Determinação de aflatoxina M1 em leite por cromatografia líquida de ultra eficiência com detector de fluorescência

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1 detector de fluorescência 1.0 Objetivos e alcance O MET/LACQSA/BH/006 objetiva descrever os procedimentos a serem utilizados na determinação de aflatoxina M 1 em leite, e nos registros dos dados relacionados às análises para que estes sejam devidamente seguidos e realizados. 1.1 Abreviações As abreviações de micotoxinas estão conforme DS/LACQSA/BH/024. HPLC=CLAE = cromatografia líquida de alta eficiência UHPLC=CLUE = cromatografia líquida de ultra eficiência DPR = RSD =CV =desvio padrão relativo LMP = limite máximo permitido por legislação LQ = limite de quantificação p.a.= para análise p.a.r. = para análise de resíduos PBS = solução tampão fosfato salina R %= recuperação percentual U = incerteza expandida 2.0 Fundamentos A amostra de leite é centrifugada, purificada utilizando coluna de imunoafinidade contendo anticorpos específicos para AFM 1 (com capacidade mínima de 100 ng de AFM 1 ). Os anticorpos da coluna se ligam seletivamente a AFM 1 presente nas amostras de leite formando um complexo AFM 1 -anticorpo. Os demais componentes da amostra passam livremente pela coluna ou são lavados com água. A AFM 1 é eluída da coluna de imunoafinidade com acetonitrila: metanol (3:2, v/v) e metanol grau HPLC ou similar. O eluato é evaporado e ressuspendido com a fase móvel água: acetonitrila: metanol (65:25:10, v/v/v) para determinação da AFM 1 utilizando cromatografia líquida de ultra eficiência com detecção por fluorescência. 2.1 Características do método Este método foi inicialmente validado e otimizado pelo LACQSA baseado nos procedimentos descritos pelo procedimento anterior do LACQSA (POP 090 Determinação de aflatoxina M 1 em leite por cromatografia de Impresso por: Cópia não controlada Página 1/20

2 detector de fluorescência camada delgada ), nos procedimentos descritos na AOAC, 2010, nos procedimentos descritos por DRAGACCI & GROSSO (2001) e nos procedimentos descritos no estudo colaborativo IDF/IUPAC/IAEA (2001). Devido à aquisição de equipamentos com a tecnologia de cromatografia líquida de ultra eficiência o método foi revalidado para transferência da etapa de quantificação de CLAE para UHPLC. Os resultados obtidos durante a revalidação estão apresentados no REL/VAL/LACQSA/003. Alguns dos parâmetros determinados no processo de revalidação são apresentados na Tabela 1. Os demais parâmetros de validação podem ser consultados nos relatórios de validação do método. Tabela 1. Parâmetros de desempenho do método obtidos no processo de validação Parâmetros de Desempenho Limite de detecção (LD) Critério/requisito - Valor obtido (valor médio entre as faixas estudadas) AFM 1 = 0,010 µg/kg leite fluido AFM 1 = 0,12 μg/kg leite em pó Aprovação Sim Limite de quantificação (LQ) - AFM 1 = 0,020 ± 0,010 µg/kg leite fluido AFM 1 = 0,20 ± 0,13 μg/kg leite em pó Sim Incerteza de medição - Faixa da curva de calibração Faixa ótima de trabalho - Valor do LD ao maior valor de concentração de controle interlaboratorial analisado com resultados dentro do critério de aceitabilidade Leite fluido LQ = 0,020 ± 0,010 µg/kg ND ± 0,010 µg/kg Leite em pó LQ = 0,20 ± 0,13 µg/kg ND ± 0,013 µg/kg Leite fluido: 0,0030 µg/kg a 0,219 µg/kg Leite em pó: 0,030 µg/kg a 2,19 µg/kg 0,017 a 0,00028 µg/ml (P 1 a P 7 ). Leite em pó é de 6,01 a 0,10 µg/kg Leite fluido é de 0,60 a 0,010 µg/l Sim Sim Sim 2.2 Aplicabilidade Este método é aplicável à determinação de aflatoxina M 1 em grupos de matrizes contidos no DS/LACQSA/BH/ Reagentes, padrões, materiais e insumos Vidrarias e outros materiais de uso na rotina necessário à análise deverão ser solicitados à Unidade de Preparo de Material pelo preenchimento do FOR/LACQSA/BH/025. Impresso por: Cópia não controlada Página 2/20

