Preparação de meio líquido - triptona ou peptona - extrato de levedura 1º Dissolver a triptona e o extrato; 2º Acrescentar o cloreto de sódio e acertar o volume; 3º Após tudo dissolvido e com volume correto, autoclavar; - cloreto de sódio (NaCl) - água Milli-Q Para 1L de meio triptona ou peptona 16g (1,6%) extrato de levedura 10g (1%) NaCl 5g (0,5%) água q.s.p. 1L Preparação de placas - meio LB-ágar - placas de Petri de acrílico estéreis - antibiótico correspondente ao vetor transformado 1º Derreter o ágar com o meio em micro-ondas aos poucos (CUIDADO: evitar ferver para não verter); 2º Esfriar até ser suportável ao toque; 3º Adicionar ao meio o antibiótico, 1µL/mL de meio. 4º Distribuir o preparado nas placas, colocar no mínimo 20mL em cada; 5º Esperar que seque, de 5 a 10 minutos, com tampa aberta dentro do fluxo. OBS.: guardar em geladeira tampada e com papel filme em volta, manter até uma semana. Transformação de bactérias - célula competente - gelo - vetor/plasmídeo de interesse - banho 42 C - meio LB normal 1º Descongelar células tiradas do freezer -80 C, mantendo-as no gelo; 2º Ao eppendorf das células, adicionar 1µL do plasmídeo e manter no gelo por 30 minutos; 3º Colocar o eppendorf no banho por 45 segundos; 4º Tirar do banho e voltar para o gelo por, aproximadamente, mais 1 minuto; 5º Adicionar 750µL do meio e antibiótico; 6º Levar a estufa 37 C por 1 hora, ainda no eppendorf. 7º Centrifugar por 5 minutos a 12000g. 8º Retirar em torno de 700µL do sobrenadante e ressupender com o volume restante; 9º Seguir protocolo de plaqueamento utilizando cerca de 20uL do ressuspendido.
Plaqueamento - placas já preparadas com ágar, meio e antibiótico - alça de plaqueamento autoclavada - célula de interesse 1º Colocar volume conhecido da célula transformada; 2º Passar a alça pela placa a fim de espalhar a solução celular até que seque; 3º Mantenha no fluxo aberto por mais uns 2 minutos para garantir que esteja seco; 4º Feche a placa e vire-a, deixar o ágar com o meio, sempre, para cima; 5º Levar a estufa a 37 C overnight. OBS.: Na placa, anotar: construção do vetor de transformação volume colocado cepa utilizada nome Ligação de vetor com sequência para construção - sequência e vetor digeridos - tampão para T4 10x (descongelar em gelo e - enzima T4 DNA ligase vortexar) 1º Colocar 2uL do tampão em eppendorf de 1,5mL; 2º Adicionar a sequência e o vetor, numa relação de 1:10 (molar), junto ao tampão; 3º Adicionar 1uL da ligase; 4º Deixar incubando na porta da geladeira overnight. Preparação de TB Terrific Broth (super rico) - triptona ou peptona - difosfato de potássio (KH 2 PO 4 ) - extrato de levedura - monofosfato de potássio (K 2 HPO 4 ) - glicerol - água Milli-Q 1º Dissolver a triptona, o extrato e o glicerol em água Milli-Q (quantidades na tabela); 2º Após dissolvido, autoclavar SOLUÇÃO I; 3º Dissolver KH 2 PO 4 e K 2 HPO 4 em água Milli-Q (quantidades na tabela); 4º Após dissolvido, filtrar em ambiente estéril com filtro de 22µm SOLUÇÃO II; 5º Esfriar a SOLUÇÃO I até, aproximadamente 60 C, e adicionar a SOLUÇÃO II, trabalhar em ambiente estéril.
Digestão com enzimas de restrição - amostra - tampão - enzimas 1º Colocar 25uL da amostra a ser digerida em eppendorf de 1,5mL; 2º Adicionar 1uL de cada enzima de restrição a ser utilizada (até 2 diferentes); 3º Adicionar 3uL de tampão que corresponda as enzimas utilizadas; 4º Deixar incubando por 2h a 37 C (estufa). Escolha do tampão para dupla digestão com diferentes enzimas de restrição: Entrar em: https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/double-digest-finder 1º Selecionar as enzimas que serão utilizadas; 1º Escolher o tampão que apresentar melhor % de atividade para ambas as enzimas. Corridas em gel de agarose: Controles: vetor não digerido, vetor digerido, fragmento não digerido e fragmento digerido. Plasmídeos: para extração do plasmídeo digerido (protocolo Extração de DNA de gel de agarose GeneJET Gel Extraction Kit) usar canaleta maior. Desfosforilação do vetor pós-digestão - tampão cutsmart (10X) - água Milli-Q - fosfatase alcalina 5 unidades Para 20uL de reação: 1º Colocar 15uL da amostra a ser digerida em eppendorf de 1,5mL; 2º Adicionar 0,5uL da fosfatase (está em excesso 5X); 3º Adicionar 2uL de tampão (concentração final 1X); 4º Deixar incubando por 30-60 minutos a 37 C (estufa). Corridas em gel de agarose: Para purificação do plasmídeo digerido e desfosforilado, protocolo Extração de DNA de gel de agarose GeneJET Gel Extraction Kit usar canaleta maior. Preparação de meio com ágar - meio líquido - ágar 1,5% 1º Separa o meio líquido (não autoclavado) em alíquotas de 100mL; 2º Adicionar 1,5g de ágar para cada 100mL do meio líquido e autoclavar em seguida.
