Código: MET/LACQSA/BH/003 - V.4 Fase: Vigente Aprovado em: 04/06/2018

1.0 Objetivos e alcance O MET/LACQSA/BH/003 objetiva descrever os procedimentos analíticos a serem seguidos na determinação de AFB 1 e OTA, em fígado de aves e suíno, e AFBG e OTA, em amêndoa de cacau, e no registro dos dados relacionados às análises, para que estes possam ser corretamente seguidos. 1.1 Abreviações As abreviações relativas às micotoxinas são conforme DS/LACQSA/BH/024. CLAE = cromatografia líquida de alta CV = DPR = desvio padrão relativo FL = fluorescência IAC = coluna de imunoafinidade LMP = Limite máximo permitido LD = limite de detecção LQ = limite de quantificação MC = material crítico NQ = não quantificável p.a. = para análise p.a.r. = para análise de resíduos PBS = solução tampão fosfato salina 0,1% R = recuperação t R = tempo de retenção r 2 = coeficiente de correlação TP = solução trabalho pool U = incerteza expandida UHPLC = ultra high performance liquid chromatography 2.0 Fundamentos Esta metodologia fundamenta-se na extração de AFB 1 e OTA (para a matriz fígado) e AFBG e OTA (para a matriz amêndoa de cacau), com solução de metanol: água (80:20, v/v), cloreto de sódio e bicarbonato de sódio, Impresso por: Cópia não controlada Página 1/35

filtração do extrato e diluição com PBS seguido de purificação por coluna de imunoafinidade contendo anticorpos específicos para AFBG e OTA e separação, detecção e quantificação por CLAE/fluorescência. AFB 1 e AFG 1 são derivatizadas em reação pós-coluna utilizando solução de tribrometo de piridínio ou utilizando célula elotroqúimica (Kobra-cell). A reação resultante utilizando célula eletroquímica permite que as aflatoxinas B 1, B 2, G 1 e G 2 ; possam ser derivatizadas in situ em seu derivado bromado, o que resulta em aumento da fluorescência e consequente aumento da sensibilidade 2.1 Características do método Este método foi desenvolvido, validado e otimizado pelo LAQCSA, conforme procedimento descrito no plano de estudo PE 074 e seu respectivo relatório de validação. Os parâmetros de desempenho do método obtidos no processo de validação encontram-se na Tabela 1. A transferência de metodologia de quantificação de CLAE para UHPLC foi validada segundo PE/LACQSA/BH/009 cujos resultados encontram-se no RE/VAL/LACQSA/BH/002. O método sofreu uma ampliação de escopo para incorporar a matriz amêndoa de cacau e contemplar os analitos aflatoxinas B 2, G 1 e G 2. Tal procedimento foi realizado de acordo com o PE/LACQSA/BH/017 v.2 e os resultados da validação estão registrados no REL/VAL/LACQSA/004 v.2. A Tabela 2 apresenta os parâmetros de desempenho dessa ampliação de escopo. Tabela 1: Parâmetros de desempenho do método obtidos no processo de validação da análise de AFB 1 e OTA em fígado suíno e de aves. Parâmetros de Desempenho Critérios Valor determinado Aprovação Seletividade/ Efeito matriz Ausência de interferentes no tempo de retenção de AFB 1 e OTA uso de IAC Ausência de interferentes no tempo de retenção Recuperação (%) Segundo DE/LACQSA/BH/029: Concentração 1 µg/kg - 50 % a 120% Concentração de 1 µg/kg a10 µg/kg - 70 % a 110% AFB 1-97, 87 e 93% OTA - 86, 81, e 85% Repetitividade Concentração 1 µg/kg - 23,3% 1 µg/kg (ppb) < Concentração < 10 µg/kg- 20% CV AFB 1 1 a 8% CV OTA 3 a 14% Precisão Intermediária Concentração 1 µg/kg 35% 1 µg/kg (ppb) < Concentração < 10 µg/kg- 30% CV AFB 1 10 a 14% CV OTA 6 a 15% Impresso por: Cópia não controlada Página 2/35

Parâmetros de Desempenho LD (µg/kg) LQ (µg/kg) Limite de decisão (CCα) Capacidade Detecção (CCβ) Incerteza de medição (k=2) Robustez Faixa de Trabalho Faixa da curva de calibração Critérios Valor determinado Aprovação - LD = 0,25 µg/kg Concentração 1 µg/kg - 50 % a 120% Concentração de 1 µg/kg a10 µg/kg - 70 % a 110% Foram utilizados controles artificialmente contaminados Estima-se como LMP 0,50 µg/kg AFB 1 0,50 µg/kg OTA 0,50 µg/kg Estima-se como LMP 0,50 (µg/kg) AFB 1 0,50 µg/kg OTA 0,50 µg/kg 0,50 ± 0,20 µg/kg CV repetibilidade. AFB 1 5,33% CV repetibilidade. OTA 14% CV precisão intermediária AFB 1 14% CV precisão intermediária OTA 15% Recuperação AFB 1 = 82 a 112% Recuperação OTA = 78 a 91% AFB 1 0,62µg/kg OTA 0,65 µg/kg AFB 1 0,75 µg/kg OTA 0,71 µg/kg - 0,50 ± 0,20 µg/kg (~30%) Avaliação do tempo de estabilidade da solução derivatizante pyridinium hidrobromide perbromide e Pyiridinium Tribromide Avaliação do comportamento da AFB 1 e OTA com relação à temperatura do forno da coluna Avaliação do uso de diferentes derivatizantes derivatizante pyridinium hidrobromide perbromide e Pyiridínium Tribromide Avaliação da mudança no método de detecção e quantificação Amostra que exceda uma concentração maior que a faixa da curva deverá ser diluída de forma que a concentração esteja dentro da faixa de trabalho. Faixa da validação 0,5 a 1,5 µg/kg r 2 > 0,95 - após ~ 26 h de análise Confirmação pelo teste F(95%) Confirmação pelo teste F(95%) Recuperação (%) e RSD (%) Concentração entre 0,00200 a 0,00020 µg/ml de AFB 1 e OTA Correspondente a ~3,2 a 0,32 µg/kg de AFB 1 e OTA na amostra Impresso por: Cópia não controlada Página 3/35

Tabela 2: Parâmetros de desempenho do método obtidos no processo de validação da análise de aflatoxinas B 1, B 2, G 1 e G 2 e ocratoxina A em amêndoa de cacau e fígado suíno e de aves. Parâmetros de Desempenho Critério Valor determinado Aprovação Repetibilidade Equação de Horwitz RSD Horwitz = 2 (1-0,5.log C) c = C µg/kg x 10-9 (Critérios de aceitabilidade segundo DE/LACQSA/BH/029) Aflatoxinas: Concentração 1µg/kg CV 30% 1µg/kg concentração 10µg/kg CV 24% Concentração> 10µg/kg CV 21% OTA: Concentração 1µg/kg CV 40% Concentração 1µg/kg CV 20% AFB 1 = 0,49% CV 7,66% AFB 2 = 0,21% CV 16% AFG 1 = 0,50% CV 9,79% AFG 2 = 0,21% CV 14,99% AFBG = 0,21% CV 8,26% OTA = 0,11% CV 16,62% Precisão intermediária (Critérios de aceitabilidade segundo DE/LACQSA/BH/029) Aflatoxinas: concentração 1µg/kg CV 45% 1µg/kg concentração 10µg/kg CV 36% Concentração > 10µg/kg CV 32% OTA: Concentração 1µg/kg CV 60% Concentração 1µg/kg CV 30% AFB 1 = 7,36% CV 11,53% AFB 2 = 5,88% CV 13,93% AFG 1 = 8,76% CV 13,16% AFG 2 = 12,73% CV 18,54% AFBG = 7,96% CV 11,34% OTA = 4,40% CV 17,63% Veracidade Ensaios de recuperação (critérios segundo DE/LACQSA/BH/029) Aflatoxinas: Concentração < 1 µg/kg 50 a 120% 1µg/kg Concentração 10µg/kg 70 a 110 % e Concentração >10 µg/kg 80 a 110 OTA: Concentração 1µg/kg 50 a 120% Concenração 1µg/kg 70 a 110% LD (µg/kg) - AFB 1 = 67% - 99% AFB 2 = 65% - 106% AFG 1 = 70% - 108% AFG 2 = 52% 103% AFBG = 68% - 99% OTA = 59% - 108% AFB 1 = 0,25 µg/kg AFB 2 = 0,050 µg/kg AFG 1 = 0,25 µg/kg AFG 2 = 0,050 µg/kg AFBG = 0,60 µg/kg OTA = 0,25 µg/kg LQ e sua incerteza com - AFB 1 = 0,50 ± 0,20 µg/kg Impresso por: Cópia não controlada Página 4/35