3 detector de fluorescência Quando for identificada a necessidade da aquisição de materiais indisponíveis em estoque, seguir procedimentos descritos na IS/LACQSA/BH/ Vidrarias em geral balões volumétricos de 100, 250, 500 e 1000 Ml. bastões de vidro; béqueres de 10, 100, 300 e 600 ml; funis de haste curta com 14 cm de diâmetro ou funil sem haste; frascos de borosilicato para solução padrão com fundo duplo cônico e tampa de baquelite, ou equivalente; pipetas de Pasteur; provetas de 100 ml calibrada e/ou com verificação de desempenho atualizada (MC); seringas de plástico de 60 ml, tipo luer ou equivalente que possa ser usado com reservatório do extrato diluído da amostra durante a etapa de purificação; seringas de vidro ou polipropileno de 3 ou 10 ml, tipo luer ou equivalente para uso do filtro de seringa e para uso na etapa de eluição; tubos de centrífuga de 50 ml; tubos de ensaio de 5-15 ml ou tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml com tampas de rosca ou equivalente. 3.2 Colunas e unidades filtrantes colunas de imunoafinidade tipo AFM1 Vicam ou equivalente (MC); algodão ou papel de filtro qualitativo; filtro de seringa com corpo de polipropileno, no tamanho de 0.13 mm, com membrana de fibra de vidro (GF) ou politetrafluoroestileno (PTFE) ou politetrafluoroetileno hidrofílico (H-PTFE), porosidade 0,20 micrometro, com volume morto máximo de 30µL filtração do eluato antes da injeção. 3.3 Padrões e materiais de referência materiais de referência certificados e padrão analítico de aflatoxina M 1 (MC). 3.4 Materiais de suporte Impresso por: Cópia não controlada Página 3/20

4 detector de fluorescência adaptadores para tubos de 1, 3 e 6 ml, tipo Bond elut, Varian ou equivalente; barra magnética; bastão, em vidro borossilicato; bulbos conta-gotas; cuba para recolher materiais limpos e utilizados; olocae-te (dispensador); espátulas; fita parafinada; gás nitrogênio, industrial ou ar comprimido seco; garra com 3 hastes; garra para conexão das partes do aparato de filtração; grades para tubos; papel toalha ou guardanapo; pêra de borracha ou pipetador automático ou equivalente; pinça dupla; papel alumínio; pissetas; ponteiras para micropipetas automáticas; torneiras de polipropileno ou teflon, tipo bond-elut, Varian ou equivalente. 3.5 Material para quantificação por UHPLC coluna de C18, 150 x 2,0 mm, partículas de 2,2 µm que apresente perfil característico para o sinal de AFM 1 e que atenda ao perfil cromatográfico previsto neste método (MC) frascos apropriados para o injetor automático do cromatógrafo líquido; pré-coluna de C18 com partículas de 5 µm ou equivalente, compatível com a coluna (MC). Nota 1: As colunas e pré-colunas descritas acima foram especificadas conforme aquelas disponíveis e utilizadas na ocasião da validação do método, no entanto, colunas com pequenas alterações podem ser utilizadas desde que a separação e o perfil cromatográfico característico para a aflatoxina M1 sejam mantidos. Impresso por: Cópia não controlada Página 4/20

5 detector de fluorescência 3.6 Reagentes, solventes e soluções Os reagentes, solventes e materiais devem ser avaliados e validados segundo a IS/LACQSA/BH/ Reagentes e solventes acetonitrila grau HPLC ou p.a.r.; metanol grau HPLC ou p.a.r.; água tipo I é recomendada. Em caso da não disponibilidade de água tipo I usar tipo II ou água deionizada, filtrada em membrana de 0,45 m. 3.0 Soluções acetonitrila: metanol (3:2, v/v); água: acetonitrila: metanol (65:25:10, v/v/v); tolueno: acetonitrila (9:1, v/v). 1.0 Equipamentos Utilizar os equipamentos conforme os procedimentos descritos nas suas respectivas instruções de trabalho (IT), na PLN/LACQSA/BH/001, no DS/LACQSA/BH/003 e no POP/LACQSA/BH/ Equipamentos críticos balança de 2 casas decimais, com resolução 0,01g, calibrada; balança de 4 casas decimais, com resolução 0,0001g, calibrada; cromatógrafo líquido de ultra eficiência com ; micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 100 a 1000µL ou 200 a 1000µL, com menor divisão de escala de 2 µl; micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 1000 a 10000µL com menor divisão de escala de 2 µl; micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 50 a 250µL ou 20 a 100µL ou 10 a 100µL com menor divisão de escala de 0,2 µl; micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 500 a 5000µL com menor divisão de escala de 2 µl; Impresso por: Cópia não controlada Página 5/20

