MICROSCOPIA DE EPIFLUORESCÊNCIA

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1 MICROSCOPIA DE EPIFLUORESCÊNCIA Fitoplâncton e Bacterioplâncton Microscopia de Epifluorescência - foi introduzida nas ciências aquáticas nos anos 70 - permitiu a observação de pequenos organismos (<2 µm) que são pequenos demais para se depositarem com o método de Utermöhl (1958) ou para serem reconhecidos com um microscópio óptico - permite a diferenciação entre organismos autotróficos e heterotróficos - células flageladas frágeis são preservadas - esta técnica deve ser usada juntamente com a microscopia de inversão Princípio de Funcionamento Um certo volume de água é filtrado por uma membrana apropriada; o filtro é colocado no microscópio epifluorescente, no qual a luz é filtrada através de filtros apropriados, de modo a incidir luz de determinado comprimento de onda, que vai excitar as moléculas, as quais vão fluorescer. Soluções Glutaraldeído a 25% para microscopia de epifluorescência para fixar a amostra; adicionar até uma concentração final de 2 a 5% (v/v) Proflavina dissolver 10 mg de proflavina em 40 ml de água destilada ou desionizada; filtrar por filtro de 0,2 µm; armazenar no frio (4ºC) e no escuro; adicionar 50 µl de proflavina por 5 ml de amostra de água Acridina laranja dissolver 0,25 g de acridina laranja em 250 ml de água destilada préfiltrada por 0,2 µm; armazenar no frio (4ºC) e no escuro Fixação e Armazenamento de Amostras - um volume apropriado de amostra de água deve ser colocado num frasco de vidro escuro e fixado com glutaraldeído a 25% refrigerado (concentração final de glutaraldeído = 2-3%; 15 ml amostra + 2 ml glutaraldeído 25% refrigerado - Cf = 2,9%) - a amostra deve ser conservada no frio (4ºC) e no escuro e as preparações devem ser feitas até 24 horas após a recolha, para evitar a perda de autofluorescência (preparações de bactérias podem ser feitas até 1 semana depois da recolha) - vantagens e desvantagens do glutaraldeído: RIOSBD 1

2 Preserva a morfologia celular de forma adequada Amostra fixada tem que ser armazenada no frigorífico durante poucos dias Preparação pode ser armazenada durante longos períodos de tempo (anos) no congelador Extremamente tóxico É usado em concentrações finais entre 2 e 5% FITOPLÂNCTON - montar o sistema de filtração composto por kitasato ligado a uma bomba de vácuo e funil de filtração preso com uma mola - colocar um filtro de acetato de celulose com diâmetro do poro 0,4 µm (serve de filtro de suporte, permitindo uma distribuição uniforme dos organismos sobre o filtro de membrana) - sob o filtro de suporte, colocar o filtro de membrana de policarbonato de cor negra com diâmetro do poro 0,4 µm (se o filtro for branco deve corar-se previamente o filtro com irgalão negro) - colocar a chaminé de filtração e prender com a mola - pipetar um volume adequado (Guadiana 1-5 ml) de amostra para a chaminé (o volume de amostra a filtrar depende da quantidade de organismos presentes na amostra e nas patículas em suspensão) - adicionar proflavina (50 µl de corante para 5 ml de amostra), cobrir a chaminé com papel de alumínio e aguardar 3 minutos (tempo de contacto) - filtrar com pressão < 100 mm Hg (para evitar a destruição das células) - colocar uma gota de óleo não fluorescente (Cargille tipo A) numa lâmina - retirar a membrana do sistema de filtração, colocar a membrana sobre a gota de óleo, colocar nova gota de óleo sobre a membrana e cobrir com lamela - conservar a preparação no frio (-20ºC) e no escuro Contagem do Fitoplâncton Procedimento Geral - devem ser contados no mínimo 50 campos visuais, 400 células no total e 100 células da espécies mais abundante (precisão de contagem = 10%) - cálculo da abundância: abundância (cél.l! 1 ) = x.a.d a.n.v onde: x = número de células contadas A = área da chaminé de filtração (mm 2 ) RIOSBD 2