95% de confiança e k=2 AFB 2 = 0,100 ± 0,067 µg/kg AFG 1 = 0,50 ± 0,21 µg/kg AFG 2 = 0,100 ± 0,067 µg/kg AFBG = 1,20 ± 0,31 µg/kg OTA = 0,50 ± 0,20 µg/kg Parâmetros de Desempenho Seletividade / especificidade Faixa da curva de calibração Limite de Decisão (CCα) Capacidade de Detecção (CCβ) Critérios Valor determinado Aprovação - - - Ausência de interferente no t R de OTA e das AFBG - uso IAC AFB 1 = 0,14 25,42 µg/kg AFB 2 = 0,03 8,86 µg/kg AFG 1 = 0,14 24,47 µg/kg AFG 2 = 0,03 8,90 µg/kg OTA = 0,56 47,27 µg/kg AFB 1 = 0,55 AFB 2 = 0,13 AFG 1 = 0,56 AFG 2 = 0,14 AFBG = 1,38 OTA = 0,64 AFB 1 = 0,61 AFB 2 = 0,16 AFG 1 = 0,62 AFG 2 = 0,17 AFBG = 1,55 OTA = 0,77 2.2 Aplicabilidade O método validado utilizando CLAE/FL é aplicável à determinação de AFB 1 e OTA para os grupos de matrizes descritos no DS/LACQSA/BH/004. 3.0 Reagentes, padrões, materiais e insumos Vidrarias e outros materiais de uso na rotina necessário à análise deverão ser solicitados à Unidade de Preparo de Material pelo preenchimento do formulário FOR/LACQSA/BH/025. Quando for identificada a necessidade da aquisição de materiais indisponíveis em estoque, seguir procedimentos descritos na IS/LACQSA/BH/005. 3.1 Vidraria em geral Nota 1: As vidrarias identificadas como MC deverão ser calibradas e/ou terem desempenho satisfatório na verificação de desempenho segundo procedimento específico do LACQSA. Impresso por: Cópia não controlada Página 5/35

- aparato para filtração a vácuo com reservatório de 300 ml e base do funil de 47 mm com rolha para conexão ao kitasato; - balões volumétricos âmbar ou provetas graduadas de 100 ml; - balões volumétricos de 1000 e 2000 ml; - béqueres de 100 e 600 ml ou equivalentes; - erlenmeyer, com tampa, capacidade de 125 ou 250 ml; - frasco de vidro borossilicato, para padrão, transparente, reutilizável, com fundo duplo, fundo interno cônico capacidade de 5, 10 e 20 ml ou; - frasco para padrão, de vidro silanizado, âmbar com tampa sólida de rosca revestida com PTFE capacidade de 2, 4, 7, 15 e 30 ml; - frascos de vidro borossilicato, âmbar ou transparente, capacidade de 1000, 2000 e 4000 ml, com tampas, para armazenamento das fases móveis dos cromatógrafos; - frascos de vidro com capacidade para aproximadamente 1 L, tipo Mason ou equivalente; - funil de haste curta com 07 cm de diâmetro; - kitasatos de 300 ou 500 e 1000 ml ou equivalente; - pipetas de Pasteur; - pipetas volumétrica de 10 ml, com erro máximo permitido de ± 0,02 (MC); - provetas graduadas de 10 ml; - provetas graduadas de 100 ml; - provetas graduadas de 250 ml (MC); - provetas graduadas de 1000 ml; - provetas graduadas de 500 ml; - seringas de polipropileno de 60 ml ou reservatório, tipo luer ou equivalente; - seringas de vidro de 10 ml, tipo luer ou equivalente; - tubos de ensaio de 5-10 ml ou tubo de vidro, 5 ml, 12 x 75mm. Impresso por: Cópia não controlada Página 6/35

3.2 Colunas e unidades filtrantes - colunas de imunoafinidade tipo AflaOchra ou equivalente (MC). - filtro descartável para seringa com membrana PTFE hifrofóbica, com tamanho de poro de 0,2 micrometro (MC); - membrana de fibra de vidro com 55 mm de diâmetro, 1 µm, tipo Whatman GF/B ou equivalente (MC) - membrana filtrante HA em éster de celulose, de 0,45 µm de poro, 47 mm de diâmetro, branca, lisa, para filtração de água; - membrana filtrante de poliamida; Porosidade: 0,45 µm de poro, 47 mm de diâmetro, branca, lisa para filtração de solventes orgânicos; - papel de filtro qualitativo pregueado com 24 cm de diâmetro, ou equivalente, para filtração rápida. 3.3 Padrões e materiais de referência - materiais de referência certificados (MRC) e padrões analíticos de AFB 1, AFB 2, AFG 1, AFG 2 e OTA (MC). 3.4 Materiais de suporte - adaptadores para tubos de 1, 3 e 6 ml, tipo Bond elut, Varian ou equivalente; - barra magnética; - bastão, em vidro borossilicato; - bulbos conta-gotas; - cuba para recolher materiais limpos e utilizados; - dispensete (dispensador); - dispositivo para medição de aproximadamente 5 g de cloreto de sódio - espátulas; - gás nitrogênio, industrial ou ar comprimido seco; - garra com 3 hastes; - garra para conexão das partes do aparato de filtração; - grades para tubos; - hélice de aço inoxidável; Impresso por: Cópia não controlada Página 7/35

- papel toalha ou guardanapo; - parafilme; - pêra de borracha ou pipetador automático ou equivalente; - papel alumínio; - pissetas; - ponteiras para micropipetas automáticas para as faixas de volumes de 20 a 100, 50 a 250, 100 a 1000 e 200 a 1000, 500 a 5000, 500 a 2500 e 1000 a 10000 µl; - torneiras de polipropileno ou teflon, tipo bond-elut, Varian ou equivalente. 3.5 Material para quantificação 3.5.1 Material para quantificação por CLAE - coluna C18, 250 x 4,6 mm, partículas de 5 µm, Shimadzu que apresente perfil cromatográfico característico para o sinal de OTA, AFB 1, AFB 2, AFG 1 e AFG 2, previsto neste método (MC); - frascos para injetor automático para cromatógrafo líquido de 1 ou 2 ml com tampa snap-cap ou equivalente; - pré-coluna de C18 com partículas de 5 µm ou equivalente, compatível com a coluna (MC); - membrana eletroquímica (kobra cell) para derivatização pós-coluna das aflatoxinas B 1 (MC). 3.5.2 Material para quantificação por UHPLC - coluna C18, 150 x 2 mm, partículas de 2,2 µm, Shimadzu que apresente perfil cromatográfico característico para o sinal de OTA, AFB 1, AFB 2, AFG 1 e AFG 2, previsto neste método (MC); - frascos para injetor automático para cromatógrafo líquido de 1 ou 2 ml com tampa snap-cap ou equivalente; - pré-coluna de C18 com partículas de 4,6 µm ou equivalente, compatível com a coluna (MC); - membrana eletroquímica (kobra cell) para derivatização pós-coluna das aflatoxinas B 1 (MC). 3.6 Reagentes, solventes e soluções 3.6.1 Reagentes e solventes Impresso por: Cópia não controlada Página 8/35