6 detector de fluorescência sistema de purificação com controle individual de vácuo, com capacidade de manter um fluxo aproximado de 2mL/min; termômetro ou termopar calibrados. 4.2 Equipamentos de suporte agitador de tubos; aparelho de ultrassom; banho de aquecimento com agitação com controle da temperatura 40 C ± 10%; capelas de exaustão; cronômetro temporizador digital; freezer capacidade de atingir temperaturas -15 C; geladeira ou câmara fria capacidade capacidade de atingir temperaturas de 2 a 8 C. 1.0 Precauções analíticas Manter a área de análise sempre limpa e organizada conforme determina o POP/LACQSA/BH/003. A AFM 1 é um metabólito hidroxilado da aflatoxina B 1 e foi classificada pelo IARC no grupo 2B como possivelmente carcinogênica para humanos (IARC, 1993). Seus padrões sólidos e suas respectivas soluções devem ser manipulados como substâncias tóxicas. Os padrões sólidos devem ser manipulados com extremo cuidado, devido à sua natureza eletrostática e à sua tendência de se dispersar no ambiente. Todo o procedimento analítico deve ser realizado em local apropriado, com precauções particulares como utilização de equipamentos de proteção individual (luvas, guarda-pó, máscara, quando necessário, e sapatos fechados), evitando qualquer contato de padrões com a pele e/ou os olhos. Em caso de contato com a pele, lavar com solução de hipoclorito de sódio 1%, sabão e água em abundância e procurar assistência médica. Utilizar vidraria limpa, livre de detergente e resíduos e descontaminar o material utilizado ao final da análise, conforme o IP/LACQSA/BH/001. Toda vidraria utilizada para acondicionamento/armazenamento dos extratos finais das amostras, assim como das soluções padrão, incluindo vials novos utilizados nos cromatógrafos, deve ser tratada em ácido sulfúrico 2M, de acordo com os procedimentos descritos no IP/LACQSA/BH/001. Impresso por: Cópia não controlada Página 6/20

7 detector de fluorescência Em casos de derrames acidentais de soluções padrões, descontaminar a área com solução de hipoclorito de sódio a 1%, deixar em contato por 10 minutos e adicionar solução de acetona a 5%. A manipulação de solventes e/ou reagentes, bem como de resíduos, das análises deve ser realizada com cuidado, considerando a natureza de cada um, a ficha de informação de segurança de produtos químicos (FISPQ) e o POP/LACQSA/BH/004. A instalação de colunas cromatográficas deve ser feita utilizando um fluxo de 0,01 ml/min da fase móvel, para evitar a entrada de bolhas de ar nos detectores. Observa-se a saída de bolhas na saída da coluna e somente ao cessar a saída das bolhas e que a coluna pode ser conectada ao detector. Visando aumentar a vida útil das colunas cromatográficas de fase reversa (C 18 ), pode-se usar pré-colunas de C 18. Ao término das análises, lavar e armazenar a coluna em solventes orgânicos como metanol ou acetonitrila. Quando se observar anomalias referentes à simetria do sinal cromatográfico, separação e alteração de pressão, avaliar a possibilidade da troca inicial da pré-coluna. Se não, avaliar outros parâmetros cromatográficos. Se necessário, trocar a coluna. A manutenção do desempenho da coluna deve ser observada levando-se em consideração os parâmetros de resolução de pico, número de pratos teóricos e tempo de retenção. 6.0 Procedimentos O analista deve verificar quais amostras deverão ser analisadas, inclusive aquelas para fins de controle de qualidade intralaboratorial, em acordo com o Responsável. As amostras devem ser solicitadas à URPA pelo preenchimento do FOR/LACQSA/BH/024. Estas serão entregues acompanhadas das respectivas fichas de acompanhamento de amostras FOR/LACQSA/BH/012. O FOR/LACQSA/BH/010 deverá ser preenchido com os dados pertinentes. Caso sejam anexados registros da técnica de detecção ou folhas adicionais, estas deverão ser rubricadas e numeradas ao final da análise de forma que cada folha seja identificada com o número total de folhas e número da folha. No caso de realização de controle de reagente, seguir procedimentos descritos na IS/LACQSA/BH/002. O FOR/LACQSA/BH/054 deverá ser preenchido com todas as características de identificação da coluna cromatográfica (tipo de coluna, marca, lote, número, comprimento, diâmetro interno e tamanho da partícula) empregada e, a cada análise, com informações referentes à data da utilização, nome do analista, metodologia Impresso por: Cópia não controlada Página 7/20

