Departamento de Zoologia da Universidade de Coimbra MICROBIOLOGIA António Verissimo Paula Morais Coloração de Gram Esta técnica permite subdividir as bactérias em dois grandes grupos: as designadas Gram positivas, que têm a capacidade de reter o primeiro corante usado (cristal violeta), e as Gram negativas que não tendo essa capacidade adquirem a cor do corante utilizado depois da lavagem com o solvente orgânico. Este facto deve-se à diferença na espessura da camada de peptidoglicano existente nas paredes bacterianas. Assim, uma camada espessa (como nas positivas) depois de colapsar sob o efeito desidratante do etanol, não permite a saída do complexo formado pelo cristal violeta e pelo iodo; contrariamente uma camada fina de peptidoglicano (como nas negativas) mesmo colapsada não evita a saída do corante ficando a célula incolor, por isso, a necessidade de utilizar um corante contrastante - a safranina. Procedimento Utiliza-se o método de Hucker para a coloração de Gram. As células para a coloração são retiradas de uma cultura jovem em meio sólido, seguindo os seguintes passos: - secagem e fixação do esfragaço com calor - imersão do esfregaço no reagente de coloração (cristal violeta) durante um minuto;
- imersão com mordente (iodo de Gram) durante um minuto; - lavagem com solvente de descoloração (etanol/acetona); - imersão do esfregaço em contrastante (safranina) durante um minuto; - lavagem com água e secagem com papel de filtro. Observar o esfregaço ao microscópio utilizando a objectiva de imersão. Reagentes para coloração de Gram Cristal de violeta Solução A : Cristal de violeta Etanol 95% (vol/vol) 2.0 g 20 ml Solução B: Oxalato de amónio Água desmineralizada 0.8 g 80 ml Misturar as soluções A e B para obter o reagente de coloração cristal de violeta. Deixar repousar 24 horas e filtrar por papel de filtro antes de usar. 2
Mordente - Iodo de Gram Iodo Iodeto de potássio Água desmineralizada até 1.0 g 2.0 g 300 ml Triturar o iodo e o iodeto de potássio num almofariz. Adicionar a água lentamente continuando a triturar. Guardar numa garrafa escura. Solvente de descoloração Etanol / acetona (80:20) vol/vol Corante de contraste Safranina O (2,5% [p/vol] em etanol 95%)10 ml Água desmineralizada 100 ml 3
Coloração de flagelos: Utiliza-se o método desenvolvido por Kodaka et. al., que inclui os seguintes passos: 1- preparação do esfregaço. Utilizam-se lâminas de microscópio novas pré-lavadas. Em cada uma colocam-se duas gotas de água estéril. Com uma ança retira-se cuidadosamente um pouco de material de uma cultura jovem crescida em NA (18-24h a 22 C), e toca-se primeiro numa gota e depois na outra. Colocam-se as lamelas. 2- coloração do esfregaço. Coloca-se uma gota de corante entre a lâmina e a lamela.. 3- observação ao microscópio. procede-se à observação das preparações em campo claro com objectiva de imersão (1000 vezes). Reagentes para coloração de flagelos Solução A: Ácido tânico 2.0g Solução de fenol 5% 10mL Dissolver cuidadosamente. Adicionar, mexendo sempre, 10mL de uma solução saturada de sulfato de potássio e alumínio dodecahidratada. Manter a solução em frasco de vidro escuro à temperatura ambiente. 4
Solução B: Solução saturada de cristal de violeta em etanol a 95%. Para obter o corante final, adicionar 1 ml de B de solução lentamente e mexendo sempre, a 10 ml de solução A. A solução final é filtrada com papel de filtro e guardada à temperatura ambiente. Coloração de endosporos - Fazer um esfregaço de B. cereus e/ou B. subtilis - Colocar num suporte com água a ferver por baixo - Corar com verde de malaquite (5%) durante 5 minutos, mantendo sobre a água a ferver - Lavar com água - Corar com safranina durante 30 s - Lavar com água - Observar ao microscópio (objectiva de imersão) 5