- acetonitrila; - ácido acético; - ácido nítrico 4 M; - água tipo I é recomendada (em caso da não disponibilidade de água tipo I, usar tipo II ou água deionizada filtrada em membrana de 0,45 m); - bicarbonato de sódio; - cloreto de potássio; - cloreto de sódio; - diiidrogenofosfato de potássio; - hidrogenofosfato dissódico anidro; - tribrometo de piridínio (MC); - metanol (MC); - metanol; - tolueno; - tween 20. 3.6.2 Soluções - água deionizada: ácido acético (29:1, v/v), filtrada em membrana de 0,45 m. - solução tampão PBS; - soluções padrão trabalho de AFB 1 /OTA em tolueno: ácido acético (99:1, v/v) (MC); - soluções padrão trabalho de AFBG em tolueno: acetonitrila (9:1, v/v) (MC); - soluções padrão trabalho de OTA em tolueno: ácido acético (99:1, v/v) (MC); - metanol: água (2:3, v/v). - solução padrão estoque de AFB 1 (MC); - solução padrão estoque de AFB 2 (MC); - solução padrão estoque de AFG 1 (MC); Impresso por: Cópia não controlada Página 9/35

- solução padrão estoque de AFG 2 (MC); - solução padrão estoque de OTA (MC); - solução tampão PBS tween 0,01%; - tolueno: acetonitrila (9:1, v/v); - tolueno: ácido acético (99:1, v/v); - água: ácido acético (29:1, v/v) - ácido nítrico 4 M 3.6.3 Soluções para cromatografia líquida - metanol: acetonitrila: ácido acético 1% (22:22:56 v/v/v); - metanol: acetonitrila: ácido acético 1% (30:30:40 v/v/v); - metanol: acetonitrila: água: ácido acético (35:35:29:1 v/v/v/v); - solução padrão de AFB 1 e OTA para curva de calibração em metanol: água (3:1 v/v); - solução padrão de AFBG para curva de calibração em metanol: água (2:3 v/v); - solução padrão de OTA para curva de calibração em metanol: acetonitrila: água: ácido acético (35:35:29:1, v/v/v/v); - solução de tribrometo de piridínio 50 mg/ml; - água: acetonitrila: metanol (6:2:2, v/v/v) + KBr + ácido nítrico 4M 4.0 Equipamentos Utilizar os equipamentos conforme os procedimentos descritos nas suas respectivas instruções de trabalho (IT), na PLN/LACQSA/BH/001, no DS/LACQSA/BH/003 e no POP/LACQSA/BH/002, considerando a adequação dos instrumentos aos requisitos e especificações necessárias à adequada execução deste MET. 4.1 Equipamentos críticos - cromatógrafo líquido de alta com detector de fluorescência; - cromatógrafo líquido de ultra alta com detector de fluorescência; Impresso por: Cópia não controlada Página 10/35

- balança de 4 casas decimais, com resolução 0,0001g, calibrada; - balança de 2 casas decimais, com resolução 0,01g, calibrada; - micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 100 a 1000µL ou 200 a 1000µL, com menor divisão de escala de 2 µl ou menor; - micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 50 a 250µL ou 20 a 100µL ou 10 a 100µL ou 20 a 200µL com menor divisão de escala de 0,2 µl ou menor; - micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 500 a 2500µL com menor divisão de escala de 2 µl; - micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 500 a 5000µL com menor divisão de escala de 2 µl; - micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 1000 a 10000µL com menor divisão de escala de 20 µl ou menor; - célula eletroquímica Kobra Cell para derivatização pós-coluna; - termômetro ou termopar calibrados; - sistema de purificação com controle individual de vácuo, com capacidade de manter um fluxo de 2 ml/min. 4.2 Equipamentos de suporte - agitador de tubos; - agitador magnético; - aparelho de ultrassom; - banho de aquecimento com agitação com controle da temperatura 40 C ±10%; - capelas de exaustão; - cronômetro temporizador digital; - homogeneizador de amostras com capacidade de atingir 800 rpm; - freezer capacidade de atingir temperaturas -15 C; - geladeira capacidade de atingir temperaturas de 2 a 8 C; Impresso por: Cópia não controlada Página 11/35

- sistema de filtração a vácuo. 5.0 Precauções analíticas As aflatoxinas possuem efeitos hepatogênicos, teratogênicos e mutagênicos. A ocratoxina A é hepatóxica, imunossupressora, teratogênica, nefratóxica e nefrocarcinogênica (Kőszegi & Poór, 2016; IARC, 1993). Padrões de aflatoxinas e ocratoxina A, sólidos e suas respectivas soluções, devem ser manipulados como substâncias tóxicas. Os padrões sólidos devem ser manipulados com extremo cuidado, devido à sua natureza eletrostática e à sua tendência de se dispersar no ambiente. Para os procedimentos relacionados às condições ambientais e segurança, consultar o POP/LACQSA/BH/003. Todo o procedimento analítico deve ser realizado em local apropriado, com precauções particulares como utilização de equipamentos de proteção individual (luvas, guarda-pó, máscara, sempre que necessário, e sapatos fechados), evitando qualquer contato de padrões com a pele e/ou os olhos. Em caso de contato com a pele, lavar com solução de hipoclorito de sódio 1%, sabão e água em abundância e procurar assistência médica. Utilizar vidraria limpa, livre de detergente e resíduos e descontaminar o material utilizado ao final da análise, conforme o IP/LACQSA/BH/001. Toda vidraria utilizada para acondicionamento/armazenamento dos extratos finais das amostras, assim como das soluções padrões, incluindo vials novos utilizados nos cromatógrafos, deve ser tratada com ácido sulfúrico 2mol/L, de acordo com os procedimentos descritos na IP/LACQSA/BH/001. Os frascos utilizados para armazenamento de padrões e suas respectivas soluções devem ser âmbares ou envoltos em papel alumínio para proteção contra a luz. Em casos de derrames acidentais de soluções padrões, descontaminar a área com solução de hipoclorito de sódio a 1%, deixar em contato por 5 minutos e adicionar solução de acetona a 5%. Resíduos de soluções padrões a serem descartados devem ser descontaminados com solução de hipoclorito de sódio a 1%. Após contato de 2 horas, adicionar quantidade de acetona correspondente a 5% do volume. Após contato de 30 minutos, enxaguar completamente em água corrente e deionizada. Impresso por: Cópia não controlada Página 12/35