8 utilizada e número de injeções. O formulário deverá ser arquivado na pasta do cromatógrafo no qual a coluna foi instalada. 6.1 Preparo de soluções Os volumes e massas propostos para preparo das soluções reagentes podem ser ajustados para atender as necessidades das análises respeitando as devidas proporções. As soluções utilizadas como fases móveis nos cromatógrafos podem ter as proporções preparadas utilizando as bombas ou linhas dos equipamentos. Antes de serem transferidas para os cromatógrafos, as fases móveis devem ser desgaseificadas em ultrassom por 10 a 15 minutos para retiradas de bolhas de ar adsorvidas nas soluções. Acetonitrila: metanol (3:2 v/v) eluição da AFM 1 da coluna de imunoafinidade Adicionar 20 ml de metanol p.a.r. ou HPLC a 30 ml de acetonitrila p.a.r. ou HPLC e homogeneizar lentamente. Água: acetonitrila: metanol (65:25:10 v/v/v) fase móvel usada no UHPLC e para retomada do eluato Adicionar 25 ml de acetonitrila p.a.r ou HPLC e em 10 ml metanol HPLC a 65 ml de água tipo I (ou água tipo II ou água deionizada filtrada em membrana 0,45 µm), homogeneizar lentamente e sonicar por 15 minutos em banho de ultrassom. Tolueno: acetonitrila (90:10 v/v) solvente de dissolução do resíduo Adicionar 10 ml de acetonitrila p.a.r. ou HPLC a 90 ml de tolueno e homogeneizar lentamente Preparo da solução padrão de AFM 1 As soluções padrão de AFM 1 (estoque, intermediária e trabalho) devem ser preparadas conforme procedimentos descritos na IP/LACQSA/BH/003. Durante a manipulação das soluções padrões: - Retirar os frascos do freezer para ambientação da temperatura, oloca-los em suportes adequados e em ambiente protegidos da luz. - Homogeneizar a solução padrão antes da retirada da alíquota desejada. Impresso por: Cópia não controlada Página 8/20

9 - Ao abrir o frasco de solução padrão para retirada da alíquota desejada, fazê-lo sempre em capela, com a guilhotina abaixada, porém com a exaustão desligada. A solução trabalho de AFM 1 (AFM 1 ) tem concentração de 0,2 a 1 µg/ml. Deve-se pipetar uma alíquota apropriada da solução padrão recém padronizada, ou do tipo MRC. Se necessário alterar o solvente, evaporar a temperatura ambiente sob fluxo de nitrogênio (preferencialmente) ou ar comprimido seco e retomar com o volume apropriado de tolueno: acetonitrila (9:1 v/v) ou acetonitrila. A solução padrão de AFM 1 é estável em acetonitrila por aproximadamente 1 mês (Dragacci, 2001). - Após a retirada da alíquota desejada da solução padrão, selar imediatamente o frasco e retorná-lo para armazenamento no freezer. Os frascos devem ser âmbar ou devem ser protegidos contra a luz fluorescente e solar. Após o preparo, as soluções padrão de aflatoxina M1 devem ser seladas com parafilme e armazenadas em freezer. Os cálculos utilizados no preparo deverão ser realizados utilizando a PLN/LACSQA/BH/013, a qual deve ser impressa para que registros e informações, referentes aos procedimentos de preparo das soluções padrão, sejam inseridos nos campos apropriados Preparo da curva de calibração Os cálculos utilizados no preparo das soluções para a curva de calibração devem ser realizados utilizando a PLN/LACQSA/BH/018, a qual deve ser impressa para que registros e informações, referentes aos procedimentos de preparo das soluções padrão, sejam inseridos nos campos apropriados. Pipetar utilizando micropipeta um volume conhecido da T AFM 1 e transferir para um frasco apropriado para o preparo da primeira solução da curva de calibração (P 1 ). Evaporar o padrão sob fluxo de N 2 ou ar comprimido seco, cuidando para que o solvente não seque completamente, deixando gotículas no fundo do frasco. Adicionar o solvente de retomada, fase móvel água: acetonitrila: metanol (65:25:10, v/v/v), utilizando micropipeta, ou se o frasco for um balão volumétrico, avolumar adequadamente. Nesta etapa, para melhor solubilização do resíduo após evaporação do padrão, pode-se adicionar 10% de metanol puro, homogeneizar e em seguida adicionar o equivalente de acetonitrila e água, de forma a manter a proporção do solvente de retomada. Agitar por pelo menos 2 minutos em agitador de tubos seguido de um minuto no ultrassom e mais dois minutos Impresso por: Cópia não controlada Página 9/20

