CINÉTICA ENZIMÁTICA
INTRODUÇÃO O conhecimento das propriedades cinéticas das enzimas é importante para compreender as transformações que ocorrem no interior das células que participam dos processos fermentativos e também dos reatores enzimáticos. 2 APLICAÇÕE INDUTRIAI Tabela : Enzimas aplicadas na indústria ENZIMA Proteases Amilase (Bacillus subtilis) Tripsina (pâncreas animal) Papaína (mamão) e Bromelina (abacaxi) Pepsina (estômago animal) Renina (estômago de bezerros) Pectinase (Aspergilus niger) APLICAÇÃO *Fabricação de aspartame *Obtenção de insulina humana a partir de insulina suína *Indústria de fermentação alcoólica *Produção de glicose Amolecimento de carnes *Auxiliar digestivo *Amolecimento de carnes Auxiliar digestivo Fabricação de queijo Retirada de pectina na clarificação de sucos de frutas
Enzimas são proteínas (seqüência de aminoácidos) com peso molecular muito grande, e com propriedades catalíticas. Na maioria das vezes são proteínas globulares. É mostrado na tabela 2 uma comparação entre as características das enzimas e dos catalisadores inorgânicos. Tabela 2: Comparação entre as enzimas e os catalisadores inorgânicos. CARACTERÍTICA ENZIMA CATALIADORE QUÍMICO Especificidade ao substrato Alta Baixa 2 Natureza da estrutura Complexa imples 3 ensibilidade à temperatura Alta Baixa 4 Condições de reação (T, P e ph) uaves Drásticas (geralmente) 5 Custo de obtenção (isolamento e purificação) Alto Moderado 6 Natureza do processo Batelada/contí nuo Batelada/contínuo 7 Consumo de energia Baixo Alto 8 Formação de subprodutos Baixa Alta 9 Reutilização do catalisador imples/cara imples 0 Atividade catalítica (temperatura ambiente) Alta Baixa - Presença de cofatores im Não 2 Energia de ativação Baixa Alta 3 Velocidade de reação Alta Baixa
A característica mais importante das enzimas é a elevada especificidade. Muitas enzimas possuem um grupo limitado de substratos, mas outras possuem uma especificidade absoluta para um único substrato como mostrado na Figura : ubstrato Produtos ítio ativo Enzima Enzima E + E E + P
Como exemplo de especificidade enzimática pode ser tomado a hidrólise enzimática do amido: α-amilase atua na amilose rompendo a ligação α-,4 produzindo maltose e glicose. α-glicosidase atua na α-,6 produzindo amilose. Com a atuação das duas enzimas no amido é produzido maltose e a glicose. Amiloglicosidase ( ou glicoamilase ) atua na α-,6 e α-,4 de forma a produzir também maltose e glicose a partir do amido.
