Análise de resíduo de cádmio e chumbo em fígado e rim bovinos, suínos e de aves por espectrometria de absorção atômica
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- Thomaz Pacheco Lopes
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1 1.0 Objetivos e alcance Este método objetiva detectar e quantificar resíduos de cádmio e chumbo em fígado e rim bovinos, suínos e de aves empregando de chama. O presente método trabalha na faixa de 0,027 a 1,000 mg/kg para Cd em fígado bovino, suíno e de aves, 0,027 a 2,000 mg/kg para Cd em rim bovino, suíno e de aves e 0,155 a 1,000 mg/kg para Pb em fígado e rim bovino, suíno e de aves. 2.0 Fundamentos O método fundamenta-se na queima e calcinação da matéria orgânica do tecido, empregando nitrato de magnésio como modificador químico, com o objetivo de facilitar a calcinação e evitar a volatilização dos elementos seguido de uma segunda queima usando ácido nítrico como coadjuvante. A cinza obtida é dissolvida com ácido clorídrico, originando uma solução que será utilizada para determinação dos elementos por espectrofotometria de absorção atômica de chama (USDA,1986). 3.0 Reagentes, padrões, materiais e insumos 3.1 Reagentes - Ácido Clorídrico (HCl) fumegante 37% p.a; - Ácido Nítrico (HNO 3 ) 65% p.a; - Água deionizada e destilada ou de qualidade superior; - Amostra de fígado (bovino, suíno ou ave) branca para Cd; - Amostra de rim (bovino, suíno ou ave) branca para Cd; - Amostra de fígado ou rim (bovino, suíno ou ave) branca para Pb; - Nitrato de magnésio hexahidratado [Mg(NO 3 ) 2.6H 2 O] p.a.; 3.2 Padrões - Solução estoque de padrão de cádmio (Cd) para absorção atômica (1000 mg/l); Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 1/12
2 - Solução estoque de padrão de chumbo (Pb) para absorção atômica (1000 mg/l); 3.3 Materiais - Luva de nitrila; - Bandeja de aço inoxidável ou plástico; - Tesoura de aço inoxidável; - Bisturi de aço inoxidável ou faca de lâmina inoxidável; - Pinça de aço inoxidável; - Cadinhos de porcelana; - Espátula de aço inoxidável; - Béqueres de 250 ml; - Bastões de vidro; - Balões volumétricos calibrados de 25 ml; - Balões volumétricos de 500 ml e 1000 ml; - Provetas de 100 ml, 250 ml e 500 ml; - Tubos graduados de 15 ml; 3.4 Insumos - Gás acetileno para absorção atômica; - Ar comprimido filtrado; 4.0 Equipamentos - Freezer; - Balança analítica de três casas decimais com resolução de um miligrama ou melhor; - Micropipeta automática com capacidade de, pelo menos, 200 a 1000 μl devidamente calibrada e pronta para uso conforme POP/LEI/PL/010; - Câmara de exaustão ou capela; - Chapa aquecedora que promova a secagem e queima inicial do material; Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 2/12
3 - Mufla com programação de temperaturas; - Espectrômetro de Absorção Atômica de chama, Perkin Elmer Analyst 100; - Lâmpada de catodo oco ou descarga elétrica de cádmio; - Lâmpada de catodo oco ou descarga elétrica de chumbo; 5.0 Precauções analíticas Durante o processo analítico utilizar: - Freezers para congelamento de amostras que mantenham temperatura menor que -8 ºC; - Cadinhos de porcelana; - Chapa elétrica com dial que permita aumentar ou reduzir a temperatura de forma a evitar perda de material por fervura; - Manusear ácidos em capela de exaustão; 6.0 Procedimentos Durante a análise, preencher o formulário FOR/LEI/PL/011 com todas as informações pertinentes, permitindo a rastreabilidade dos dados da análise como datas, identificação das amostras, massas, reagentes, padrões, equipamentos, condição de leitura e analistas. 6.1 Preparo de soluções reagentes As soluções reagentes devem ser preparadas conforme abaixo e identificadas, armazenadas e registradas conforme POP/LEI/PL/006. As soluções reagentes têm validade de 6 meses a partir da data de seu preparo conforme Nota Técnica nº 016/2011. As soluções podem ser preparadas em quantidades diferentes das descritas a seguir, em função do volume de análises Nitrato de magnésio 6,67% Pesar em um béquer 66,7 g de Nitrato de Magnésio hexahidratado [Mg(NO 3 ) 2.6H 2 O], dissolver em água Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 3/12