10 de agitação com agitador de tubos. Antes da injeção dos padrões proceder à avaliação da adequação das condições instrumentais. A aprovação de P1 é feita conforme instruções contidas na IT/LACQSA/BH/001 para o preenchimento e avaliação da PLN/LACQSA/BH/061. Os demais padrões da curva de calibração (no mínimo 5 concentrações diferentes) serão preparados preferencialmente após aprovação de P1 pela diluição do mesmo (Tabela 3). Todas as soluções preparadas devem ser cuidadosamente homogeneizadas. Fazer a injeção em triplicata ou duplicata de todas as soluções preparadas de forma aleatória e avaliar a aceitabilidade da curva conforme a IT/LACQSA/BH/001. A curva de calibração aprovada (as soluções) tem o prazo de validade de um mês para uso nas análises da rotina. Se no período de um mês houver necessidade de preparar uma nova solução padrão trabalho deve-se preparar também uma nova curva de calibração. Durante o prazo de validade de 1 mês, caso não se prepare nova curva analítica, a curva já preparada pode ser usada e deve ser avaliada a cada análise, segundo os critérios descritos na IT/LACQSA/BH/001, à exceção da aprovação de P1, a qual é feito quando de seu preparo. As curvas de calibração de micotoxinas feitas a partir de Materiais de Referência Certificados não serão descartadas mensalmente, desde que sejam avaliadas para demonstração de que as mesmas se mantém estáveis. O procedimento de avaliação das curvas está descrito na IT/LACQSA/BH/001. Tabela 2. Faixas de concentrações aproximadas para o preparo da curva de calibração para aflatoxina M 1 Identificação da Solução Padrão Concentração da solução preparada (µg/ml) Concentração em leite em pó (µg/kg) Concentração Leite Fluido (µg/l) P 1 0,02 6,01 0,60 P 2 0,01 3,61 0,36 P 3 0,005 1,49 0,15 P 4 0,0025 0,75 0,08 P 5 0,0012 0,37 0,037 P 6 0,0006 0,19 0,019 P 7 0,0003 0,10 0,010 Impresso por: Cópia não controlada Página 10/20

11 Nota 2: A faixa de contaminação (µg/kg ou mg/l) de AFM 1 apresentada na Tabela 2 é atendida quando 100 ml e 10 g de amostra de leite fluido e leite em pó respectivamente, forem passados pela coluna de imunoafinidade e o volume de retomada do resíduo do eluato após evaporação for de 3000 µl. 1.0 Determinação de AFM 1 Os procedimentos para análise de aflatoxina M1 em leite estão apresentados resumidamente no fluxograma 1. Fluxograma 1: Metodologia para análise de AFM1 Impresso por: Cópia não controlada Página 11/20

12 6.2.1 Extração Impresso por: Cópia não controlada Página 12/20

13 Dissolver completamente a amostra de leite em pó em água tipo 1 ou deionizada (utilizar massa maior que 10 g, mantendo a proporção de 10 g/100 ml Nota 3), agitando por 15 minutos em agitador magnético ou por agitação manual. Se o agitador tiver controle de temperatura, fixar a temperatura para aproximadamente 37 C durante o aquecimento, caso não seja possível, aquecer a amostra a temperatura de aproximadamente 37 C para garantir a homogeneidade da amostra. Para o leite fluido ou leite em pó dissolvido, retirar uma fração mínima de 110 ml da amostra devidamente homogeneizada e acondicionar em tubos de centrifuga. Centrifugar utilizando pelo menos 3500 rpm por aproximadamente 10 minutos a 10 C para separação da camada gordurosa. Filtrar através de algodão ou papel de filtro qualitativo ou retirar a camada gordurosa por sucção (por exemplo, usando pipeta de Pauster) e retirar exatamente 100 ml do leite desengordurado para purificação. Aglomerados de leite em pó que eventualmente não foram dissolvidos podem entupir a coluna de imunoafinidade. Nota 3: a massa da amostra e o volume da água (proporção 10 g de amostra em 100 ml de água) devem ser tal que após centrifugação e desengorduramento seja possível retirar 100 ml do leite desengordurado e filtrado para realização da purificação por coluna de imunoafinidade Purificação Transferir quantitativamente uma alíquota de 100 ml do filtrado obtido no item anterior para um adaptador acoplado à coluna de imunoafinidade. Passar o filtrado pela coluna, mantendo um fluxo regular de aproximadamente de 2 ml/min (Nota 4) utilizando gravidade ou um sistema de vácuo para controlar o fluxo. Evitar que a coluna seque durante essa etapa. Lavar a coluna com 40 ml (2 etapas de 20 ml que devem ser utilizados para lavar a proveta de forma a garantir a transferência completa do leite) de água mantendo o fluxo regular de aproximadamente de 2 ml/min (Nota 4). Nota 4: O fluxo de aproximadamente 2 ml/min é obtido por controle individual e depende do manifold utilizado. O fluxo de 2 ml/min pode ser obtido pela contagem de gotas por tempo e está devidamente identificado nos manifolds: Impresso por: Cópia não controlada Página 13/20

