concentração das fases, transições na interface óleo-água e mudanças conformacionais do emulsificante. Assim, quando uma emulsão é congelada a uma temperatura que permite a cristalização parcial da fase oleosa e a fase aquosa ainda permanece no estado líquido, a emulsão fica susceptível à coalescência parcial. Esse fenômeno ocorre quando um cristal de óleo oriundo de uma gota parcialmente cristalizada penetra a região líquida de outra gota, de modo que são formados agregados irregulares e a estabilidade da emulsão é reduzida (McClements, 2004). Outra possibilidade de promover a instabilidade de emulsões óleo em água é por meio do seu resfriamento até uma temperatura que proporcione a cristalização da água, o que pode ocasionar a ocorrência de diversos processos físico-químicos adicionais (McClements, 2004). Por exemplo, quando ocorre à formação de cristais de gelo na fase aquosa as gotas de óleo são forçadas a se aproximar. Com a cristalização da água é possível que também ocorra à penetração dos cristais de gelo nas gotas de óleo e, devido às perturbações geradas na interface óleo-água, as gotas fiquem mais propensas à coalescência. Ademais, os emulsificantes podem ser adsorvidos na superfície dos cristais de gelo o que reduziria a quantidade restante para cobrir as gotas de óleo da emulsão, sendo quem temperaturas baixas podem ocasionar a perda da funcionalidade do emulsificante (McClements,
6 2004). Diante disso, estima-se que durante o congelamento lento tenha ocorrido o fenômeno da coalescência parcial nas emulsões antes da liofilização e consequentemente a separação entre as fases oleosas e aquosas. A Tabela 1 apresenta também os resultados da análise de cor contendo os valores dos parâmetros colorimétricos L *, a *, b *, C ab *, h ab e ΔE ab * para o tempo inicial (t 0 ) e após 15 dias (t 15 ). Para as emulsões submetidas ao congelamento lento, observa-se uma redução dos parâmetros a * e b * de 30% e 19% para a formulação AM 15 CL, 56% e 38% para a formulação US 15 CL e de 74% e 51% para a formulação UT 15 CL, respectivamente, após 15 dias de armazenamento. Para as emulsões submetidas ao congelamento rápido, foi observada uma redução dos parâmetros a * e b * de 46% e 34% para a formulação AM 15 CR, 31 % e 26 % para a formulação US 15 CR e de 49% e 39% para a formulação UT 15 CR, respectivamente. Os valores do parâmetro diferença total de cor (ΔE ab * ) das emulsões submetidas ao congelamento rápido são duas vezes menores quando comparado com os valores obtidos pelo congelamento lento. Portanto, a análise de cor mostrou que o método de congelamento rápido permite a manutenção da cor das emulsões de β-caroteno liofilizadas durante a fotoestabilidade. 4. CONCLUSÕES A fotoestabilidade mostrou que a estabilidade das emulsões de β-caroteno liofilizadas submetidas a diferentes métodos de homogeneização foi influenciada pelo método de congelamento antes da liofilização. As emulsões submetidas ao congelamento lento sofreram uma maior degradação do -caroteno devido ao fenômeno da coalescência parcial caracterizado pela separação das fases aquosas e oleosas da emulsão. O congelamento rápido das emulsões antes da liofilização conferiu uma redução da fotodegradação do β-caroteno, de modo que os tempos de meia-vida aumentaram em 55%, 123% e 154%, para as emulsões homogeneizadas com ultrassom, ultra-turrax e agitação magnética, respectivamente. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Boon, C. S., McClements, D. J., Weiss, J.; Decker, E. A. (2010). Factors Influencing the Chemical Stability of Carotenoids in Foods. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 50, Hou, Z., Liu, Y., Lei, F., Gao, Y. (2014). Investigation into the in vitro release properties of β-carotene in emulsions stabilized by different emulsifiers. LWT - Food Science and Technology, 59, Kechinski, C. P. (2011). Estudo de diferentes formas de processamento do mirtilo visando à preservação dos compostos antociânicos. Tese doutorado em Engenharia Química. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre. Liu, J., Shi, W. Q., Cao, Y., He, L. P.; Guan, K., Ling, W. H., Chen, Y. M. (2014). Higher serum carotenoid concentrations associated with a lower prevalence of the metabolic syndrome in middleaged and elderly Chinese adults. British Journal of Nutrition, 112 (12), McClements, D. J. (2010). Emulsion design to improve the delivery of functional lipophilic components. Annual Review of Food Science and Technology, 1, McClements, D. J. (2004). Protein-stabilized emulsions. Current Opinion in Colloid and interface Science, 9, Palazolo, G. G., Sobral, P. A., Wagner, J. R. (2011). Freeze-thaw stability of oil-in-water emulsions prepared with native and thermally-denatured soybean isolates. Food Hydrocolloids, 25, Silva, E. K., Zabot, G. L., & Meireles, M. A. A. (2015). Ultrasound-assisted encapsulation of annatto seed oil: Retention and release of a bioactive compound with functional activities. Food Research International, 78, Sluijs, I., Cadier, E., Beulens, J. W. J., Vander, A., Spijkerman, D. L., Vander Schouw, A. M. W. (2015). Dietary intake of carotenoids and risk of type 2 diabetes. Nutrition, Metabolism and Cardiovascular Diseases, 25, 4,
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