DEP. IMUNOFISIOLOGIA E FARMACOLOGIA LABORATÓRIO DE FARMACOLOGIA E NEUROBIOLOGIA DISCIPLINA DE FARMACOLOGIA EXCRECÇÃO DA ASPIRINA POR VIA RENAL I - OBJECTIVO Identificação e quantificação dos principais produtos de biotransformação da aspirina, no Homem, após a sua excreção por via renal. II - INFORMAÇÃO TEÓRICA A aspirina (ácido acetilsalicílico, ASA) é o fármaco mais prescrito como analgésico, antipirético, anti-inflamatório e anti-agregante plaquetário. Administrada por via oral é rapidamente absorvida, em parte pelo estômago, e principalmente pela porção proximal do intestino delgado, devido à extensa superfície das vilosidades intestinais. A absorção de salicilatos ocorre por difusão passiva da forma não dissociada do ácido acetilsalicílico (PK a 3,5) ou do ácido salicílico (Pk a 3), através das membranas gastrointestinais. A velocidade de absorção da aspirina depende de vários factores, sendo os mais importantes a sua velocidade de desintegração e dissolução (quando é administrada em comprimidos), o ph da mucosa gastro-intestinal e o tempo de esvaziamento gástrico. Após absorção os salicilatos são distribuídos pela maioria dos tecidos e fluidos transcelulares, principalmente por processos passivos dependentes do ph. Os salicilatos ligam-se extensamente às proteínas plasmáticas (80% a 90%). A aspirina ingerida é principalmente absorvida como tal, mas uma pequena percentagem entra na circulação sistémica como ácido salicílico após hidrólise pelas esterases da mucosa gastrointestinal. O ácido acetilsalicílico uma vez em circulação é rapidamente hidrolisado a ácido salicílico (AS) por acção de esterases presentes no sangue e fígado: após uma única dose são encontradas, no plasma, concentrações apreciáveis de salicilatos em menos
de 30 minutos. O ácido salicílico tem igual acção anti-inflamatória, mas é menos potente como analgésico. A biotransformação do ácido salicílico ocorre em muitos tecidos, mas particularmente no tecido hepático (fracções microssomal e miticôndrial). Os principais metabolitos do ácido salicílico são: o ácido salicilúrico (ácido salicílico conjugado com a glicina) e os glucoronatos do ácido salicílico na forma éter e ester (reacções de Fase II). Adicionalmente uma pequena fracção do ácido salicílico é oxidada a ácido gentísico (ácido 2,5 di-hidroxibenzoico), a ácido 2,3 di-hidroxibenzoico e a ácido 2,3,5 trihidroxibenzoico (reacções de Fase I). (Figura 1). Figura 1. Principais metabolitos da aspirina, no Homem.
Os salicilatos, são excretados principalmente pelo rim, sendo praticamente o total da dose administrada excretada na urina sob a forma dos metabolitos anteriormente citados. A excreção de salicilatos na forma livre é extremamente variável e depende tanto da dose como do ph urinário. VARIAÇÃO DA EXCRECÇÃO DE ÁCIDO SALICÍLICO COM A DOSE O tempo de semi-vida plasmático da aspirina é aproximadamente de 15 minutos. O dos salicilatos é da ordem de 2 a 3 horas quando administrados em doses baixas (600mg/d) e de cerca de 12-16 horas para as doses habituais anti-inflamatórias (>3,6g/d). Este tempo de semi-vida pode ser tão longo como de 15 a 30 horas para altas doses terapêuticas ou quando há intoxicação. Esta eliminação dependente da dose é resultado da capacidade limitada do sistema hepático em conjugar o ácido salicílico com a glicina ou com o ácido glucurónico.(figura2). Figura 2. Efeito da dose no metabolismo da aspirina, no Homem
VARIAÇÃO DA EXCRECÇÂO DE ÁCIDO SALICÍLICO COM O PH URINÁRIO Na urina alcalina, mais de 30% do fármaco ingerido pode ser eliminado como ácido livre, enquanto na urina acídica esse valor pode baixar para os 2%. Estes resultados são devidos ao facto de que a ph alcalino o ácido salicílico se encontra altamente ionizado estando a reabsorção tubular renal diminuída. Devido á sua hidrossolubilidade, os conjugados do ácido salicílico não são facilmente reabsorvidos nos túbulos renais. Adicionalmente, os glucoronatos são excretados por transporte activo a nível do túbulo proximal, não estando portanto, a sua eliminação dependente do ph urinário. III - FUNDAMENTO DO MÉTODO Separação e quantificação da aspirina e dos metabolitos excretados na urina a) Preparação da amostra Antes de proceder à separação e quantificação do ácido acetilsalicílico e dos seus metabolitos serão extraídos da urina a ph ácido. Para tal, a urina será acidificada a ph 3. Desta forma, os salicilatos serão protonados (forma não ionizada) e poderão ser posteriormente extraídos por uma mistura de solventes orgânicos (Acetato de etilo/ Hexano). Procede-se, assim, à eliminação de bastantes compostos da urina (aqueles que não são solúveis na fase orgânica). Em seguida, realiza-se nova extracção com 0,01M de NaH 2 PO 3, ph 7. A aspirina e os seus metabolitos serão agora extraídos para a fase aquosa e seguidamente analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Todas estas operações serão feitas, paralelamente, numa urina obtida antes (urina controlo) e após administração da aspirina (urina tratada).
