Análise de resíduo de arsênio em tecido animal por espectrometria de absorção atômica

Transcrição

1 1.0 Objetivos e alcance Este método de ensaio objetiva detectar e quantificar resíduos de arsênio em rim suíno, músculo de aves e rim bovino empregando espectrofotometria de absorção atômica (EAA) com geração de hidretos e injeção automática em fluxo. O presente método trabalha na faixa de 101,9 a 2000 µg/kg para rim bovino e suíno, e 60 a 1000 µg/kg para músculo de ave. 2.0 Fundamentos O método fundamenta-se na queima e calcinação da matéria orgânica, empregando nitrato de magnésio como modificador químico com o objetivo de facilitar a calcinação e evitar a volatilização do arsênio. A cinza obtida é dissolvida em ácido clorídrico originando uma solução que posteriormente será tratada com iodeto de potássio e ácido ascórbico para conversão de todo o arsênio (As V ) em As III (o As V não forma hidreto). Em seguida ocorre a injeção simultânea no equipamento com ácido clorídrico e borohidreto de sódio para gerar hidretos de arsênio que são carreados até uma célula de quartzo aquecida disposta no caminho óptico do equipamento. Neste momento ocorre a quebra do hidreto de arsênio e a liberação do arsênio no estado elementar e gasoso para detecção e quantificação por EAA. 3.0 Reagentes, padrões, materiais e insumos 3.1 Reagentes Ácido ascórbico para análise (p.a.); Ácido clorídrico fumegante 37% p.a.; Ácido nítrico 65% p.a.; Borohidreto de sódio para espectroscopia de absorção atômica; Hidróxido de sódio p.a.; Iodeto de potássio p.a.; Nitrato de magnésio hexahidratado [Mg(NO 3 ) 2.6H 2 O] p.a.; Água deionizada e destilada ou de qualidade superior; Amostra branca de músculo de ave; Impresso por: Cópia não controlada Página 1/13

2 3.2 Padrões Solução estoque de padrão de arsênio para absorção atômica (1000 mg/l); 3.3 Materiais Luva de nitrila; Bandeja de aço inoxidável ou plástico; Tesoura de aço inoxidável; Bisturi ou faca de lâmina inoxidável; Pinça de aço inoxidável; Cadinhos de material inerte e refratário, tal como vidro borossilicato; Espátula de aço inoxidável; Béqueres de 50 ml, 100 ml e 250 ml; Bastões de vidro; Balões volumétricos calibrados de 10 e 25 ml; Balões volumétricos de 50 ml, 100 ml, 500 ml e 1000 ml; Provetas de 100 ml, 250 ml e 500 ml; Tubos graduados de 15 ml; 3.4 Insumos Gás argônio Ultrapuro; 4.0 Equipamentos Freezer Balança analítica de três casas decimais com precisão de um miligrama, ou melhor; Micropipetas automáticas com capacidade de, pelo menos, 50 μl a 250 μl devidamente calibradas e prontas para uso conforme POP/LEI/PL/010; Câmara de exaustão ou capela; Chapa aquecedora; Impresso por: Cópia não controlada Página 2/13

3 Mufla com programação de temperaturas; Espectrofotômetro de Absorção Atômica equipado com manta aquecedora e célula de quartzo; Impressora de dados de leitura de absorbâncias; Sistema de injeção em fluxo; Amostrador automático; Lâmpada de Catodo oco ou descarga elétrica de Arsênio; Microcomputador; Pipetadores automáticos; 5.0 Precauções analíticas Durante o processo analítico utilizar: Freezers para congelamento de amostras que mantenham temperatura menor que -8ºC; Chapa elétrica que permita aumentar ou reduzir a temperatura de forma a evitar perda de material por fervura; Manusear ácidos em capela de exaustão; 6.0 Procedimentos Durante a análise, preencher o formulário FOR/LEI/PL/011, com todas as informações pertinentes, permitindo a rastreabilidade dos dados da análise como datas, identificação das amostras, massas, reagentes, padrões, equipamentos, condições de leitura e analistas. 6.1 Preparo de soluções reagentes As soluções reagentes devem ser preparadas conforme descrito abaixo e identificadas, armazenadas e registradas conforme descrito no POP/LEI/PL/006. Todas as soluções reagentes têm validade de 6 meses a partir da data de seu preparo conforme Nota Técnica nº 016/2011. As soluções podem ser preparadas em quantidades diferentes das descritas a seguir, em função do volume de análises. Impresso por: Cópia não controlada Página 3/13