Reação de PCR iproof TM High-Fidelity PCR Kit - kit iproof TM High-Fidelity PCR - DNA template - primers (Fw e Rv) 1º Fazer um Mix de reação que contenha: tampão do kit, dntps do kit, água Milli-Q e solução de Mg 2+ do kit. (considerar uma reação a mais); 2º Separar o Mix em volumes iguais em eppendorf para PCR; 3º Adicionar a cada tubo de reação, os dois primers e o DNA template (mantenha sempre no gelo); 4º Levar ao termociclador, adicionar a DNA polimerase do kit em cada tubo de reação; Seguir a tabela a seguir de acordo com o volume de reação desejado: Componente Volume para 50uL de reação (ul) Volume para 20uL de reação (ul) Concentração final Tampão 5x iproof HF 10 4 1x dntps 1 0,4 200uM cada Primer Fw 1,25 0,5 0,1uM Primer Rv 1,25 0,5 0,1uM DNA template 2 0,8 Água Milli-Q 34 13,6 DNA polimerase iproof 0,5 0,2 0,02U/uL OBS.: inicie os teste com uma concentração de 0,5mM de Mg 2+ (descontar volume desta solução do volume da água) Programação do termociclador: 120 100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Temperatura ( C) Tempo (s) início 98 30 98 10 30 ciclos 55 30 72 15 final 72 10 stand by 9 infito
Purificação de produto de PCR GeneJET PCR Purification Kit - kit GeneJET PCR Purification - produto de PCR - isopropanol 100% (opcional) 1º Para fragmento de DNA <500 bp: Adicionar 1 volume de amostra, para 1 de isoprapanol 100%, para 1 volume de tampão de ligação; 1 º Para fragmentos de DNA maiores: Adicionar 1 volume de amostra para 1 volume de tampão de ligação; 2º Transferir a mistura para a coluna do kit (não encostar a ponteira na membrana); 3º Centrifugar a 12000g por 1 minutos, descartar o flow-through; 4º Adicionar 700uL do tampão de lavagem do kit (previamente diluído); 10º Centrifugar a 12000g por 1 minuto, descartar o flow-through; 11º Centrifugar a 12000g por mais 1 minuto com o recipiente da coluna aberta (tirar toda a solução de lavagem); 12º Colocar o recipiente da coluna em um eppendorf de 1,5mL; 13º Adicionar 30 ou 50uL de água Milli-Q morna (colocar no centro da coluna); 14º Centrifugar a 12000g por 1 minutos (guardar em freezer -20 C). OBS.: Todo o procedimento pode ser realizado em bancada a TA. Extração de DNA de gel de agarose GeneJET Gel Extraction Kit - kit GeneJET Gel Extraction - gel de agarose com a banda - isopropanol 100% (opcional) 1º Cortar a banda do gel e colocar em um eppendorf de 1,5mL; 2º Pesar a banda do gel, considerar 100mg de gel 100uL de gel. Adicionar 1 volume de amostra para 1 volume de tampão de ligação; 3º Incubar o gel com o tampão a 50-60 C por 10min ou até o gel dissolver; 4º Transferir a mistura para a coluna do kit (não encostar a ponteira na membrana); 5º Centrifugar a 12000g por 1 minutos, descartar o flow-through; 6º Adicionar 700uL do tampão de lavagem do kit (previamente diluído); 7º Centrifugar a 12000g por 1 minuto, descartar o flow-through; 8º Centrifugar a 12000g por mais 1 minuto com o recipiente da coluna aberta (tirar toda a solução de lavagem); 9º Colocar o recipiente da coluna em um eppendorf de 1,5mL; 10º Adicionar 30 ou 50uL de água Milli-Q morna (colocar no centro da coluna); 11º Centrifugar a 12000g por 1 minutos (guardar em freezer -20 C). OBS.: Todo o procedimento pode ser realizado em bancada a TA.
Purificação de DNA plasmidial - Mini Prep GeneJET - kit GeneJET Plasmid Miniprep - amostra 1º Centrifugar a amostra a 12000g por 10 minutos; 2º Ressuspender o pellet com 250uL da solução de ressuspenssão do kit; 3º Transferir a solução para um eppendorf de 1,5mL; 4º Adicionar 250uL da solução de lise do kit, verter de 4-6 vezes (não demorar mais de 3 minutos com nessa etapa); 5º Adicionar 350uL de solução de neutralização do kit, verter de 4-6 vezes; 6º Centrifugar a 12000g por 5 minutos; 7º Transferir o sobrenadante para a coluna do kit (não encostar a ponteira na membrana); 8º Centrifugar a coluna a 12000g por 1 minuto, descartar o flow-through; 9º Adicionar 500uL do tampão de lavagem do kit (previamente diluído); 10º Centrifugar a 12000g por 1 minuto, descartar o flow-through; 11º Centrifugar a 12000g por mais 1 minuto com o recipiente da coluna aberta (tirar toda a solução de lavagem); 12º Colocar o recipiente da coluna em um eppendorf de 1,5mL; 13º Adicionar 30 ou 50uL de água Milli-Q morna (colocar no centro da coluna), manter a TA por 2 minutos; 14º Centrifugar a 12000g por 2 minutos (guardar em freezer -20 C).