14 1 gota por segundo ou 1 gota a cada 2 segundos, conforme determinado nos Testes: 15 (18/06/13), 16 (28/06/13) e 17 (10/07/13) Eluição de todas as amostras Desconectar a coluna do sistema de vácuo, conectá-la a uma seringa de vidro e aplicar pressão positiva para retirada de excesso de água do gel. Adicionar 2,5 ml de acetonitrila: metanol (3:2 v/v) e em seguida 2,5 ml de metanol puro à coluna de imunoafinidade deixando os solventes em contato com os anticorpos da coluna por pelo menos 1 min. Eluir a AFM 1 mantendo o fluxo de aproximadamente 2 ml/min e passar ar pela coluna (Nota 4). Coletar o eluato em um tubo apropriado e evaporar a 40 C, sob fluxo de nitrogênio ou ar comprimido seco ou ainda utilizando rota vapor à temperatura de 40 C. Cuidados devem ser tomados para evitar evaporação do extrato até a secura. Deixar sobrar uma gota do extrato no tubo, garantindo dessa forma uma ressuspensão eficiente do resíduo no solvente puro Separação, detecção e quantificação Adicionar ao resíduo obtido após evaporação, 3000 µl da fase móvel e homogeneizar vigorosamente por 1 minuto em agitador de tubos, transferir para frascos apropriados. Se for observado evidências de que a amostra não foi completamente dissolvida do frasco colocar em ultrassom por aproximadamente 1 minuto e agitar novamente. Injetar 5 µl do extrato da amostra e das soluções padrões da curva de calibração no cromatógrafo líquido de ultra eficiência utilizando as condições: Nota 5: Verificar o solvente do frasco de lavagem do auto injetor que deve ser preferencialmente a fase móvel ou solvente de composição e polaridade similar. Coluna: C18, 150 mm de comprimento com partículas de 2,2 µm e 2 mm de diâmetro interno; Fase móvel: água: acetonitrila: metanol (65:25:10, v/v/v) Detector de fluorescência: ex =365 nm e em =435 nm; Fluxo: 0,35 ml/min; Impresso por: Cópia não controlada Página 14/20

15 Pré coluna: C 18, partículas de 5 µm e 4,6 mm de diâmetro interno. Integrar o sinal cromatográfico presente nas amostras e padrões. Caso a área determinada para a amostra não esteja inserida na curva, diluir quantitativamente o extrato e reinjetar. Calcular as concentrações da aflatoxina M 1 presentes nas amostras utilizando a curva padrão de calibração, conforme equações 1, 2 ou 3. Armazenar os extratos brutos e os purificados, em freezer. 7.0 Resultados 7.1 Cálculos Realizar os cálculos de contaminação das amostras pela PLN/LACQSA/BH/ Leite em Pó C AflaM 1 C CLAE RT R µg / kg FCD M V A V V ACC Equação 1 (simplificada) C AflaM1 = Concentração de AFM 1 determinada na amostra de leite (µg/kg) C UHPLC = Concentração determinada pelo UHPLC (µg/ml) V RT = Volume usado para restituir a massa de leite em pó (ml) V R = Volume usado para retomar o extrato evaporado (µl) M A = Massa da amostra usada na análise (g) V ACC = Alíquota do leite reconstituído e centrifugado passado pela coluna de imunoafinidade (ml) ACPA = área cromatográfica do pico da amostra a = intercepto da curva de calibração (µg/ml) b = inclinação da curva de calibração (µg/ml) FC D = fator de correção devido às possíveis diluições que poderão ser realizadas no extrato final retomado FCD=1; FC R = fator de correção devido ao erro sistemático da recuperação FCR=1 e C RI = correção devido à reprodutibilidade interna do laboratório CRI=0; Leite Fluido C AflaM 1 C CLAE R µg / L FCD V V AAC Impresso por: Cópia não controlada Página 15/20

