10 PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS PUC Goiás ESCOLA DE ENGENHARIA CURSO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS Aula nº 2- Preparações Microscópicas: Preparações a Fresco Introdução O olho humano é incapaz de perceber um objeto com um diâmetro menor do que 0,1mm a uma distância de 25cm. Como os microrganismos são menores que 0,1 mm, eles só puderam ser observados a partir da descoberta do microscópio. Os microscópios são classificados em ópticos e eletrônicos, dependendo do princípio no qual a ampliação é baseada. O microscópio eletrônico emprega um feixe de elétrons para produzir uma imagem ampliada. O microscópio óptico comumente usado é o composto, assim chamado porque apresenta dois sistemas de lentes, através dos quais a imagem ampliada é obtida. O sistema de lentes próximo ao olho do observador é chamado ocular, e aquele que fica montado no fim do tubo do microscópio é chamada objetiva (figura 1). A ampliação total do microscópio é o produto das ampliações por cada sistema de lentes individualmente. Em geral o microscópio óptico amplia o objeto até certo limite (1000 a 2000 vezes). Tal limitação é devido ao poder de resolução do sistema óptico que é numericamente a menor distância com a qual dois pontos podem ser vistos separadamente, ou seja formação de imagens distintas e nítidas de dois pontos situados muito próximos em uma preparação. Os termos resolução e ampliação podem ser distinguidos: resolução é a formação de uma imagem distinta e ampliação é a produção de uma imagem aumentada a qual pode ou não ser distinta. Figura 1- Microscópio óptico e suas partes Fonte: estudomicroscopio.blogspot.com
11 De acordo com a figura observa-se: 9- Pé ou Base: é a base do aparelho que suporta todas as outras partes; 5- Braço ou coluna: preso ao pé, suporta o tubo ou canhão (2), a platina ou mesa (6), o condensador (7) e a fonte luminosa (8); 2- Canhão: é o tubo onde se dispõem as partes ópticas de ampliação. Pode ser fixo ao braço (5) ou possuir movimento vertical; 3- Revólver ou tambor: é uma peça giratória onde se conectam as objetivas e que permite a mudança das mesmas; 6- Platina ou mesa: é o local onde se coloca a lâmina para ser observada. Possui uma abertura central que dá passagem a luz proveniente da fonte luminosa.; 12- Charriot: é um dispositivo preso à platina, dotado de movimento anteroposterior e lateral, destinado a movimentar a preparação; 10- Parafuso macrométrico: é um dispositivo destinado a dar grandes e rápidos deslocamentos verticais ao canhão ou à platina; serve para focalização grosseira; 11- Parafuso micrométrico: é um dispositivo destinado a dar pequenos e lentos deslocamentos verticais ao canhão ou à platina; serve para focalização fina; 7- Condensador com diafragma: o condensador é uma peça destinada a convergir a luz da fonte luminosa para o campo a ser observado, possuindo movimento vertical ao passo que o diafragma controla a intensidade luminosa no campo focado; 1- Lentes oculares: ficam próximos aos olhos, podendo aumentar de 10 a 20 vezes; 4- Lentes objetivas: lentes que ficam próximas ao objeto a ser observado. Apresentam aumentos de 4, 10, 40 e 100 vezes o aumento. O aumento total, dado pelo microscópio óptico, é o aumento da ocular multiplicado pelo aumento da objetiva. Para que o material seja observado, ele deve inicialmente passar por um processo de preparação. As preparações microscópicas permitem a obtenção de materiais em melhores condições para ser observado ao microscópio. Duas técnicas gerais são empregadas para o preparo adequado do material a ser observado. Uma técnica utiliza suspensão de microrganismos em meio líquido (preparações a fresco) e a outra utiliza esfregaços secos, fixados e o uso de corantes apropriados (preparações fixadas e coradas). A escolha do método de preparação depende do objetivo da observação. No caso de se observar a motilidade, alterações que ocorrem durante a divisão celular, utiliza-se as preparações a fresco, que mantém os microrganismos vivos, porém, se deseja observar estruturas como esporos bacterianos, características tintoriais (Gram), emprega-se a preparação fixada e corada.