4 6.1.1 Solução de nitrato de magnésio (MgNO 3 50 % m/v) Pesar 250 g de nitrato de magnésio hexahidratado [Mg(NO 3 ) 2.6H 2 O], dissolver em água deionizada, transferir para um balão volumétrico de 500 ml e completar o volume com água deionizada, homogeneizando Ácido nítrico (HNO 3 1:1) Diluir 500 ml de ácido nítrico concentrado em 500 ml de água deionizada e homogeneizar Ácido clorídrico (HCl 4,5 mol/l) Diluir 373 ml de ácido clorídrico fumegante concentrado com água deionizada para volume final de 1000 ml e homogeneizar Ácido clorídrico (HCl 1:1) Diluir cerca de 500 ml de ácido clorídrico fumegante concentrado com água deionizada para volume final de 1000 ml e homogeneizar Ácido clorídrico (HCl 1:10) Diluir cerca de 100 ml de ácido clorídrico fumegante com água deionizada para volume final de 1000 ml e homogeneizar Solução de iodeto de potássio (KI 5% m/v) e ácido ascórbico (C 8 H 8 O 6 5% m/v) Pesar em um mesmo recipiente 1,25 g de iodeto de potássio e 1,25g de ácido ascórbico, dissolver com um pouco de água deionizada, transferir para um balão volumétrico de 25 ml, completar o volume com água deionizada e homogeneizar. Esta solução deve ser preparada imediatamente antes do uso, devido à instabilidade da mesma. Impresso por: Cópia não controlada Página 4/13

5 6.1.7 Solução de hidróxido de sódio (NaOH 12,5% m/v) Pesar 12,5 g de hidróxido de sódio (NaOH). Dissolver em água deionizada, utilizando banho de gelo. Transferir para um balão volumétrico de 100 ml, completar o volume com água deionizada e homogeneizar Solução de borohidreto de sódio (NaBH 4 0,2% m/v) Pesar 1 g de borohidreto de sódio dissolver com água deionizada, adicionar 2 ml da solução de NaOH 12,5% m/v, transferir para um balão volumétrico de 500 ml, completar o volume com água deionizada e homogeneizar. Esta solução deve ser preparada imediatamente antes do uso devido à instabilidade da mesma. 6.2 Preparo de soluções padrões As soluções padrões devem ser preparadas conforme descrito abaixo e identificadas, armazenadas e registradas conforme descrito no POP/LEI/PL/004. Todas as soluções padrões deverão ser utilizadas no dia de seu preparo. Geralmente as soluções padrões são acidificadas a 1% v/v de HNO 3 para sua conservação, porém o ácido nítrico não deve ser adicionado aos padrões de As, pois interfere na etapa de redução de As V a As III. As soluções padrões podem ser preparadas em quantidades diferentes das descritas a seguir, em função do volume de análises Solução padrão de adição de arsênio (As 1 mg/l) Pipetar 50 L da solução padrão estoque de Arsênio (1000 mg/l), transferir para balão volumétrico calibrado de 50 ml, completar o volume com água deionizada e homogeneizar Solução padrão de adição para recuperação de Arsênio em rim bovino, suíno e músculo de aves (10 mg/l) Pipetar 100 µl da solução de padrão estoque de Arsênio (1000 mg/l), transferir para balão volumétrico calibrado de 10 ml, completar o volume com água deionizada e homogeneizar. Impresso por: Cópia não controlada Página 5/13