16 Equação 2 (simplificada) C C AflaM1 = Concentração de AFM 1 determinada na amostra de leite (µg/l) C UHPLC = Concentração determinada pelo UHPLC (µg/ml) V R = Volume usado para retomar o extrato evaporado (µl) V AAC = Alíquota da amostra centrifugada passada pela coluna de imunoafinidade (ml) ACPA = área cromatográfica do pico da amostra a = intercepto da curva de calibração (µg/ml) b = inclinação da curva de calibração (µg/ml) FC D = fator de correção devido às possíveis diluições que poderão ser realizadas no extrato final retomado FCD=1; FC R = fator de correção devido ao erro sistemático da recuperação FCR=1 e C RI = correção devido à reprodutibilidade interna do laboratório CRI=0; AflaM 1 µg / L ACPA a b V AAC V R FC D FC R C RI Equação 3 (completa) 7.2 Reportagens de resultados Seguir os procedimentos contidos no POP/LACQSA/BH/009 para garantia da validade dos resultados. Registrar diariamente os dados referentes ao controle intralaboratorial com amostras artificialmente contaminadas, naturalmente contaminadas ou com material de referência nas planilhas PLN/LACQSA/BH/014 e PLN/LACQSA/BH/015. Em caso de amostras cegas, preencher a PLN/LACQSA/BH/011. Os resultados determinados para as amostras brancas e fortificadas deverão ser registrados no formulário FOR/LACQSA/BH/114 e devolvidos à URPA juntamente com os resultados das amostras analisadas. Os resultados das amostras analisadas somente poderão ser liberados se os resultados do controle intralaboratorial atenderem aos critérios de aceitabilidade em termos de recuperação e/ou desvio padrão conforme determinado na Tabela 03 Tabela 03: Critérios de aceitabilidade segundo DE/LACQSA/BH/029 Concentração de AFM1 (µg/kg) Recuperação aceitável (%) 0,01 0,05 60 a 120 Impresso por: Cópia não controlada Página 16/20

17 Concentração de AFM1 (µg/kg) Recuperação aceitável (%) >0,05 70 a 110 A reportagem de resultados deve seguir as instruções contidas no DS/LACQSA/BH/022. Esse documento de suporte também trata dos casos em que é necessário fazer reanálise de amostras. Considerar como NQ (não quantificado) resultados inferiores ao limite de quantificação do método, conforme apresentado na Tabela 1. Após a verificação e liberação dos resultados das amostras analisadas, os mesmos deverão ser registrados no FOR/LACQSA/BH/012, que deverá ter todos os campos não utilizados fechados e, após verificação, deverá ser encaminhado à URPA. 8.0 Responsabilidades As funções, atribuições e responsabilidades estão definidas na PLN/LACQSA/BH/020 e na DS/LACQSA/BH/ Referências AOAC. OFFICIAL METHOD AFLATOXIN M 1 IN LIQUID MILK immunoaffinity column by liquid chromatography DRAGACCI, S.; GROSSO, F. Immunoaffinity column clean-up with liquid chromatography for determination of aflatoxin M1 in liquid milk: Collaborative Study. Journal of AOAC International, v. 84, n. 2, IARC (1993). IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, v. 56, Some naturally occurring substances: food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins, Lyon, pp MUSCARELLA, M.; LO MAGRO, S.; PALERMO, C.; CENTRONZE, D. Validation according to European Commission Decision 2002/657/EC of a confirmatory method for aflatoxin M1 in milk base don immunoaffinity columns and high performance liquid chromatography with fluorescence detection. Anal Chim Acta, v.594, p , 2007 Protocolo do estudo colaborativo IDF/IUPAC/IAEA: Determination of the content of aflatoxin M1 in milk by immunoaffinity clean-up followed by thin layer chromatography, maio, Documentos referenciados Impresso por: Cópia não controlada Página 17/20