A manipulação de solventes e/ou reagentes, bem como de resíduos, das análises deve ser realizada com cuidado, considerando a natureza de cada um, a ficha de informação de segurança de produtos químicos (FISPQ) e o POP/LACQSA/BH/004. A instalação de colunas cromatográficas deve ser feita utilizando um fluxo de 0,01 ml/min da fase móvel, para evitar a entrada de bolhas de ar nos detectores. Observa-se a saída de bolhas na saída da coluna e somente ao cessar a saída das bolhas e que a coluna pode ser conectada ao detector. Visando aumentar a vida útil das colunas cromatográficas de fase reversa (C 18 ), pode-se usar pré-colunas de C 18. Ao término das análises, lavar e armazenar a coluna em solventes orgânicos como metanol ou acetonitrila. Quando se observar anomalias referentes à simetria do sinal cromatográfico, separação e alteração de pressão, avaliar a possibilidade da troca inicial da pré-coluna. Se não, avaliar outros parâmetros cromatográficos. Se necessário, trocar a coluna. A manutenção do desempenho da coluna deve ser observada levando-se em consideração os parâmetros de resolução de pico, número de pratos teóricos e tempo de retenção. O FOR/LACQSA/BH/054 referente ao controle de colunas cromatográficas deverá ser preenchido a cada análise e deverá ser arquivado na pasta do cromatógrafo no qual a coluna foi instalada. 6.0 Procedimentos O analista deve verificar quais amostras deverão ser analisadas, inclusive aquelas para fins de controle de qualidade intralaboratorial conforme o POP/LACQSA/BH/009, em acordo com o Responsável. As amostras devem ser solicitadas à URPA pelo preenchimento do FOR/LACQSA/BH/024. Estas serão entregues acompanhadas dos respectivos formulários de acompanhamento de amostras FOR/LACQSA/BH/012 e FOR/LACQSA/BH/114. O FOR/LACQSA/BH/010 deverá ser preenchido com os dados pertinentes. Caso sejam anexados registros da técnica de detecção ou folhas adicionais, estas deverão ser rubricadas e numeradas ao final da análise de forma que cada folha seja identificada com o número total de folhas e número da folha. No caso de realização de controle de reagente, seguir os procedimentos constantes na IS/LACQSA/BH/002. 6.1 Preparo de soluções Os volumes e massas propostos para preparo das soluções reagentes podem ser ajustados para atender as Impresso por: Cópia não controlada Página 13/35

necessidades das análises respeitando as devidas proporções. As soluções utilizadas como fases móveis nos cromatógrafos podem ter as proporções preparadas utilizando as bombas ou linhas dos equipamentos. Antes de serem transferidas para os cromatógrafos, as fases móveis devem ser desgaseificadas em ultrassom por 10 a 15 minutos para retiradas de bolhas de ar adsorvidas nas soluções. - Água: ácido acético 1% Adicionar 10 ml ácido acético à 990 ml de água deionizada, homogeneizar. Se a água utilizada não for tipo I ou tipo II a solução deve ser filtrada em membrana de 0,45 m. - Solução tampão PBS com tween 20 a 0,01% Dissolver individualmente 0,20 g de diidrogenofosfato de potássio; 1,20 g de hidrogenofosfato dissódico anidro; 8,0 g de cloreto de sódio e 0,2 g de cloreto de potássio em água deionizada e transferir para um balão volumétrico de 1000 ml. Acrescentar 0,1 ml de tween 20 completar o volume e homogeneizar. - Metanol: acetonitrila: ácido acético 1% (22:22:56 v/v/v) Fase móvel Adicionar 220 ml de metanol e 220 ml de acetonitrila a 560 ml da solução água: ácido acético 1% e homogeneizar. - Metanol: acetonitrila: ácido acético 1% (30:30:40 v/v/v) Fase móvel Adicionar 300 ml de metanol e 300 ml de acetonitrila a 400 ml da solução água: ácido acético 1% e homogeneizar. - Água: ácido acético (29:1 v/v) Adicionar 10 ml ácido acético a 290 ml de água e homogeneizar. Se a água utilizada não for tipo I ou tipo II a solução deve ser filtrada em membrana de 0,45 µm. - Metanol: acetonitrila: água: ácido acético (35:35:29:1 v/v/v/v) Adicionar 300 ml da solução água: ácido acético (29:1 v/v) à mistura de 350 ml de metanol e 350 ml de acetonitrila e homogeneizar. Impresso por: Cópia não controlada Página 14/35

- Ácido nítrico 4 M Preparar a solução de ácido nítrico 4 M considerando a porcentagem e a densidade do ácido nos cálculos. Por exemplo: Para preparo de 100 ml da solução 4M, partindo de um ácido nítrico: d=1,4 g/ml, MM = 63,01 e 65%: Medir 28 ml (27,7 ml) do ácido e adicionar a 72 ml de água. - Água: acetonitrila: metanol (6:2:2 v/v/v) + KBr + ácido nítrico 4M Adicionar 400 ml de metanol e 400 ml de acetonitrila em 1200 ml de água. Adicionar 240 mg de KBr e 700 µl de ácido nítrico 4M à 2000 ml da fase móvel água: acetonitrila: metanol (6:2:2 v/v/v), filtrar e homogeneizar. - Metanol: água (8:2 v/v) Adicionar 20 ml de água em 80 ml de metanol. - Solução de tribrometo de piridínio 50 mg/ml Derivatizante Dissolver 50 mg de tribrometo de piridínio em 1000 ml de água deionizada filtrada ou água tipo I ou tipo II, homogeneizar em ultrassom até completa dissolução. - Tolueno: acetonitrila (9:1 v/v) Adicionar 10 ml de acetonitrila em 90 ml de tolueno e homogeneizar. - Tolueno: ácido acético (99:1 v/v) Adicionar 1 ml de ácido acético a 99 ml de tolueno e homogeneizar. 6.1.1 Preparo da solução padrão de AFB 1 e OTA As soluções padrão de AFB 1 /OTA (estoque, intermediária e trabalho) devem ser preparadas conforme procedimentos descritos na IP/LACQSA/BH/003. Durante a manipulação das soluções padrões: - Retirar os frascos do freezer para ambientação da temperatura, e colocá-los em suportes adequados e em ambiente protegidos da luz. - Homogeneizar a solução padrão antes da retirada da alíquota desejada. Impresso por: Cópia não controlada Página 15/35

- Ao abrir o frasco de solução padrão para retirada da alíquota desejada, fazê-lo sempre em capela, com a guilhotina abaixada, porém com a exaustão desligada. - Após a retirada da alíquota desejada da solução padrão, selar imediatamente o frasco e retorná-lo para armazenamento no freezer. Os cálculos utilizados no preparo deverão ser realizados utilizando a PLN/LACQSA/BH/013, a qual deve ser impressa para que registros e informações, referentes aos procedimentos de preparo das soluções padrão, sejam inseridos nos campos apropriados. Quando for utilizar as soluções padrões de AFBG e OTA seguir as recomendações presentes nos métodos MET/LACQSA/BH/001 e MET/LACQSA/BH/005. 6.1.2 Solução trabalho Pool de AFB 1 /OTA - Retirar uma alíquota apropriada da solução estoque, ou da intermediária de OTA e de AFB 1, utilizando vidraria ou micropipeta automática devidamente calibrada. - Transferir para um balão volumétrico calibrado e diluir para obter a concentração de aproximadamente 0,2 a 0,5 μg/ml para AFB 1 e OTA pela adição de tolueno: acetonitrila (9:1 v/v) e homogeneizar. O volume ou concentração desejada pode ser obtido por adição do volume necessário de tolueno: acetonitrila (9:1 v/v) utilizando micropipetas ou pipetas automáticas calibradas, dispensando o uso de balão volumétrico calibrado. Agitar por, no mínimo, 1 minuto em agitador de tubos, em alta velocidade. - Os cálculos utilizados no preparo deverão ser realizados utilizando a PLN/LACQSA/BH/013, a qual deve ser impressa para que registros e informações, referentes aos procedimentos de preparo das soluções padrão sejam inseridos nos campos apropriados. Quando for utilizar as soluções de trabalho de AFBG e OTA seguir as recomendações presentes nos métodos MET/LACQSA/BH/001 e MET/LACQSA/BH/005. 6.1.3 Soluções padrão para curva de calibração Os cálculos utilizados no preparo das soluções para a curva de calibração devem ser realizados utilizando a PLN/LACQSA/BH/018, a qual deve ser impressa para que registros e informações, referentes aos procedimentos de preparo das soluções padrão, sejam inseridos nos campos apropriados. Impresso por: Cópia não controlada Página 16/35