6 6.2.3 Soluções padrões de uso para curva de calibração de arsênio Preparar 5 soluções padrões nas concentrações de 2 g/l, 4 g/l, 6 g/l, 8 g/l e 10 g/l pipetando alíquotas de 50 L, 100L, 150L, 200 L e 250L, respectivamente, da solução padrão de adição de Arsênio de 1 mg/l (6.2.1) e transferir para balões volumétricos calibrados de 25 ml. Preparar também o branco da curva somente com a adição da mesma proporção dos reagentes usados na preparação dos padrões. Em seguida, adicionar 5 ml da solução de ácido clorídrico 1:1 (item 6.1.4) e 2,5mL da solução de iodeto de potássio (KI 5% m/v) e ácido ascórbico (C 8 H 8 O 6 5% m/v) (item 6.1.6) e homogeneizar. Após aproximadamente 45 minutos, completar os volumes dos balões com água deionizada. Este tempo é necessário para que ocorra a redução de todo o As V a As III para posterior formação do hidreto de arsênio III (AsH 3 ). Obs.: Preparar o branco da curva somente com a adição da mesma proporção dos reagentes usados na preparação dos padrões. 6.3 Abertura das amostras As amostras são preparadas de acordo com a IP/LEI/PL/001 e digeridas para análise conforme descrito abaixo Pesar, conforme IS/LEI/PL/015, entre 4,500 e 5,500 g da amostra em cadinho de borossilicato de aproximadamente 50 ml e anotar o peso exato Pesar duas alíquotas entre 4,500 e 5,500 g de uma amostra branca da matriz em análise previamente selecionada pelo setor conforme POP/LEI/PL/005. Uma alíquota será utilizada como branco e a outra será utilizada como amostra fortificada para estimar a recuperação A recuperação deverá ser estimada em um dos três níveis conforme descrito no POP/LEI/PL/009. Verificar na PLN/LEI/PL/001 o nível estudado na batelada anterior e adotar um nível diferente para a Impresso por: Cópia não controlada Página 6/13

7 análise em curso. As alíquotas devem ser pipetadas da solução padrão de adição para recuperação de Arsênio em rim bovino, suíno e músculo de aves (10 mg/l) (item 6.2.2), e devem ser adicionadas de acordo com o quadro 1. Matriz Rim Bovino e suíno Músculo de Aves Quadro 1 - Valores das alíquotas para adição na recuperação para os diferentes níveis Analito Concentração Nível Inferior Nível Intermediário Nível Superior Alíquota (µl) Concentração Alíquota (µl) Concentração Alíquota (µl) As 500, , , As 250, , , Adicionar 4 ml de solução de nitrato de magnésio 50% (6.1.1). Não há necessidade de homogeneizar com bastão de vidro Secar em chapa elétrica para evaporação da fase líquida, cuidando para evitar a perda de material por fervura. Após completar a evaporação, elevar a temperatura da chapa na sua capacidade total para que a amostra seja carbonizada ao máximo. Transferir para o forno mufla para calcinar a uma temperatura entre 530 e 570 ºC por 12 a 16 horas, tomando o cuidado de fazer a transferência com o forno ainda frio para que a temperatura se eleve gradualmente, evitando o choque térmico Após a calcinação, resfriar as amostras, adicionar 2 ml da solução de HNO 3 1:1 (6.1.2) para o clareamento dos resíduos de carbono das cinzas e em seguida, evaporar o ácido em chapa elétrica cuidando para evitar a perda de material por fervura e após a evaporação completa do ácido elevar a temperatura da chapa ao máximo de modo a obter secura total do resíduo. Retornar ao forno mufla por mais 2 horas a uma temperatura de cerca de entre 530 e 570 ºC. Se os resíduos gerados não apresentarem um clareamento total da carbonização, repetir novamente este procedimento Adicionar 10 ml da solução de ácido clorídrico 4,5 mol/l (6.1.3), aquecendo em chapa elétrica cuidando para evitar a perda de material por fervura, para dissolução e redução do volume. Transferir para Impresso por: Cópia não controlada Página 7/13

8 tubos graduados de 15 ml, lavando os cadinhos e completando o volume com solução de ácido clorídrico 4,5 mol/l (6.1.3) Pipetar alíquotas de 1000 µl da amostra de músculo de ave ou 150 µl da amostra de rim bovino e suíno, transferir para tubos graduados de 15 ml, adicionar 2 ml da solução de ácido clorídrico 1:1 (6.1.4) e mais 1 ml da solução de iodeto de potássio (KI 5% m/v) e ácido ascórbico (C 8 H 8 O 6 5% m/v) (6.1.6). Agitar e aguardar cerca de 45 minutos (ver item 6.2.3) antes de completar o volume para 10 ml com água deionizada. 6.4 Detecção e quantificação Otimizar o EAA e o FIAS conforme IT/LEI/PL/015. Ajustar o sistema de injeção de fluxo com as soluções de borohidreto de sódio 0,2% (6.1.8), ácido clorídrico 10% (6.1.9), padrões e amostras para geração de hidretos de arsênio que serão detectados pelo sistema EAA Na opção de edição de métodos do software do equipamento, programar a análise para leitura de absorbância de arsênio de acordo com os seguintes itens: Espectrômetro Wavelength = nm Slit Width = 2,7 mm Sinal Measurement = Peak Height Smoothing = 19 points Parâmetros da leitura Time = 15 s Delay time = 0 s BOC time = 2 s Impresso por: Cópia não controlada Página 8/13