3 d = factor de diluição devido à adição de glutaraldeído (vol. final/vol. amostra) a = área do campo (mm 2 ) n = número de campos contados v = volume de amostra filtrado (L) - para medir as células usa-se o reticulado New Porton G12 (May, 1965) - o biovolume celular médio é calculado com base nas fórmulas geométricas que melhor se adequam a cada espécie (ex. Hillebrand et al., 1999) - a biomassa é calculada como função não linear do volume celular médio, usando as relações descritas na literatura (ex. Verity et al., 1992) BACTERIOPLÂNCTON - montar o sistema de filtração composto por kitasato ligado a uma bomba de vácuo e funil de filtração preso com uma mola - colocar um filtro de acetato de celulose com diâmetro do poro 0,2 µm (serve de filtro de suporte, permitindo uma distribuição uniforme dos organismos sobre o filtro de membrana) - sob o filtro de suporte, colocar o filtro de membrana de policarbonato de cor negra com diâmetro do poro 0,2 µm (se o filtro for branco deve corar-se previamente o filtro com irgalão negro) - colocar a chaminé de filtração e prender com a mola - pipetar um volume adequado (Guadiana 1-5 ml) de amostra para a chaminé (o volume de amostra a filtrar depende da quantidade de organismos presentes na amostra e nas patículas em suspensão) - filtrar com pressão < 100 mm Hg (para evitar a destruição das células) - adicionar acridina laranja (algumas gotas, de modo a cobrir o fundo), cobrir a chaminé com papel de alumínio e aguardar 3 minutos (tempo de contacto) - colocar uma gota de óleo não fluorescente (Cargille tipo A) numa lâmina - retirar a membrana do sistema de filtração, colocar a membrana sobre a gota de óleo, colocar nova gota de óleo sobre a membrana e cobrir com lamela - conservar a preparação no frio (-20ºC) e no escuro Contagem do Bacterioplâncton Procedimento Geral - devem ser contados no mínimo 20 campos visuais e 300 células no total, usando o gratículo New Porton G12 (May, 1965) RIOSBD 3

4 - cálculo do número total de bactérias (TBN): TBN (cél.l! 1 ) = x.a.d a.n.v onde: x = número de células contadas A = área da chaminé de filtração (mm 2 ) d = factor de diluição devido à adição de gluteraldeído (vol. final/vol. amostra) a = área do campo (mm 2 ) n = número de campos contados v = volume de amostra filtrado (L) Coloração de filtros de membrana com irgalão negro - os filtros de membrana a usar em microscopia de epifluorescência devem ser negros - os filtros brancos podem ser corados com irgalão negro a 2% (filtrar 98 ml de água destilada por 0,2 µm, adicionar 2 ml de ácido acético e 0,2 g de irgalão negro, filtrar novamente) - colocar o irgalão numa placa de petri de vidro - mergulhar os filtros no corante, deixar 24 horas - lavar bem os filtros em várias placas de Petri com água destilada - secar no exsicador Bibliografia Daley RJ, JE Hobbie (1975) Direct counts of aquatic bacteria by a modified epifluorescence technique. Limnology and Oceanography 20: Haas LW (1982) Improved epifluorescence microscopy for observing planktonic micro-organisms. Annalles de l Institut Oceanographique de Paris 58: Hillebrand H, C-D Dürselen, D Kirschtel (1999) Biovolume calculation for pelagic and benthic microalgae. Journal of Phycology 35: Hobbie JE, RJ Daley, S Jasper (1977) Use of Nucleopore filters for counting bacteria by fluorescence microscopy. Applied and Environmental Microbiology 33: May KR (1965) A new graticule for particle counting and sizing. J Sci Instrum 42: Utermöhl H (1958) Zur vervollkommung der quantitativen phytoplankton-methodik. Mitteilungen- Internationale Vereiningung für Limnologie 9: RIOSBD 4

5 Verity PG, CY Robertson, CR Tronzo, MG Andrews, JR Nelson, ME Sieracki (1992) Relationships between cell volume and the carbon and nitrogen content of marine photosynthetic nanoplankton. Limnology and Oceanography 37: RIOSBD 5