CARACTERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA E FÍSICO- QUÍMICA DE LEITE CRÚ DE BÚFALA REFRIGERADO: ANÁLISES PRELIMINARES

CARACTERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA E FÍSICO- QUÍMICA DE LEITE CRÚ DE BÚFALA REFRIGERADO: ANÁLISES PRELIMINARES MICROBIOLOGICAL AND PHYSICOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF REFRIGERATED RAW BUFFALO MILK: PRELIMINARY ANALYSIS M.M. Jantzen 1, M. Bogo 2, K.L. Cruz 3, A.G. Revello 4 ; A.S. Motta 5 1- Departamento de Medicina Veterinária Preventiva - Faculdade de Veterinária - Universidade Federal do Rio Grande do Sul - CEP:91540-000 - Porto Alegre, Brasil, Telefone: (51) 3308-7854 - e-mail: marcia.jantzen@ufrgs.br. 2- Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola e do Ambiente - Instituto de Ciências Básicas da Saúde Universidade Federal do Rio Grande do Sul - CEP: 90040-060 - Porto Alegre RS Brasil, Telefone: 3308-3452 e-mail: marci_bg@hotmail.com 3- Universidade Feevale CEP: 93525-075 - Novo Hamburgo Brasil, Telefone: 3586-8800 e-mail: karine.lauer@ufrgs.br 4- Departamento de Ciencia y Tecnología de la Leche - Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos de Origen Animal Facultad de Veterinaria - UDELAR, Montevideo, Uruguay, Telefone: 598-26222411 - e-mail: alvarogvet@gmail.com. 5- Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Instituto de Ciências Básicas da Saúde - Universidade Federal do Rio Grande do Sul CEP: 90035-190. Porto Alegre RS Brasil, Telefone: (51) 3308-4111 - e-mail: asmcons@gmail.com RESUMO Objetivou-se avaliar preliminarmente as características físico-químicas e microbiológicas de leite cru de búfala. Analisou-se oito amostras de leite coletadas do tanque de refrigeração em um laticínio no RS. As bactérias psicrotróficas foram identificadas bioquimicamente e confirmadas com o Kit API 20 ETM. A contagem de mesófilos aeróbios variou de 3,07 a 6,46 Log UFC.mL -1 e de psicrotróficos entre 4,69 e 6,99 Log UFC.mL -1. Das 21 psicrotóficas selecionadas, identificou-se os gêneros Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Oligella sp., Enterobacter sp. e Moraxella sp. Utilizando-se a metodologia indicada pela IN n 0 68/2006 (MAPA), as médias dos parâmetros físicoquímicos foram: gordura 5,63 % (±0,25), densidade 1,0358 g.ml-1 (±0,0001), ST 15,85% (±0,47), SNG 10,21% (±0,31), crioscopia -0,553 o H, ph 6,65 (±0,008) e a acidez 20,8 o D. Na prova do álcool, 4/8 amostras coagularam na concentração 68% e uma coagulou apenas à 80%. Quando testada a resistência térmica à fervura, nenhuma das amostras coagulou, indicando termoestabilidade. ABSTRACT We objectified to evaluate preliminary physical chemistry and microbiology characteristics of row buffalo milk. It was analyzed eight samples obtained from a refrigerated tank in a dairy industry located in Rio Grande do Sul State. Psichrotrophic bacteria were biochemistry identified and confirmed by API 20 ETM Kit. Mesophilic bacteria varied from 3,07 to 6,46 Log CFU.mL -1 and psychrorophic bacteria between 4,69 and 6,99 Log CFU.mL -1. From 21 psychrotrofic bacteria isolated, there were Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Oligella sp., Enterobacter sp. and Moraxella sp. According to IN n 0 68/2006 (MAPA) methodology, the average to physico chemistry

results were: fat 5,63 % (±0,25), density 1,0358 g.ml-1 (±0,0001), total solids 15,85% (±0,47), solidsnon-fat 10,21% (±0,31),crioscopy -0,553 o H, ph 6,65 (±0,008) and acidity 20,8 o D. In the alcohol test, 4/8 samples coagulated in a the 68% alcohol concentration and 1/8 coagulated just at 80%. When burning thermic resistance was tested, no sample coagulated, indicating the milk thermostability. PALAVRAS-CHAVE: leite de búfala, físico-química, mesófilos, psicrotróficos. KEYWORDS: buffalo milk, physicochemistry; mesophilic bacteria, psychrotrophic bacteria; microbiology. 