9 Replicates = 3 Operação Cell temperature = 900 C Sample volume = 500 µl Fazer a leitura de absorbância do branco da curva, dos padrões e das amostras. Se necessário, efetuar diluições nas amostras que apresentarem leituras de absorbância acima da leitura de absorbância do padrão de maior concentração. Os padrões da curva de calibração devem ser lidos três vezes separadamente de modo aleatório sendo que em cada leitura é feita com uma única injeção, enquanto que as amostras podem ser lidas em qualquer ordem e em uma única injeção por amostra. A média das leituras deve ser usada para o cálculo da concentração final. As replicatas de leitura (três replicatas) que o equipamento realiza não devem ter RSD superior a 10%. Caso esse critério não seja atendido, deve-se refazer a leitura. Persistindo o problema, o responsável pelo LEI deve ser informado e avaliar tecnicamente a situação. 6.5 Pontos críticos Peso exato da amostra deve estar na faixa de 4,500 a 5,500 g; Para secagem dos cadinhos com amostra, evaporação do ácido nítrico, dissolução da cinza etc. cuidar para que não haja perda de material por fervura; Transferência quantitativa das amostras para os tubos graduados de 15 ml Preparação criteriosa das soluções padrões. 7.0 Resultados 7.1 Critérios de aceitabilidade dos resultados Coeficiente de determinação (R 2 ) da curva de calibração: 0, Recuperação é de 80 a 110%, conforme POP/LEI/PL/ Resíduos dos pontos da curva de calibração não devem ser superiores a 10%. Impresso por: Cópia não controlada Página 9/13

10 7.2 Cálculos e emissão dos resultados Transcrever os dados de absorbância e concentração das soluções padrão de uso e das amostras na planilha PLN/LEI/PL/001 - Cálculo de concentrações de As, Pb e Cd, conforme a IS/LEI/PL/008 (Preenchimento da PLN/LEI/PL/001- Cálculo de concentrações de As, Pb e Cd). Avaliar no gráfico o resultado do coeficiente de correlação (entre x e y) e o teste de resíduos. Caso não esteja dentro do aceitável (R 2 >0,995) ou os resíduos diferirem de 10% do valor medido, repetir a leitura da curva de calibração utilizando os mesmos padrões e, se ainda assim o problema persistir, preparar novos padrões para construção de uma nova curva de calibração. Repetir as leituras das amostras com a nova curva. Se estiver adequado, terminar o preenchimento da planilha. A planilha ajusta os dados da curva pelo Método dos Mínimos Quadrados Ordinários (MMQO) ou Ponderado (MMQP), conforme os dados sejam homo ou heterocedásticos; calcula o fator de recuperação do dia (caso o resultado da recuperação não esteja dentro do aceitável 80 a 110% a, deve-se repetir a análise, observando criteriosamente o método e os pontos críticos) e corrige o resultado de acordo com a recuperação; para resultados menores que o limite de quantificação ela emite o resultado NQ (não quantificável). Além destes parâmetros a planilha calcula o valor de incerteza padrão associado ao resultado da análise através da abordagem top-down (conforme descrito no POP/LEI/PL/011) e o valor de incerteza máximo aceitável de acordo com o POP/LEI/PL/011. Os resultados são calculados, conforme POP/LEI/PL/002, mediante correção de diluições, massa de amostra e da recuperação através da planilha PLN/LEI/PL/001, e lançados no FOR/LEI/PL/014, e em seguida lançados no Sistema eletrônico SIGLA (Sistema de Informações Gerenciais para Laboratório de Resíduos e Contaminante em Alimentos). No SIGLA não há a possibilidade de lançar os resultados de incerteza, estas serão apenas calculadas e arquivadas. Os parâmetros de desempenho do método estão apresentados no REL/VAL/LEI/PL/002 (Relatório da revalidação do método de análise de arsênio em tecido animal por espectrometria de absorção atômica por geração de hidretos). Alguns desses parâmetros, assim como algumas incertezas, estão apresentados no quadro 2. Impresso por: Cópia não controlada Página 10/13