A partir da solução trabalho AFB 1 /OTA, com concentração de aproximadamente 0,2 a 0,5 µg/ml em solução de tolueno: acetonitrila (9:1 v/v), preparar uma curva padrão de calibração de AFB 1 /OTA em metanol: água (3:1 v/v), com no mínimo cinco níveis de concentração, aproximadamente iguais àqueles apresentados na Tabela 3. Tabela 3: Faixas de concentrações aproximadas para o preparo da curva de calibração de AFB 1 /OTA Código da solução Concentração da solução preparada (μg/ml) Concentração na amostra (µg/kg) preparada AFB 1 OTA AFB 1 OTA P1 0,00200 0,00200 3,2 3,2 P2 0,00150 0,00150 2,4 2,4 P3 0,00100 0,00100 1,6 1,6 P4 0,00050 0,00050 0,8 0,8 P5 0,00025 0,00025 0,4 0,4 P6 0,00020 0,00020 0,32 0,32 Tabela 4: Concentração das soluções padrão da curva de calibração e respectiva faixa de contaminação equivalente na amostra, considerando 20 gramas de amostras de amêndoa de cacau extraída com 230 ml do solvente de extração utilizando os métodos MET/LACQSA/BH/001 e MET/LACQSA/BH/005 para a quantificação. Código da Concentração da solução preparada (µg/ml) Contaminação aproximada na amostra (µg/kg) solução preparada AFB 1 AFB 2 AFG 1 AFG 2 OTA AFB 1 AFB 2 AFG 1 AFG 2 OTA P 1 0,00995 0,00202 0,01004 0,00212 0,01956 22,88 4,64 23,08 4,88 44,99 P 2 0,00497 0,00101 0,00502 0,00106 0,00978 11,44 2,32 11,54 2,44 22,49 P 3 0,00250 0,00051 0,00252 0,00053 0,00489 5,74 1,17 5,79 1,22 11,25 P 4 0,00122 0,00025 0,00123 0,00026 0,00240 2,81 0,57 2,83 0,60 5,52 P 5 0,00059 0,00012 0,00059 0,00012 0,00119 1,35 0,27 1,36 0,29 2,75 P 6 0,00029 0,00006 0,00029 0,00006 0,00062 0,66 0,13 0,67 0,14 1,42 P 7 0,00015 0,00003 0,00015 0,00003 0,00034 0,34 0,07 0,34 0,07 0,77 P 8 0,00006 0,00001 0,00006 0,00001 0,00024 0,14 0,03 0,14 0,03 0,56 Nota 2: A faixa de contaminação de AFB1/OTA e de AFBG/OTA apresentada nas Tabelas 3 e 4 é atendida se as amostras forem processadas exatamente como descrito no método. - Para o preparo do primeiro nível da curva de calibração (P1), pipetar, utilizando micropipeta calibrada, um volume conhecido da solução trabalho Pool (~0,2 a 0,5 µg/ml) e transferi-lo para um frasco apropriado. Impresso por: Cópia não controlada Página 17/35

- Evaporar o padrão, à temperatura ambiente, sob fluxo de N 2 ou ar comprimido seco, cuidando para que o solvente não seque completamente. - Retomar o resíduo resultante da evaporação da TP com solução de metanol: água (3:1 v/v). - Agitar por no mínimo 1 minuto em agitador de tubos, seguido de um minuto no ultrassom e mais um minuto no agitador. Quando for utilizar as soluções padrão para curva de calibração de AFBG e OTA seguir as recomendações presentes nos métodos MET/LACQSA/BH/001 e MET/LACQSA/BH/005. 6.1.4 Aprovação da primeira solução (P 1 ) da curva de calibração Antes da injeção dos padrões proceder à avaliação da adequação das condições instrumentais. A aprovação de P 1 é feita conforme instruções contidas na IT/LACQSA/BH/001 para o preenchimento e avaliação da PLN/LACQSA/BH/061. Os demais padrões da curva de calibração (no mínimo 5 concentrações diferentes) serão preparados preferencialmente após aprovação de P 1 pela diluição do mesmo (Tabelas 3 e 4). Todas as soluções preparadas devem ser cuidadosamente homogeneizadas. Fazer a injeção em triplicata ou duplicata de todas as soluções preparadas de forma aleatória e avaliar a aceitabilidade da curva conforme a IT/LACQSA/BH/001. A curva de calibração aprovada (as soluções) tem o prazo de validade de um mês para uso nas análises da rotina. Se no período de um mês houver necessidade de preparar uma nova solução padrão trabalho deve-se preparar também uma nova curva de calibração. Durante o prazo de validade de 1 mês, caso não se prepare nova curva analítica, a curva já preparada pode ser usada e deve ser avaliada a cada análise, segundo os critérios descritos na IT/LACQSA/BH/001, à exceção da aprovação de P1, a qual é feito quando de seu preparo. As curvas de calibração de micotoxinas feitas a partir de Materiais de Referência Certificados não serão descartadas mensalmente, desde que sejam avaliadas para demonstração de que as mesmas se mantém estáveis. O procedimento de avaliação das curvas está descrito na IT/LACQSA/BH/001. 6.2 Determinação de AFB 1 e OTA Impresso por: Cópia não controlada Página 18/35

As etapas para a análise de AFB 1 /OTA ou AFBG/OTA estão descritas de forma resumida nos dois fluxogramas (de acordo com o método de quantificação CLAE ou UHPLC) contidos no item 6.2.6. 6.2.1 Extração Pesar 25 g da amostra de fígado à temperatura de resfriado antes que haja dessorção etapa crítica. Pesar 50 g de amostra de amêndoa de cacau em pasta*. Adicionar 200 ml da solução de metanol: água (80:20 v/v). Acrescentar aproximadamente 5 g de cloreto de sódio e 1 g de bicarbonato de sódio. Homogeneizar a mistura por 6 minutos à velocidade alta (aproximadamente 800 rpm). Filtrar o extrato através de papel de filtro qualitativo pregueado e em seguida filtrar através de membrana de fibra de vidro Whatman GF/B 1 µm ou equivalente. Recolher o filtrado. * O REL/VAL/LACQSA/BH/004 apresenta os resultados que indicam melhor desempenho para o preparo de cacau. 6.2.2 Diluição Pipetar 10 ml do filtrado e transferir para um balão volumétrico ou proveta graduada de 100 ml. Adicionar 60 ml com solução tampão PBS 0,01% tween 20 e homogeneizar. 6.2.3 Purificação e eluíção Adaptar uma seringa de polipropileno de 60 ml à coluna de imunoafinidade, utilizando um adaptador, e conectála ao sistema de filtração a vácuo. Condicionar a coluna com aproximadamente 10 ml de tampão PBS 0,01% tween 20, mantendo um fluxo aproximado de 2 ml/min, não deixando a coluna secar. Ver Nota 3. Transferir o extrato diluído para seringa, deixar passar através da coluna com um fluxo aproximado de 2 ml/min (etapa crítica não deixar a coluna secar). Ver Nota 3. Nota 3: O fluxo aproximado de 2 ml/min é obtido por controle individual e depende do manifold utilizado e do analista. O fluxo aproximado de 2 ml/min pode ser obtido pela contagem de gotas por tempo e está devidamente identificado Impresso por: Cópia não controlada Página 19/35