3 NOMENCLATURA nome do substrato ou + sufixo ase reação que catalisa protease (hidrolisa proteínas) álcool desidrogenase (catalisa a desidrogenação de um álcool) outras apresentam terminações ina (tripsina, renina, bromelina etc)
4 COMPLEXO ENZIMA UBTRATO E + E E + P Cinética da reação enzimática com formação de um substrato Medindo as concentrações do produto (P) e do substrato () expressos na reação acima, podemos obter a figura seguinte:
[P] Produto e [] ubstrato Tempo
5 INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE ENZIMA [P] [E] [E] 2 [E] >[E] 2 >[E] 3 >[E] 4 [E] 3 [E] 4 Tempo
6 INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DO UBTRATO O modelo cinético de Michaelis e Menten é utilizado para explicar matematicamente a influência da concentração do substrato na cinética da reação enzimática. Essa teoria admite que inicialmente, a enzima e o substrato reagem reversívelmente, formando um composto intermediário denominado complexo enzima-substrato que por sua vez decompõe ou regenera a enzima e forma os produto da reação. k E + E k2 k3 E E + P V onde k = constante de velocidade de formação do complexo k2 = constante de velocidade de dissociação do complexo k3 = constante de velocidade de decomposição do complexo formando os produtos da reação V = velocidade de formação dos produtos
Consideremos um caso simples, caracterizado pelas seguintes hipóteses: a) Complexo E (mol de enzima para mol de substrato) b) O complexo formado se decompõe, sem reagir com outras substâncias existentes no sistema c) Fazendo X = E logo a variação da concentração de X com o tempo (dx/dt) será: dx/dt = k.e. k 2 X k 3 X eq. 0 fazendo Et = E + X logo E = Et X fazendo t = + X logo = t X onde t = quantidade de substrato total adicionada ao sistema = quantidade de substrato não associada ao complexo E Et = quantidade de enzima total adicionada ao sistema E = quantidade de enzima não associada ao complexo E
ubstituindo os valores de En e de n na eq. 0 vem: dx = k ( Et X)( t X) k2x k3x dt eq. 02 supondo que as concentrações de substrato são muito maiores que as de enzima e portanto muito maiores que as do complexo, o que é comum na prática E<<>>E Então pela eq. 02 vem: dx eq. 03 dt = k ( Et X) t ( k2 + k3) X
upondo, ainda que boa parte da reação se desenvolve mantendo-se constante a concentração do complexo no tempo (estado estacionário) ou seja dx/dt = 0 k t ( Et X ) = ( k2 k3) X + X = k t ( E t k2 + k3 X) k X = t ( E t X) ( k2 + k3 ) / k = t E t t X k m
k2 + k3 onde km = = constante de Michaelis e k Menten que pode indicar o grau de afinidade da enzima pelo substrato, ou seja, quanto maior a afinidade da enzima pelo substrato menor é o valor de km isolando X t X X + = k m t E t k m + t X = km t E t km X = tet km. + t km X = tet km. km + t km t E X = t. k m k m k m t ( + ) X = t E t km + t
fazendo t = e Et = E vem, X k m E = eq. 04 + abendo que a velocidade da reação enzimática é V = K 3 X eq. 05 ubstituindo a eq. 04 na eq. 05 vem, V k E = 3 km + Fazendo K 3 E = Vmax = Velocidade máxima de formação de produtos correspondente a situação em que toda enzima se encontra na forma E vem: V = V max k m + eq. 06 Esta equação é chamada equação de Michaelis e Menten.
V = Vmax km + Vmax (2) (3) Vmax/2 () k m Na região () do gráfico a velocidade da reação é uma função crescente da concentração do substrato, até um determinado valor desta concentração (ponto 2) que a partir do qual a velocidade se mantém constante (região 3). O tipo desta curva é análogo aos fenômenos de saturação que pode ser melhor compreendido analisando o próximo gráfico.
ituação antes do Equilíbrio ituação no Equilíbrio % da V max E E + E 25% 50% 75% 00% 00%
Quando a concentração do substrato é tal que a velocidade de reação é metade da velocidade máxima teremos: 2 = K [] [] m + K m2 > K m portanto a afinidade da enzima pelo substrato é maior que a da enzima2 Km + [] = 2[] Km = [] Como se sabe o valor de K m é inversamente proporcional a afinidade da enzima pelo substrato. Desta forma podemos comparar a afinidade da Enzima com a da Enzima2 no gráfico: Vmax Vmax/2 Km Km2 Enzima Enzima2
Uma forma precisa de determinar V max e k m a partir de dados experimentais é o método chamado Lineweaver-Burk, resultado da inversão da equação 4 de Michaelis e Menten. k m = +. eq. 07 V Vmax Vmax
que trata-se da equação de uma reta representada pela figura a seguir. /v km/vmáx /v MAX /
ATIVIDADE ENZIMÁTICA A velocidade da reação pode também ser expressa em termos de sua atividade enzimática, que é a quantidade de produto formado em um certo tempo pela quantidade de enzima utilizada. A atividade de uma enzima é definida especificamente para cada caso estudado. A CONTANTE CATALÍTICA é definida para se estudar a eficiência da catálise enzimática. k cat = V [E] max
k cat equivale ao número máximo de moléculas de substrato que um centro ativo converte em produto por segundo. Como exemplo, podemos tomar a enzima catalase com k cat = 07 s -, portanto esta enzima é capaz de originar 0 000 000 moléculas de produto por segundo.