4 deionizada, transferir para um balão volumétrico de 1000 ml e completar o volume com água deionizada, homogeneizando Ácido Nítrico (HNO 3 1:1) Diluir 500 ml de ácido nítrico p.a. concentrado com água deionizada para volume final de 1000 ml e homogeneizar Ácido Clorídrico 1 mol/l (HCl 1 mol/l) Diluir 84 ml de ácido clorídrico fumegante p.a. com água deionizada para volume final de 1000 ml e homogeneizar. 6.2 Preparo de soluções padrão As soluções padrão devem ser identificadas, armazenadas e registradas conforme descrito no POP/LEI/PL/004. As soluções padrão preparadas sem a adição de ácido devem ser utilizadas no dia de seu preparo. Se houver necessidade de guardá-las, acidificar a 1% v/v com HNO 3, ou seja, adicionar 500 µl de HNO 3 1:1 (item 6.1.2) durante o preparo no caso de balões de 25 ml. As soluções padrão acidificadas têm validade de 6 meses (Nota técnica nº 016/2011 LEI/LANAGRO/MG) Solução padrão de adição de cádmio (25 mg/l) e/ou chumbo (16 mg/l) Pipetar 625 μl da solução padrão estoque de cádmio de 1000 mg/l, e 400 μl da solução padrão estoque de chumbo de 1000 mg/l, transferir para balão volumétrico calibrado de 25 ml e completar o volume com água deionizada. Obs: As soluções padrão de adição de cádmio e chumbo podem ser preparadas em balões separados Soluções padrões de uso para a curva de calibração de cádmio e chumbo Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 4/12
5 Preparar 5 soluções padrões nas concentrações de 0,25 mg/l; 0,50 mg/l; 0,75 mg/l, 1,0 mg/l e 1,25 mg/l para o cádmio, e 0,16 mg/l, 0,32 mg/l, 0,48 mg/l, 0,64 mg/l e 0,80 mg/l para o chumbo, pipetando 250 μl, 500 μl, 750 μl, 1000 μl e 1250 μl da solução padrão de adição de cádmio (25 mg/ml) e/ou chumbo (16 mg/l) (item 6.2.1) para balões volumétricos calibrados de 25 ml e completar o volume com água deionizada. Obs: Os volumes pipetados podem ser recalculados de acordo com a disponibilidade de balões volumétricos calibrados do setor. 6.3 Abertura das amostras As amostras são preparadas de acordo com a IP/LEI/PL/001, e digeridas para análise conforme descrito abaixo Pesar, conforme IS/LEI/PL/015 uma massa entre 14,500 e 15,500 g da amostra (fígado ou rim) em cadinho de porcelana de aproximadamente 50 ml e anotar o peso exato Preparar duas alíquotas entre 14,500 e 15,500 g de uma amostra branca da matriz em análise previamente selecionada pelo setor conforme POP/LEI/PL/005. Uma alíquota será utilizada como branco e a outra será utilizada como amostra fortificada para estimar a recuperação A recuperação deverá ser estimada em um dos três níveis conforme descrito no POP/LEI/PL/009. Verificar na PLN/LEI/PL/001 o nível estudado na batelada anterior e adotar um nível diferente para a análise em curso. As alíquotas devem ser adicionadas em acordo com o quadro 01. As alíquotas devem ser pipetadas das soluções padrão de adição de Cd (25 mg/l) e/ou de Pb (16 mg/l) (item 6.2.1). Quadro 01: Valores das alíquotas para adição na recuperação para os diferentes níveis Nível Inferior Nível Intermediário Nível Superior Matriz Analito Concentração Alíquota Concentração Alíquota Concentração Alíquota (µg/kg) (µl) (µg/kg) (µl) (µg/kg) (µl) Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 5/12
6 Fígado Rim Cd 333, , , Pb 213, , , Cd 500, , , Pb 213, , , Adicionar 7,5 ml da solução de Nitrato de Magnésio 6,67% (item 6.1.1) em todas as amostras. Não há necessidade de homogeneizar com bastão de vidro Secar em chapa elétrica para evaporação da fase líquida, cuidando para evitar a perda de material por fervura. Após completar a evaporação, elevar a temperatura da chapa na sua capacidade total para que a amostra seja carbonizada ao máximo. Transferir para o forno mufla para calcinar a uma temperatura entre 530 e 570 C por 12 a 16 horas, tomando o cuidado de fazer a transferência com o forno ainda frio para que a temperatura se eleve gradualmente, evitando o choque térmico Após a calcinação, resfriar as amostras, adicionar 2 ml da solução de Ácido Nítrico (HNO 3 1:1) (item 6.1.2) para o clareamento dos resíduos de carbono das cinzas, lavando o resíduo das paredes do cadinho com o HNO 3. Evaporar o ácido em chapa, cuidando para evitar perda de material por fervura. Após a evaporação completa do ácido, elevar a temperatura da chapa ao máximo de modo a obter secura total do resíduo. Retornar ao forno mufla por mais 2 horas a uma temperatura entre 530 e 570 C. Se os resíduos gerados não apresentarem um clareamento total da carbonização, repetir novamente este procedimento Após o tratamento com HNO 3 1:1, resfriar e adicionar cerca de 10 ml da solução de ácido clorídrico 1 mol/l (HCl 1 mol/l) (item 6.1.3) e aquecer em chapa elétrica, até dissolução do resíduo e redução do volume do ácido para cerca da metade, cuidando para evitar perda de material por fervura. Resfriar e transferir para tubos graduados de 15 ml, lavando os cadinhos e completando o volume com solução de ácido clorídrico 1 mol/l (HCl 1 mol/l) (item 6.1.3). 6.4 Detecção e quantificação Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 6/12