nos manifolds: 1 gota por segundo ou 1 gota a cada 2 segundos, conforme determinado nos Testes: 15 (18/06/13) 16 (28/06/13) e 17 (10/07/13). Lavar a coluna com 10 ml de solução tampão PBS 0,01% tween 20, mantendo o fluxo (etapa crítica não deixar a coluna secar). Lavar a coluna com 10 ml de água mantendo o fluxo. Secar a coluna (passar ar pela coluna). 6.2.3.2 Eluição (processo manual) Desconectar a coluna do sistema de vácuo, conectá-la a uma seringa de vidro e aplicar pressão positiva. Transferir 1,5 ml de metanol grau CLAE para a coluna de imunoafinidade e deixar em contato por 3 minutos. Eluir a AFBG/OTA utilizando pressão positiva e controlando o fluxo de aproximadamente de 2 ml/min por meio do êmbolo da seringa. (Etapa crítica) Adicionar 0,5 ml de água tipo I ou tipo II ou destilada filtrada ao eluato. Agitar por aproximadamente 1 minuto em agitador de tubos. 6.2.4 Separação, detecção e quantificação Injetar no CLAE ou UHPLC, segundo condições especificadas respectivamente em 6.2.4.1 e 6.2.4.2, soluções padrão e amostras. Fazer integrações das soluções padrão da curva de calibração e das amostras positivas conforme procedimentos descritos nas instruções dos cromatógrafos utilizados. Armazenar os extratos brutos (quando necessário) e os purificados, em freezer até finalização dos resultados da análise Calcular as concentrações de AFBG e OTA presentes nas amostras. Caso a leitura das amostras não esteja inserida na curva, diluir quantitativamente o extrato e reinjetar. 6.2.4.1 Quantificação utilizando CLAE Injetar no CLAE soluções padrão e amostras nas condições cromatográficas especificadas para determinação de: AFB 1 /OTA, no caso de fígado suíno e de aves; ou AFBG/OTA, no caso de amêndoa de cacau. Impresso por: Cópia não controlada Página 20/35

As condições citadas abaixo são utilizadas apenas para a quantificação de AFB 1 /OTA em fígado. O equipamento deve ser operado seguindo as instruções da IT/LACQSA/BH/013. - coluna C 18, 25 cm de comprimento com partículas de 5 µm e 4,6 µm de diâmetro interno; - pré-coluna C 18 com partículas de 5 µm; - detector de fluorescência com excitação em 364 nm e emissão em 440 nm para AFB 1 e excitação em 333 nm e emissão em 477 nm para OTA; - fase móvel A metanol:acetonitrila: ácido acético 1% (22:22:56, v/v/v); - fase móvel B metanol:acetonitrila: ácido acético 1% (30:30:40, v/v/v); - fluxo da fase-móvel de 1,0 ml/min; - volume de injeção de 50 µl, apenas quando for injetar OTA em amêndoa de cacau e sua respectiva curva o volume será de 20 µl; - tempo de retenção de aproximadamente de 11 e 27 minutos para AFB 1 e OTA, respectivamente. - gradiente das fases móveis: 0,01 10 concentração fase móvel B 0% 15 31 concentração da fase móvel B 100% 33 50 concentração da fase móvel B 0% - mudança no comprimento de onda de excitação e emissão: 17 excitação 333 e emissão 477 40 excitação 364 e emissão 477 - derivatização pós-coluna: Por reação química com pyridinium tribromide: - solução derivatizante de pyridinium tribromide 50 mg/l; - fluxo da solução derivatizante de 0,3 ml/min. A etapa de quantificação de aflatoxina BG e OTA pode ser realizada individualmente com injeção do extrato e dos padrões utilizando a fase móvel cromatográfica dos métodos MET/LACQSA/BH/001 e Impresso por: Cópia não controlada Página 21/35

MET/LACQSA/BH/005. Esse caso se aplica tanto para determinação de AFB 1 /OTA em fígado suíno e de aves, quanto para AFBG/OTA em amêndoa de cacau Nota 5: No caso de injeções individuais utilizando os métodos MET/LACQSA/BH/001 e MET/LACQSA/BH/005 o tempo de retenção de aflatoxina BG e ocratoxina A sofrerão alterações, com t R de aproximadamente: 10 minutos para AFG 2 ; 13 minutos para AFG 1 ; 14 minutos para AFB 2 ; 18 minutos para AFB 1; e 10 minutos para OTA. 6.2.4.2 Quantificação utilizando UHPLC Obs: O equipamento deve ser utilizado de acordo com as instruções presentes na IT/LACQSA/BH/011. 6.2.4.2.1 Para AFBG Injetar no CLAE soluções padrão e amostras nas condições cromatográficas especificadas para determinação de: AFB 1 /OTA (no caso de fígado suíno e de aves) ou AFBG/OTA (no caso de amêndoa de cacau): - coluna C 18, 150 mm de comprimento com partículas de 2,2 µm e 2 mm de diâmetro interno; - pré-coluna C 18 com partículas de 4,6 µm; - detector de fluorescência com excitação em 360 nm e emissão em 420 nm; - fase móvel água: acetonitrila: metanol (6:2:2, v/v/v) + KBr + HNO 3 4 mol/l - fluxo da fase-móvel de 0,35 ml/min; - volume de injeção de 20 µl; - Tempo de retenção aproximado: 5 minutos para AFG 2 ; 6 minutos para AFG 1 ; 7 minutos para AFB 2 ; 9 minutos para AFB 1; 6.2.4.2.1 Para OTA Injetar no UHPLC soluções padrão e amostras nas condições cromatográficas especificadas para determinação de AFBG/OTA: - coluna C 18, 150 mm de comprimento com partículas de 2,2 µm e 2 mm de diâmetro interno; - pré-coluna C 18 com partículas de 4,6 µm; - detector de fluorescência com excitação em 360 nm e emissão em 420 nm; - fase móvel metanol: acetonitrila: água: ácido acético (35:35:29:1, v/v/v/v) Impresso por: Cópia não controlada Página 22/35

- fluxo da fase-móvel de 0,25 ml/min; - volume de injeção de 5 µl; - Tempo de retenção aproximado: 5 min; 6.2.5 Cromatogramas Com o objetivo de verificar a manutenção da qualidade analítica do método, pode-se monitorar por inspeção visual os parâmetros instrumentais retenção relativa, resolução, fator de simetria e número de pratos teóricos, conforme REL/VAL/LACQSA/004. A seguir encontram-se cromatogramas típicos obtidos nesse método de análise. Figura 1: Cromatograma da solução padrão de AFB 1 e OTA por CLAE. Figura 2: Cromatograma de amostra fígado de frango contaminada com padrão de AFB 1 e OTA por CLAE. Impresso por: Cópia não controlada Página 23/35

Figura 3: Cromatograma de amostra fígado de suíno contaminada com padrão de AFB 1 e de OTA por CLAE. Figura 4: Cromatograma da solução padrão de OTA por UHPLC Figura 5: Cromatograma da amostra de fígado de aves contaminado artificialmente com padrão de OTA por UHPLC Impresso por: Cópia não controlada Página 24/35