11 Quadro 2 Parâmetros e incertezas para o método de determinação de As em rim bovino, suíno e músculo de ave Matriz LMR Limite de detecção Limite de quantificação Incerteza de precisão intermediária do LMR Incerteza padrão do LMR Incerteza expandida do LMR * Rim bovino e suíno ,0 101,9 68,0 71,8 144 Músculo ,4 12,9 26 de ave * Incerteza expandida calculada com probabilidade de abrangência de 95% e com fator k = Responsabilidades Cabe ao responsável pelo Laboratório de Elementos Inorgânicos LANAGRO/MG assegurar: A elaboração, emissão, distribuição de cópias e, quando necessário, a revisão deste MET. O devido treinamento para execução do referido MET. A execução deste MET é de responsabilidade do analista, qualquer alteração ocorrida durante a análise, deve ser registrada a fim de garantir a rastreabilidade. A responsabilidade por autorizar desvios no método cabe ao responsável técnico ou seu substituto. A responsabilidade pela assinatura dos certificados oficiais de análise deve ser verificada na matriz de competências. 9.0 Referências Impresso por: Cópia não controlada Página 11/13

12 Nota técnica nº 016/2011 LEI/LANAGRO/MG Revisão bibliográfica Estabilidade de soluções reagentes e padrões Documentos referenciados IP/LEI/PL/001-Preparo de amostras para análise do PNCRC IS/LEI/PL/008-Preenchimento da PLN/LEI/PL/001- Cálculo de concentrações As, Pb e Cd IS/LEI/PL/015-Procedimentos para pesagem de amostras de tecido animal e mel IT/LEI/PL/015-Sistema de injeção de fluxo - Perkin Elmer FIAS 400 POP/LEI/PL/002-Controle de amostras e emissão de resultados POP/LEI/PL/004-Controle de padrões e soluções padrão POP/LEI/PL/005-Controle de amostras brancas e amostras naturalmente contaminadas POP/LEI/PL/006-Controle de reagentes e soluções reagentes POP/LEI/PL/009-Garantia da qualidade de resultados de análise POP/LEI/PL/010-Controle de micropipetas POP/LEI/PL/011-Requisitos para validação de métodos de ensaio de elementos inorgânicos 11.0 Anexos referenciados FOR/LEI/PL/011-Dados brutos de análises FOR/LEI/PL/014-Registros de Amostras e Resultados de Análises do PNCR - Grupo 400 PLN/LEI/PL/001-Cálculo de concentrações de As, Pb e Cd em ppb REL/VAL/LEI/PL/002-Relatório da revalidação do método de análise de As em tecido animal por espectrometria de absorção atômica por geração de hidretos 12.0 Informações de registro Cálculo de concentrações de As, Pb e Cd em ppb (PLN/LEI/PL/001) Dados Brutos de Análises (FOR/LEI/PL/011) Registro de Amostras e Resultados de Análises do PNCR - Grupo 400 (FOR/LEI/PL/014) 13.0 Arquivos anexados Não aplicável 14.0 Controle de alterações Item Alteração 1.0 Alteração na faixa de trabalho para rim bovino e suíno Alteração de massa e volumes utilizados no preparo da solução, porém mantendo-se a mesma proporção Alteração do volume de padrão pipetado e do balão, mantendo-se a mesma proporção O item Solução padrão de adição para recuperação de Arsênio em rim suíno (100 mg/l) foi integrado ao Solução padrão de adição para recuperação de Arsênio em rim bovino, suíno e músculo de aves (10 mg/l) Impresso por: Cópia não controlada Página 12/13

13 As informações sobre as soluções padrão a serem pipetadas foram reescritas. - No quadro 1 as alíquotas para o rim suíno foram alteradas passando a ser as mesmas do rim bovino A alíquota de amostra de rim suíno pipetada passa a ser 150 µl Reestruturação do item Correção dos procedimentos de leitura de amostras e padrões e dos critérios pertinentes Correção do critério utilizado para avaliar os resíduos da curva de calibração Substituição de incerteza expandida por incerteza padrão - Atualização do código do relatório de validação REL/VAL/LEI/PL/ Reformulação do quadro 2. Impresso por: Cópia não controlada Página 13/13