1. INTRODUÇÃO No Brasil, tem ocorrido um aumento crescente na criação búfalos (Bubalus bubalis), em decorrência do leite bubalino ser uma fonte rica de componentes que são essenciais para a produção de produtos derivados, que hoje vem sendo extensivamente consumidos (Ahmad et al., 2013). Seu sabor é ligeiramente adocicado e mais branco do que o leite bovino, ainda, contém nutrientes em níveis mais altos do que no leite humano, bovino e caprino (Ahmad et al., 2013). O leite cru contém uma grande variedade de bactérias psicrotróficas e mesófilas provenientes do ambiente de produção (Teh et al., 2011). O armazenamento do leite cru sob condições de refrigeração possibilita o controle de micro-organismos mesófilos e coliformes totais. No entanto, quando a contaminação inicial do leite é grande e ocorre o armazenamento por períodos prolongados, pode ocorrer o favorecimento do crescimento de bactérias psicrotróficas (Perin et al., 2012). Embora estas culturas possam ser eliminadas com os processos de tratamento térmico, as enzimas hidrolíticas extracelulares (lipolíticas e proteolíticas) produzidas por estas bactérias são termorresistentes (Teh et al., 2011) e permanecem durante toda a vida de prateleira do produto. O resultado é o surgimento de amargor e geleificação do leite (Teh et al., 2011). A característica do leite bubalino quanto à seus constituintes lhe dá oportunidade de ser uma ótima matéria prima para a elaboração de derivados, principalmente com relação ao seu conteúdo em gordura, a qual pode variar de 5,5 a 8,5%, tendo como causa de variação as raças e as regiões onde se encontram os animais. Além da gordura, os demais constituintes e parâmetros indicadores de qualidade do leite podem variar significativamente, sendo que a quantificação e caracterização desses parâmetros indicam a qualidade tecnológica do leite que a indústria recebe e transforma. O objetivo do presente estudo foi avaliar as propriedades físico-químicas, quantificar bactérias mesófilas e também identificar os micro-organismos psicrotróficos no leite cru de búfala refrigerado (leite de conjunto). 2. MATERIAL E MÉTODOS Um total de oito amostras com aproximadamente 200 ml de leite de conjunto cru de búfala refrigerado foram analisadas quinzenalmente nos meses entre primavera e verão, no Laboratório de Microbiologia e no Laboratório de Inspeção e Tecnologia de Leite, Derivados Ovos e Mel da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Uma empresa de laticínios localizada no município de

Glorinha (RS) forneceu as amostras de leite coletadas do tanque de recebimento. As amostras foram encaminhadas ao laboratório em refrigeração e imediatamente analisadas. Para as análises físico-químicas, as amostras foram homogeneizadas e procederam-se os testes para a pesquisa de gordura, densidade, sólidos totais (ST), sólidos não gordurosos (SNG) e crioscopia, de acordo à IN n 0 68 de 2006, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) (Brasil, 2006). Para a verificação da estabilidade térmica do leite, foi realizado o teste do álcool nas concentrações de 68%, 72%, 76% e 80%(v/v) e o teste da fervura (Brasil, 2006). Para as análises microbiológicas, foram realizadas as contagens de micro-organismos mesófilos e psicrotróficos segundo a metodologia indicada pela Instrução Normativa n 62, de 2003, do MAPA (Brasil, 2003). O isolamento das bactérias psicrotróficas a partir do meio de cultura PCA foi feito baseado nas características e morfologia das colônias. Foram selecionadas colônias com características diferentes em tamanho, forma, cor e borda. As colônias selecionadas foram transferidas para caldo BHI (Brain Heart Infusion, Oxoid, UK) e mantidas a temperatura 20 C por 48 horas. Após o crescimento, foram semeadas em meio de cultura Agar BHI e incubadas durante a 20 ºC por 48 horas. A identificação dos micro-organismos psicrotróficos foi realizada com o emprego de testes morfológicos e bioquímicos de acordo com MacFaddin (2000), comparando os dados com as espécies padrão. As avaliações morfológicas, culturais e fisiológicas foram comparadas com os dados descritos no Bergey s Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al. 2000). Para confirmação das identificações, um Kit de Identificação para bacilos Gram-negativos foi empregado (Kit API 20). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Nas análises físico-químicas, a média encontrada para a concentração de gordura foi de 5,63% (±0,25), de densidade foi de 1,0358 g.ml -1 (±0,0001), ST 15,85% (±0,47), SNG 10,21% (±0,31) e crioscopia -0,553 o H (±0,008). Nos parâmetros relativos à acidez, a média nas amostras foi de ph 6,65 (±0,18) e acidez titulável de 20,8 D. Quando as amostras foram testadas para a estabilidade térmica, quatro amostras coagularam na menor concentração de álcool, porém não coagularam no teste da fervura, assim como a totalidade das amostras. Apenas uma delas coagulou somente em contato com o álcool 80% (Tabela 1). A legislação brasileira não apresenta parâmetros para avaliação da qualidade do leite de búfala, sendo utilizados os parâmetros para o leite bovino (BRASIL, 2011). Somente no estado de São Paulo existe legislação que regulamenta alguns parâmetros de qualidade do leite de búfala (São Paulo, 1994). Um desses parâmetros é a crioscopia, que pode variar entre -0,520 H e -0,570 H. Considerando essa legislação, a média dos resultados encontrados (-0,553 0H) estava dentro desse intervalo e também foram similares aos encontrados por Faria et al. (2002) que observaram variações na crioscopia de -0,512 a -0,552 H durante a lactação. Benevides et al. (2001) obtiveram valores inferiores (13,92%) do que o presente estudo para ST no leite bubalino da raça Murrah. A gordura é o componente que mais varia no leite de todas as espécies. A média encontrada (5,63%) ficou abaixo da encontrada por Tonhati (1999), o qual encontrou média de 6,14%. Fatores como sazonalidade podem influenciar esse resultado, sendo que nos meses de primavera os índices de gordura tendem a ser maiores (Amaral et al., 2005). A acidez titulável tende a ser mais elevada no leite bubalino, pela presença de aminoácidos de característica anfóteras. Em nosso estudo, a acidez média (20,8 D) foi mais elevada do que o encontrado por Rocha (2008), que obteve 18 e 19 D no início e no final da lactação, respectivamente. Já a densidade (1,0358 g.ml -1 ) não diferiu muito do encontrado por Nader Filho et al. (1996), com média de 1,0367 g.ml -1 naquele estudo.

Na prova do álcool, espera-se que o resultado seja negativo (não coagulação), porém fatores como temperatura, ph, excesso de Ca 2+ podem afetar a estabilidade da caseína (O Connell et al., 2006). Isso é importante levar em conta, pois amostras que foram positivas ao álcool não coagularam na prova da fervura, indicando sua estabilidade térmica. As contagens de bactérias mesófilos apresentaram valores entre 3,07 log UFC/mL e 6,46 log UFC/mL. As amostras de leite cru bubalino 5, 6, 7 e 8 apresentaram as maiores contagens de mesófilos com média de 6,4 log UFC/mL. As amostras apresentaram ou não diferença significativa (Tabela 1). Quando levamos em consideração a legislação existente em São Paulo, através da Resolução SAA N.º 24, de 01 agosto de 1994 (São Paulo, 1994), as amostras 5, 6, 7 e 8 apresentaram-se acima dos limites permitidos para a contem de mesófilos aeróbios facultativos (MAF), já que obtiveram contagens acima de 500.000 UFC/mL. A presença desses microrganismos é indesejável no leite, pois além das alterações irreversíveis no leite pela acidificação, essas bactérias são indicadoras da qualidade microbiológica, tornando-se um risco a saúde humana do consumidor (Barbano et al., 2006). No presente trabalho, contagens altas de bactérias psicrotróficas foram encontradas no leite cru refrigerado de búfala, com valores entre 4,69 log UFC/mL e 6,99 log UFC/mL, com média de 6,2 log UFC/mL. (Tabela 1). Cabe salientar que a legislação brasileira não determina um limite para a população de bactérias psicrotróficas para o leite bovino, tão pouco para o leite bubalino. No entanto, conforme Pinto et al. (2006), não é recomendável a fabricação de produtos lácteos com leite cru com contagem de psicrotróficos superior a 6,7 log UFC/mL, pois estes micro-organismos mantêm sua capacidade de multiplicação em condições de refrigeração e tendem a se tornar predominantes na microbiota do leite cru, bem como são potencialmente produtores de enzimas proteolíticas e lipolíticas. Tabela 1. Resultados das análises microbiológicas (Mesófilos aeróbios facultativos e psicrotróficos), e provas de resistência térmica (álcool e fervura) das amostras de leite cru refrigerado de búfala. Amostras MAF 1 PSICRO 2 Prova do álcool 3 Prova da 68% 68% 72% 76% 80% Fervura 1 4,63 6,9 + xxx xxx xxx xxx Estável 2 3,5 6,34 - - - + xxx Estável 3 3,07 4,69 - - - - + Estável 4 5,64 4,59 - - + xxx xxx Estável 5 6,46 6,99 + xxx xxx xxx xxx