7 INFLUÊNCIA DA PREENÇA DE UM INIBIDOR A inibição enzimática pode ser reversível ou irreversível O inibidor irreversível forma um complexo estável com a enzima não podendo ser removido para recuperar a enzima ativa. Exemplo: metais pesado (Hg), agentes complexantes de metais (CN) A inibição reversível é caracterizada por uma constante de equilíbrio k i, que é medida pela afinidade do inibidor com a enzima. Três formas simples de inibição podem ser descritas: Pelo substrato (reversível) Competitiva (reversível) Não competitiva (irreversível)
7. INIBIÇÃO PELO EXCEO DE UBTRATO (reversível) k E + E k 2 k 3 E + E2 (Complexo não reativo) k 4 k 5 E E + P V V Vmax V = eq. 08 Vmax 2 km + + ki onde ki é a constante de inibição; Para encontrar as constantes faz-se a inversão segundo Lineweaver-Burk
V = Vmax + km Vmax. + VmaxKi Eq. 9 ª Hipótese: para valores de <<ki a eq. 09 se reduz em, V = Vmax + k m Vmax. /V K m /v max -/k m /
V = Vmax + km Vmax. + VmaxKi Eq. 9 2ª Hipótese: para valores de >>k m a eq. 09 se reduz em, V = Vmax + VmaxKi /V /v max K i /V max Os valores de V max determinados em ambos os gráficos devem ser próximos.
Diz-se que um inibidor competitivo reage com a enzima como se fosse um outro substrato. Indicando-se com Ι a fórmula molecular de um inibidor competitivo, a teoria de Michaelis e Menten fornece: k k 3 E + E E E + P k 2 V k 4 E + Ι EΙ EΙ E + P k 5 k 6
O complexo EΙ (Enzima-Inibidor) pode ou não formar produto, porém quando o inibidor forma o complexo EΙ fica impedindo que o substrato entre em contato com a enzima E. A velocidade de formação do produto desejado será, então: eq. 0 Vi = Vmax km( + Ι / ki) + onde k m = (k 2 +k 3 )/k = cte de Michaelis e Menten Ι = concentração do Inibidor k i = (k 5 +k 6 )/k 4 Invertendo a equação segundo Lineweaver-Burk
km( + Ι / ki) +. Vi Vmax Vmax = Eq. /V I 2 >I I I=0 /V max -/k m / km( + Ι / k i )
Fazendo a relação entre Velocidade segundo Michaelis e Menten e a Velocidade de inibição competitiva vem; V V i + kmι ( k m + ) K i = Eq.2
Esta relação trata-se de uma representação matemática da influência das concentrações de substrato e de inibidor na inibição competitiva, da seguinte forma: V/V I 2 < >>i Ou seja, com o aumento da concentração de substrato em relação a concentração do inibidor diminui a influência do inibidor na cinética enzimática. I
INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA (irreversível) Consideremos o caso em que o inibidor, presente no sistema na concentração Ι, bloqueia irreversivelmente uma concentração αι de enzima. Teremos então: k k3 E + E E + P k 2 V i k 4 E+Ι EΙ A velocidade de formação do produto desejado será: V i = ( Vmax k3αι) K m + eq. 3 onde Ι = Concentração do inibidor αι = porção de enzima bloqueada irreversivelmente
Invertendo a equação segundo Lineweaver-Burk vem: V i = k + m. Vmax k3αι Vmax k3αι eq. 4 /V i I 2 >I V max k 3 αι I I=0 -/k m /