12 II- Preparações à Fresco Estas preparações permitem o exame dos organismos na sua condição natural, suspenso em meio líquido, e não alteram o material sob observação, pois as células são conservadas vivas o mais próximo do seu meio natural. São preparadas, por exemplo, colocando-se uma gota do líquido que contém os microrganismos sobre uma lâmina e cobri-la com lamínula. As preparações a fresco são recomendadas para observação da motilidade bacteriana, morfologia de bactérias espiraladas que é distorcida em preparações fixadas, das alterações que ocorrem durante a divisão celular e de alguns corpúsculos de inclusão. Geralmente, as preparações a fresco não permitem inspeções prolongadas, pois há o inconveniente da evaporação do líquido de suspensão. Quando preparações a fresco são examinadas ao microscópio é extremamente importante ajustar a intensidade luminosa adequada, controlando-se a abertura do diafragma e altura do condensador (fecha-se o diafragma e abaixa o condensador). 1.Tipos de Preparações à Fresco A Sem Coloração 1. Entre lâmina e lamínula: é colocada uma gota da cultura do microrganismo na lâmina e em seguida cobrir com a lamínula. Para proteger a preparação contra a evaporação (aquecimento da fonte luminosa) bem como o deslocamento dos microrganismos por corrente de ar e compressão, usa-se como recurso o emprego de vaselina ou parafina fundida em todo o contorno das bordas da lamínula. 2. Gota pendente: utiliza-se lâminas escavadas. Retira-se com a alça de inoculação, uma gota da cultura de microrganismo e deposita-a sobre a lamínula. Inverter, rapidamente e com cuidado a lamínula, de modo a não espalhar a gota, sobre a lâmina escavada que deverá estar previamente com vaselina aplicada nas bordas. Este método é utilizado para observar motilidade.
13 www.perfectalab.com.br 3. Câmara úmida ou cultura em lâmina: serve para cultivo de microrganismos em meio sólido, permitindo acompanhar o seu desenvolvimento ao microscópio. Possibilita uma preparação e observação sem perturbar o crescimento do microrganismo, mantendo intactas a estrutura e a disposição das partes, como no caso dos bolores (fungos filamentosos). Cilindro com o meio de cultura sólido B Com Coloração Como a maioria das células microbianas são incolores, à exceção daquelas que possuem pigmentos, a utilização em microbiologia de corantes para tingir a célula com uma certa coloração, permitiu a visualização de detalhes quanto a arranjo, forma, estruturas, etc. Em preparações a fresco geralmente são utilizados corantes vitais, que não comprometem a vitalidade das células, sendo destituídos de ação tóxica. Corantes são substâncias orgânicas possuidoras de grupamentos cromóforos que podem conferir aos corpos celulares uma dada pigmentação. Os corantes são classificados em três grupos, de acordo com a carga do íon da porção corante da molécula. Assim, são corantes ácidos os que têm carga negativa; básicos os que têm cargas positivas, e neutros os que são portanto, eletricamente neutros. Em bacteriologia, os corantes básicos são os mais empregados, devido à presença de cargas elétricas negativas ao longo do corpo celular, o que demonstra a afinidade da célula por este tipo de corante. Corantes neutros também podem ser utilizados.os corantes básicos mais comuns são cristal violeta, azul de metileno e safranina, que devem ser extremamente diluídos para evitar ação sob a célula. A introdução de colorações no estudo dos microrganismos, veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia, por quatro razões principais:
14 - Permitem uma visualização melhor das células, já que nas preparações sem corantes são revelados apenas o contorno e a conformação dos arranjos; - Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares; - Podem levar a diferenciação entre os grupos de microrganismos; - Podem, eventualmente, identificar alguns grupos. Quanto aos tipos de coloração tem-se: Coloração simples, Coloração diferencial e Coloração especial, as quais serão vistas no próximo assunto. III Procedimentos Experimentais De acordo com a explicação do professor, prepare três tipos de lâminas (preparação entre lâmina e lamínula), sendo uma lâmina para bactérias, outra para bolor (fungo filamentoso) e outra para a levedura (fungo unicelular). Neste último caso será usado o corante azul de metileno. Observe como ficou as cores das células e procure saber o porquê.