18 DE/LACQSA/BH/029-Regulamento Nº 401 da Comissão Europeia, de 23 de fevereiro de 2006 IP/LACQSA/BH/001-Descontaminação e preparo de material IP/LACQSA/BH/003-Preparo e padronização de soluções padrões de micotoxinas IS/LACQSA/BH/002-Preparo e controle de lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções) IS/LACQSA/BH/005- Aquisição de Serviços e Suprimentos IT/LACQSA/BH/001-Uso das planilhas de rotina para emissão de resultados de análise POP/LACQSA/BH/002-Controle de equipamentos POP/LACQSA/BH/003-Acomodações e condições ambientais POP/LACQSA/BH/004-Gerenciamento de resíduos no laboratório POP/LACQSA/BH/009-Garantia da Validade dos Resultados 11.0 Anexos referenciados DS/LACQSA/BH/003-Requisitos para calibração, qualificação e verificação de equipamentos DS/LACQSA/BH/004-Escopo representativo do LACQSA - Laboratório de Controle de Qualidade e Segurança Alimentar DS/LACQSA/BH/005-Descrição de Função DS/LACQSA/BH/022-Reportagem de resultados DS/LACQSA/BH/024-Abreviação de analitos e parâmetros FOR/LACQSA/BH/010-Acompanhamento de análises de micotoxinas FOR/LACQSA/BH/012-Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas FOR/LACQSA/BH/024-Comunicado de recebimento e solicitação de amostras FOR/LACQSA/BH/025-Solicitação de material ao preparo FOR/LACQSA/BH/054-Controle de sistemas cromatográficos e colunas FOR/LACQSA/BH/114-Reportagem de resultados analíticos - Amostra controle PLN/LACQSA/BH/001-Plano de equipamentos PLN/LACQSA/BH/011- Controle Intralaboratorial - Amostra cego PLN/LACQSA/BH/013-Preparo de Solução Padrão Trabalho de Micotoxinas PLN/LACQSA/BH/014-Carta de Controle - Amostras naturalmente contaminadas PLN/LACQSA/BH/015-Carta de Controle - Amostras fortificadas PLN/LACQSA/BH/017-Resultado analítico Aflatoxina M1 por CLAE - Incerteza de medição PLN/LACQSA/BH/018-Curvas de Calibração para Micotoxinas - Modelos PLN/LACQSA/BH/020-Matriz de competência PLN/LACQSA/BH/061-Avaliação da Curva de Calibração para Micotoxinas REL/VAL/LACQSA/003-Determinação de aflatoxina M1 utilizando UHPLC/D-FL (transferência do MET/LACQSA/BH/006) Informações de registro Acompanhamento de análises de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/010) Avaliação da Curva de Calibração (PLN/LACQSA/BH/061) Carta de controle - amostras fortificadas (PLN/LACQSA/BH/015) Carta de controle - amostras naturalmente contaminadas (PLN/LACQSA/BH/014) Comunicado de recebimento e solicitação de amostras (FOR/LACQSA/BH/024) Impresso por: Cópia não controlada Página 18/20

19 Controle de colunas cromatográficas - CLAE (FOR/LACQSA/BH/054) Controle intralaboratorial - Amostra cego (PLN/LACQSA/BH/011) Curvas de Calibração para Micotoxinas - Modelos (PLN/LACQSA/BH/018) Determinação de aflatoxina M1 utilizando UHPLC/D-FL (transferência do MET/LACQSA/BH/006) (REL/VAL/LACQSA/003) Plano de equipamentos (PLN/LACQSA/BH/001) Preparo de Solução Padrão Trabalho de Micotoxinas (PLN/LACQSA/BH/013) Reportagem de resultados analíticos - Amostra controle (FOR/LACQSA/BH/114) Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/012) Resultado analítico Aflatoxina M1 por CLAE - Incerteza de medição (PLN/LACQSA/BH/017) Solicitação de material ao preparo (FOR/LACQSA/BH/025) 13.0 Arquivos anexados Não aplicável Controle de alterações Item 1.1 Inserida abreviações p.a. e p.a.r.. Alteração 2.1 Corrigida a sigla de REL/LACQSA/BH/003 para REL/VAL/LACQSA/ Feita referência ao DS/LACQSA/BH/ Retirada Nota Feita menção à PLN/LACQSA/BH/ Retirada menção aos formulários FOR/LACQSA/BH/005 e FOR/LACQSA/BH/006 e mantida apenas referência à IS/LACQSA/BH/005. Substituída referência ao FOR/LACQSA/BH/032 pela PLN/LACQSA/BH/011. Substituído EU 401, 2006 por DE/LACQSA/BH/029. Incluída referência ao POP/LACQSA/BH/ Substituída referência ao DS/LACQSA/BH/001 pela PLN/LACQSA/BH/ Atualizada as referências Retirados: DE/LACQSA/BH/001, DE/LACQSA/BH/032, DE/LACQSA/BH/035, DE/UGQ/PL/007, POP/LACQSA/BH/011. Incluído: POP/LACQSA/BH/009. Incluídos: DS/LACQSA/BH/004, PLN/LACQSA/BH/001, PLN/LACQSA/BH/011, PLN/LACQSA/BH/020. Retirados: DS/LACQSA/BH/001, FOR/LACQSA/BH/005, FOR/LACQSA/BH/006, FOR/LACQSA/BH/021, FOR/LACQSA/BH/036, FOR/LACQSA/BH/032, PLN/DLAB/PL/007. Impresso por: Cópia não controlada Página 19/20

20 12.0 Incluídas: PLN/LACQSA/BH/001, PLN/LACQSA/BH/011, PLN/LACQSA/BH/020. Retirados: FOR/LACQSA/BH/005, FOR/LACQSA/BH/006, FOR/LACQSA/BH/032, FOR/LACQSA/BH/021, FOR/LACQSA/BH/036, PLN/DLAB/PL/007. Impresso por: Cópia não controlada Página 20/20