b) Separação e quantificação dos componentes da amostra urinária por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Intrumentação: O método de separação e quantificação da aspirina e metabolitos excretados na urina é o de cromatografia de alta eficiência (HPLC). Será utilizado um sistema cromatográfico Hitachi composto por uma bomba de gradiente terciário (L-6200, intelligent pump), equipado com uma válvula de injecção manual (Rheodyne 7125) com uma ansa de 20 ul, ligado a um detector UV (L-4000), com comprimento de onda variável, sendo o comprimento de onda seleccionado de 303 nm. A este sistema é acoplado um integrador (D-2500) para registo e tratamento quantitativo dos cromatogramas. Fase Estacionária: Coluna de fase inversa (C18) (12,5cm X 4mm d.i.), constituída por partículas de 5 µm de diâmetro (LiChrospher 100 RP-18, Merck). Fase Móvel: O sistema de eluição isocrático é constituído por uma solução eluente contendo: NaH 2 PO 4, 0,01M, ph=2 acetonitrilo metanol (80:15:5, v/v/v). O fluxo é de 1,25 ml/min. Identificação e quantificação dos componentes da amostra urinária A identificação cromatográfica dos componentes da amostra é efectuada por comparação com o tempo de retenção de padrões de ácido acetilsalicílico (ASA), ácido salicílico (SA), ácido salicilúrico ASU) e gentísico (AG) com elevada pureza (>98%) e separados nas mesmas condições cromatográficas. O método de quantificação utilizado é o método do padrão externo. Para cada componente da mistura que se pretende quantificar é elaborada uma curva de calibração (gráfico da concentração em função da área do pico) que deve possuir um declive constante (linear) dentro do intervalo de concentrações para cada composto a analisar e a intercepção do eixo das ordenadas deve ser zero ou próximo de zero.
IV - PROTOCOLO EXPERIMENTAL Antes da aula, deverão ser obtidas duas amostras de urina provenientes do mesmo indivíduo: Urina controlo: - Colhida antes da administração PO de 1g de aspirina dissolvida em 300 ml de água. Urina tratada: - Colhida duas horas após a ingestão da aspirina. 1 Extracção com acetato de etilo / hexano 1.1 Coloque a urina controlo e tratada em provetas diferentes (marque nas respectivas provetas C e T). 1.2 Meça o volume. 1.3 Baixe o ph das soluções C e T com H 3 PO 4 até ph 3 (Para isso, vá deitando com uma pipeta Pasteur o ácido até ao ph desejado, utilizando uma fita indicadora de ph). 1.4 Retire para tubos de centrifuga eppendorf (C e T) 500 µl da urina controlo e tratada, respectivamente. 1.5 Adicione, a cada amostra obtida na alínea anterior, 500 µl de uma mistura de acetato de etilo e hexano (V/V). 1.6 Agite no vortex durante 1 minuto. 1.7 Centrifugue durante 45 segundos NOTA Fase superior - acetato de etilo / hexano Fase inferior - urina 1.8 Retire a fase orgânica para novos tubos eppendorf (C e T). 1.9 Adicione a cada tubo eppendorf 500 µl de uma solução 0,01M de NaH 2 PO4 ph=7. 1.10 Agite no vortex durante 1 minuto. 1.11 Centrifugue durante 45 segundos 1.12 Rejeite a fase superior. 1.13 Injecte, no HPLC, 20 µl da fase aquosa.
V BIBLIOGRAFIA Furst D. and Ulrich R. (2007).Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs,Disease-Modifying antirheumatic Drugs, Nonopiod Analgesics, & Drugs Used in Gout.(2007) In: Katzung B (eds). Basic and Clinical Pharmacology, 10 th ed. Ed. McGraw Hill. Analgésic-antipyretic agents; pharmacotherapy of gout- Burke A, Smyth E and FitzGeralg G (2006).In: Brunton LL, Lazo JS and Parker KL (eds). Goodman & Gillman s, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11 th ed. Ed. McGraw Hill.