Figura 6: Cromatograma da amostra de fígado suíno contaminado artificialmente com padrão de OTA por UHPLC Figura 7: Cromatograma da solução padrão de AFBG por UHPLC Impresso por: Cópia não controlada Página 25/35

Figura 8: Cromatograma da amostra de fígado de aves contaminado artificialmente com padrão de AFB 1 por UHPLC Figura 9: Cromatograma da amostra de fígado suíno contaminado artificialmente com padrão de AFB 1 por UHPLC Figura 10: Cromatograma da amostra de amêndoa de cacau artificialmente fortificada no LMT C3_18 para a Ocratoxina A injetadas no CLAE. Impresso por: Cópia não controlada Página 26/35

Figura 11: Cromatograma da amostra de amêndoa de cacau artificialmente fortificada no LMT C3_16 para as AFBG injetadas no CLAE. Figura 12: Cromatograma da amostra de amêndoa de cacau artificialmente fortificada no LMT 14AC003BR para OTA injetada no UHPLC. Figura 13: Cromatograma da amostra de amêndoa de cacau artificialmente fortificada no LMT 14AC003BR para AFBG injetada no UHPLC. Impresso por: Cópia não controlada Página 27/35

Figura 14: Cromatograma da solução padrão de AFBG por CLAE. 6.2.6 Fluxogramas Fluxograma 1: Análise de AFBG e OTA por imunoafinidade e quantificação por cromatografia líquida de alta (CLAE) 25 g de amostra de fígado + 5 g NaCl + 1 g NaHCO 3 ou 50 g de amostra de amêndoa de cacau em pasta + 5 g NaCl + 1 g NaHCO 3 Agitar 6 min 200 ml metanol: água (80:20, v/v) Filtrar em papel de filtro e microfibra 1,5 µm Impresso por: Cópia não controlada Página 28/35

Pipetar 10 ml 60 ml PBS (tween 20 0,01%) IAC condicionada com 10 ml PBS (tween 20 0,01%) - Etapa critica Lavar coluna com 10 ml PBS 0,01% tween 20 e 10 ml água bidestilada Eluir 1,5 ml de metanol Adicionar 0,5 ml de água bidestilada Injetar 50 µl CLAE Agitar 1 min Coluna C18 (5µm x 250mm x 4,6mm de Ø interno Etapa crítica Linha A: metanol: acetonitrila: ácido acético 1% (22:22:56) Linha B: metanol: acetonitrila: ácido acético 1% (30:30:40) 0,01-10,00 : B conc. 0% 15,00-31,00 : B conc. 100% 33,00-50,00: B conc. 0% Derivatização AFB 1 e AFG 1 pós-coluna Sol. Pyridinium tribromide 50 mg/l Etapa crítica Detecção Fluorescência: 17,00 : Excitação 333 nm e Emissão 447 nm; 40,00 : Excitação 364 nm e Emissão 440 nm. Fluxograma 2: Análise de AFBG e OTA por imunoafinidade e quantificação por cromatografia líquida de ultra alta (UHPLC) 25 g de amostra de fígado +5 g NaCl + 1 g NaHCO 3 ou 50 g de amostra de amêndoa de cacau em pasta + 5 g NaCl + 1 g NaHCO 3 Agitar 6 min 200 ml metanol: água (80:20, v/v) Filtrar em papel de filtro e microfibra 1,5 µm Pipetar 10 ml Impresso por: Cópia não controlada Página 29/35 Lavar coluna com 10 ml PBS 0,01% tween 20 e 10 ml água bidestilada

60 ml PBS (tween 20 0,01%) IAC condicionada com 10 ml PBS (tween 20 0,01%) - Etapa critica Eluir 1,5 ml de metanol Adicionar 0,5 ml de água bidestilada Agitar 1 min Injetar 5 µl UHPLC para OTA e 20 µl para AFB 1 Coluna C18 (2,2µm x 150mm x 2,0mm de Ø interno Etapa crítica Para OTA: Fase Móvel: metanol: acetonitrila: água: ácido acético (35:35:29:1) Para AFBG: Fase Móvel: água: metanol: acetonitrila (6:2:2) + KBr + ácido nítrico 4 M Derivatização AFB 1 e AFG 1 pós-coluna Kobra Cell Etapa crítica 7.0 Resultados 7.1 Cálculos Detecção Fluorescência: Para OTA: Excitação 332 nm e Emissão 476 nm; Para AFBG: Excitação 360 nm e Emissão 420 nm. Os níveis de contaminação das amostras deverão ser expressos em µg/kg. Os cálculos da contaminação de OTA e aflatoxina nas amostras de fígado e amêndoa de cacau deverão ser realizados utilizando a planilha PLN/LACQSA/BH/029, a qual considerou a Equação 1: Alterações nos procedimentos descritos neste método poderão ser efetuadas, desde que não comprometam o resultado da análise, devidamente autorizadas pelo Responsável e registradas na ficha de acompanhamento de análise. Impresso por: Cópia não controlada Página 30/35

OTA ou AFBG µg/kg M g ota / afbg M 1 µg M M ota s V1 V V V 2 4 3 F diluição Equação 1 Sendo: M OTA/AFBG = massa de OTA ou AFBG na alíquota do extrato injetado no CLAE M 1 = massa da amostra (g) V 1 = volume da solução de extração (ml) V 2 = volume do filtrado retirado para diluição com PBS (ml) V 3 = volume de dissolução do resíduo final extrato final (µl) V 4 = volume do extrato final injetado no CLAE ou UHPLC (µl). 7.2 Reportagem de resultados Registrar diariamente os dados referentes ao controle intralaboratorial com amostras artificialmente contaminadas, naturalmente contaminadas ou com material de referência na PLN/LACQSA/BH/014 e na PLN/LACQSA/BH/015. Os resultados determinados para as amostras brancas e fortificadas deverão ser registrados no formulário FOR/LACQSA/BH/114 e devolvidos à URPA juntamente com os resultados das amostras analisadas. Em caso de amostras cegas, preencher a PLN/LACQSA/BH/011. Os resultados das amostras analisadas somente poderão ser liberados se os resultados do controle intralaboratorial atenderem aos critérios de aceitabilidade em termos de recuperação e/ou desvio padrão conforme determinado nas Tabelas 1 e 2. A reportagem de resultados deve seguir as instruções contidas no DS/LACQSA/BH/022. Os casos em que há necessidade de reanálise também estão previstos nesse documento de suporte. Considerar como NQ (não quantificado) os resultados inferiores ao limite de quantificação do método, conforme apresentado nas Tabelas 1 e 2. A reportagem de incerteza das amostras pertencentes ao Plano Nacional de Controle de Resíduos e Impresso por: Cópia não controlada Página 31/35