Estável 6 6,46 6,44 + xxx xxx xxx xxx Estável 7 6,6 6,74 + xxx xxx xxx xxx Estável 8 6,11 6,96 + xxx xxx xxx xxx Estável 1 Contagem de Mesófilos Aeróbios Facultativos (log UFC.mL -1 ); 2 Contagem de bactérias psicrotróficas (log UFC.mL -1 ); 3 += coagulação, - = sem coagulação (quando amostra apresentasse positividade na menor concentração de álcool, as demais não eram realizadas). Com as contagens totais de bactérias psicrotróficas do leite cru de búfala refrigerado, foi possível a seleção e o isolamento de colônias para a identificação em nível de gênero/espécie. Das colônias selecionadas, 21 foram submetidas à identificação. Os testes bioquímicos realizados foram: prova da catalase, crescimento em MacConkey, prova da utilização de citrato, prova de oxidaçãofermentação, prova da uréia, prova do vermelho de metila (VM), prova de Voges-Proskauer (VP), prova de motilidade, produção de indol, prova Triple Sugar Iron Agar (TSI), prova de desaminação de fenilalanina, utilização de glicose, prova de gás sulfídrico e prova de oxidase. Para a confirmação da

identificação, os mesmos isolados foram inoculados em um KIT de identificação miniaturizado API 20 E TM. As bactérias psicrotróficas proteolíticas isoladas do leite cru refrigerado de búfala pertencem a cinco gêneros, sendo eles Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Oligella sp., Enterobacter sp. e Moraxella sp. 4. CONCLUSÃO As amostras analisadas obtiveram índices que poderiam ser considerados baixos quanto ao percentual de gordura e de ST, para a espécie bubalina. A acidez titulável apresentou-se elevada, porém não afetou a termoestabilidade do leite, de acordo ao teste da fervura. Uma pesquisa sobre sazonalidade ao longo do ano pode indicar que esse seja o fator que leve à diminuição nos parâmetros físico-químicos encontrados. Metade das amostras de leite analisadas apresentaram contagens bactérias mesófilas fora dos padrões exigidos para o leite bovino, indicando falhas na higiene da ordenha, dos equipamentos e/ou na cadeia do frio. Além das elevadas contagens de bactérias psicrotróficas terem sido constatadas, estas pertenciam aos Acinetobacter, Pseudomonas, Oligella, Enterobacter e Moraxella. Estas bactérias por sua vez, podem comprometer a qualidade do leite mesmo após a pasteurização. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Ahmad, S., Anjum, F. M., Huma, N., Sameen, A., Zahoor, T. (2013) Composition and physicochemical characteristics of buffalo milk with particular emphasis on lipids, proteins, minerals, enzymes and vitamins. The Journal of Animal and Plant Sciences, v. 23, p 62-74. Amaral, F., Carvalho, L., Silva, N. Brito, J. (2005) Qualidade do leite de búfalas: composição. Rev Bras Reprod Anim. Belo Horizonte, V.29, n.2, p.106-110, abril/jun. Barbano, D. M.; Ma, Y.; Santos, M.V. (2006) Influence of raw milk quality on fluid milk shelf life. Journal of Dairy Science, v. 89, p. 15-19. Benevides, C. M. J., Trigueiro, I. N., Santos, M. A. F. (2001) Estudo da variação da produção e do teor de gordura, do leite de búfala (Raca Murrah) na microregião de Catu-Ba em 165 dias de lactação. Higiene Alimentar. v. 15, n. 80/81, p. 100. Brasil. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. (2003) Instrução Normativa Nº 62, de 26 de agosto de 2003. Métodos analíticos oficiais para análises microbiológicas para controle de produtos de origem animal e água. Diário Oficial da Republica Federativa do Brasil. Brasil. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. (2006) Instrução Normativa n 68, de 12 de dezembro. Oficializa os Métodos Analíticos Oficiais Físico-Químicos, para Controle de Leite e Produtos Lácteos. Diário Oficial da União, Brasília, DF Seção I, p. 8. Brasil. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. (2011) Instrução Normativa n 62, de 29 de dezembro de 2011. Aprova o Regulamento Técnico de Produção, Identidade e Qualidade do Leite tipo A, o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Leite Cru Refrigerado, o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Leite Pasteurizado e o Regulamento Técnico da Coleta de Leite Cru Refrigerado e seu Transporte a Granel. Diário Oficial da União, Brasília, DF, Seção I, p. 6.

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