Contaminantes Animal (PNCRC Animal) deverá seguir orientações contidas no DS/LACQSA/BH/022. Após a verificação e liberação dos resultados das amostras analisadas, os mesmos deverão ser registrados no FOR/LACQSA/BH/012, que deverá ter todos os campos não utilizados fechados e após verificação deverão ser encaminhadas à URPA. 8.0 Responsabilidades As funções, atribuições e responsabilidades estão definidas na PLN/LACQSA/BH/020 e no DS/LACQSA/BH/005. 9.0 Referências CHAN D., MACDONALD S. J., BOUGHTFLOWER V. ultaneous determination of aflatoxins and ochratoxin A in food using a fully automated immunoaffinity column clean-up and liquid chromatography-fluorescence detection. Journal of Chromatography A 1059, p. 23-16, 2004. CHIAVARO E., CACCHIOLI C., BERNI E., SPOTTI E. Immunoaffinity clean-up and direct fluorescence measurement of aflatoxins B1 e M1 in pig liver: Comparison with high-performance liquid chromatography determination. Food Additives and Contaminants, 22(11), p. 1154 1161, 2005. CHIAVARO E., LEPIANI A., COLLA F., BETTONI P, PARI E., SPOTTI E. Ochratoxin A determination in ham by immunoaffinity clean-up and a quick fluorimetric method. Food Additives and Contaminants v. 19, n. 6, p. 575-581, 2002. HERZALLAH S.M. Determination of aflatoxins in eggs, milk, meat and meat products using HPLC fluorescent and UV detectors. Food Chemistry no 114, p. 1141-1146, 2009. IARC (1993) IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, v. 56, Some naturally occurring substances: food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins, Lyon, pp. 145-156. KŐSZEGI, T; POÓR, M. Ochratoxin A: Molecular Interactions, Mechanisms of Toxicity and Prevention at the Molecular Level. Toxins (Basel), v. 8(4), p.111, 2016. MONACI L., PALMISANO F., MATRELLA R., TANTILLO G. Determination of ochratoxin A at part-per-trillion level in Italian salami by immunoaffinity clean-up and high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Journal of Chromatography A. v.1090, n. 1-2, p. 184-187, oct. 2005. WHO FOOD ADDITIVES SERIES 47. 2001- Safety evaluation of certain mycotoxins in food. IPCS International Programme on Chemical Safety World Health Organization Geneve. FAO Food and Nutrition, paper 74. 10.0 Documentos referenciados DE/LACQSA/BH/029-Regulamento Nº 401 da Comissão Europeia, de 23 de fevereiro de 2006 IP/LACQSA/BH/001-Descontaminação e preparo de material IP/LACQSA/BH/003-Preparo e padronização de soluções padrões de micotoxinas IS/LACQSA/BH/002-Preparo e controle de lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções) Impresso por: Cópia não controlada Página 32/35

IS/LACQSA/BH/005- Aquisição de Serviços e Suprimentos IT/LACQSA/BH/001-Uso das planilhas de rotina para emissão de resultados de análise IT/LACQSA/BH/011-Cromatógrafo líquido de alta UHPLC Shimadzu - Nexera com derivatização pós coluna usando Kobra Cell e forno de reação pós coluna IT/LACQSA/BH/013-Cromatógrafo líquido de alta CLAE-Shimadzu com derivatização pós coluna usando Kobra cell MET/LACQSA/BH/001-Determinação de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 por imunoafinidade e cromatografia líquida com detecção por fluorescência. MET/LACQSA/BH/005-Determinação de ocratoxina A por cromatografia líquida de ultra e camada delgada PE/LACQSA/BH/009-Transferência da etapa de quantificação dos métodos para análise de micotoxinas do sistema de cromatografia convencional (HPLC) para cromatografia de rápida (UPLC), utilizando o Nexera PE/LACQSA/BH/017-Determinação de aflatoxina BG e ocratoxina A em cacau por cromatografia líquida de alta e detector de fluorescência POP/LACQSA/BH/002-Controle de equipamentos POP/LACQSA/BH/003-Acomodações e condições ambientais POP/LACQSA/BH/004-Gerenciamento de resíduos no laboratório POP/LACQSA/BH/009-Garantia da Validade dos Resultados 11.0 Anexos referenciados DS/LACQSA/BH/003-Requisitos para calibração, qualificação e verificação de equipamentos DS/LACQSA/BH/004-Escopo representativo do LACQSA - Laboratório de Controle de Qualidade e Segurança Alimentar DS/LACQSA/BH/005-Descrição de Função DS/LACQSA/BH/022-Reportagem de resultados DS/LACQSA/BH/024-Abreviação de analitos e parâmetros FOR/LACQSA/BH/010-Acompanhamento de análises de micotoxinas FOR/LACQSA/BH/012-Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas FOR/LACQSA/BH/024-Comunicado de recebimento e solicitação de amostras FOR/LACQSA/BH/025-Solicitação de material ao preparo FOR/LACQSA/BH/054-Controle de sistemas cromatográficos e colunas FOR/LACQSA/BH/114-Reportagem de resultados analíticos - Amostra controle PLN/LACQSA/BH/001-Plano de equipamentos PLN/LACQSA/BH/011- Controle Intralaboratorial - Amostra cego PLN/LACQSA/BH/013-Preparo de Solução Padrão Trabalho de Micotoxinas PLN/LACQSA/BH/014-Carta de Controle - Amostras naturalmente contaminadas PLN/LACQSA/BH/015-Carta de Controle - Amostras fortificadas PLN/LACQSA/BH/018-Curvas de Calibração para Micotoxinas - Modelos PLN/LACQSA/BH/020-Matriz de competência PLN/LACQSA/BH/029-Resultado analítico AFB1 / OTA- fígado e AFBG / OTA - amêndoa cacau por CLAE PLN/LACQSA/BH/061-Avaliação da Curva de Calibração para Micotoxinas Impresso por: Cópia não controlada Página 33/35

REL/VAL/LACQSA/002-Determinação de ocratoxina A utilizando CLUE/D-FL (revalidação e transferência do MET/LACQSA/BH/005). REL/VAL/LACQSA/004-Determinação de aflatoxina B1, B2, G1 e G2 e ocratoxina A em amêndoa de cacau por cromatografia líquida de alta e cromatografia líquida de ultra (ampliação de escopo do método MET/LACQSA/BH/003) 12.0 Informações de registro Determinação de aflatoxina B1, B2, G1 e G2 e ocratoxina A em amêndoa de cacau por cromatografia líquida de alta e cromatografia líquida de ultra (ampliação de escopo do método MET/LACQSA/BH/003) (REL/VAL/LACQSA/004) Acompanhamento de análises de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/010) Avaliação da Curva de Calibração (PLN/LACQSA/BH/061) Carta de controle - amostras fortificadas (PLN/LACQSA/BH/015) Carta de controle - amostras naturalmente contaminadas (PLN/LACQSA/BH/014) Comunicado de recebimento e solicitação de amostras (FOR/LACQSA/BH/024) Controle de colunas cromatográficas - CLAE (FOR/LACQSA/BH/054) Curvas de Calibração para Micotoxinas - Modelos (PLN/LACQSA/BH/018) Determinação de ocratoxina A utilizando CLUE/D-FL (revalidação e transferência do MET/LACQSA/BH/005) (REL/VAL/LACQSA/002) Matriz de competência (PLN/LACQSA/BH/020) Plano de equipamentos (PLN/LACQSA/BH/001) Preparo de Solução Padrão Trabalho de Micotoxinas (PLN/LACQSA/BH/013) Reportagem de resultados analíticos - Amostra controle (FOR/LACQSA/BH/114) Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/012) Resultado analítico de AFB1 e OTA - Incerteza de medição (PLN/LACQSA/BH/029) Solicitação de material ao preparo (FOR/LACQSA/BH/025) 13.0 Arquivos anexados LACQSA/BH - Plano de Estudo PE 074 Determinação de aflatoxina B 1 (AFB 1 ) e ocratoxina A (OTA) em fígado de suíno e ave por cromatografia líquida de alta e detector de fluorescência. LACQSA/BH Relatório do Plano de Estudo 074 Determinação de aflatoxina B 1 (AFB 1 ) e ocratoxina A (OTA) em fígado de suíno e ave por cromatografia líquida de alta e detector de fluorescência 14.0 Controle de alterações Item 1.1 - Inserção das abreviações p.a. e p.a.r. Descrição Impresso por: Cópia não controlada Página 34/35