7 6.4.1 Otimizar o espectrofotômetro de absorção atômica conforme instrução de trabalho específica do equipamento Programar o equipamento para leitura de cádmio utilizando chama de ar acetileno, considerando: - Lâmpada de cádmio; - Comprimento de onda = 228,8 nm e Fenda = 0,7 nm; - Tempo de integração = 0,5 segundos; - Sinal = absorbância; - Leitura em absorbância; - Registro de leitura eletrônico; - Utilizar correção de fundo pela lâmpada de deutério Fazer a leitura das Soluções padrões de uso para a curva de calibração de cádmio e chumbo (item 6.2.2) em absorbância. A leitura destas soluções deve ser feita três vezes separadamente (no início das leituras, após leitura de metade das amostras e no final da leitura das amostras). Não é necessário ler as amostras três vezes separadamente, mas o número de replicatas de leitura deve ser obedecido (3 ou 5) Fazer as leituras das amostras e se necessário, efetuar diluições utilizando água deioniza da para obter leituras de absorbância dentro do intervalo da curva de calibração Programar o equipamento para leitura de chumbo utilizando chama de ar acetileno, considerando: - Lâmpada de chumbo; - Comprimento de onda = 283,3 nm e Fenda = 0,7 nm; - Tempo de integração = 0,5 segundos; - Sinal = absorbância; - Leitura em absorbância; - Registro de leitura eletrônico. Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 7/12
8 6.4.6 Fazer a leitura das Soluções padrões de uso para a curva de calibração de cádmio e chumbo (item 6.2.2) em absorbância. A leitura destas soluções deve ser feita três vezes separadamente (no início das leituras, após leitura de metade das amostras e no final da leitura das amostras). Não é necessário ler as amostras três vezes separadamente, mas o número de replicatas de leitura deve ser obedecido (3 ou 5) Fazer leituras das amostras e se necessário, efetuar diluições utilizando água deionizada para obter leituras de absorbâncias dentro do intervalo da curva calibração. 6.5 Pontos críticos Peso exato da amostra deve estar na faixa de 14,500 a 15,500 g Para secagem dos cadinhos com amostra, evaporação do ácido nítrico, dissolução da cinza etc. cuidar para que não haja perda de material por fervura Transferência quantitativa das amostras para os tubos graduados de 15 ml Preparação criteriosa das soluções padrões. 7.0 Resultados 7.1 Critérios de aceitabilidade dos resultados Coeficiente de determinação (R 2 ) da curva de calibração: 0, Recuperação é de 80 a 110%, conforme POP/LEI/PL/ Resíduos dos pontos da curva de calibração não devem diferir em 10% do valor medido. 7.2 Cálculo dos resultados Transcrever os dados de absorbância e concentração das soluções padrão de uso e das amostras na planilha PLN/LEI/PL/001 conforme a IS/LEI/PL/008. Avaliar o resultado do coeficiente de correlação (R 2 ) da curva de calibração e o teste de resíduos. Caso não esteja dentro do aceitável (R 2 >0,995) ou os Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 8/12
9 resíduos forem diferirem de 10% do valor medido, repetir a leitura da curva de calibração utilizando os mesmos padrões e, se ainda assim o problema não for resolvido preparar novos padrões para construção de uma nova curva de calibração. Repetir as leituras das amostras com a nova curva. Se estiver adequado, terminar o preenchimento da planilha. A planilha ajusta os dados da curva pelo Método dos Mínimos Quadrados Ordinários (MMQO) ou Ponderado (MMQP), conforme os dados sejam homo ou heterocedásticos; calcula o fator de recuperação do dia (caso o resultado da recuperação não esteja dentro do aceitável 80 a 110% -, deve-se repetir a análise, observando criteriosamente o método e os pontos críticos) e corrige o resultado de acordo com a recuperação; para resultados menores que o limite de quantificação ela emite o resultado NQ (não quantificado). Além destes parâmetros a planilha calcula o valor de incerteza expandida (k=2) associado ao resultado da análise através da abordagem top-down e botton-up e o valor de incerteza máximo aceitável de acordo com o POP/LEI/PL/011. Os resultados são calculados, conforme POP/LEI/PL/002, mediante correção de diluições, massa de amostra e da recuperação através da planilha PLN/LEI/PL/001 e lançados no FOR/LEI/PL/014, e lançados no Sistema eletrônico SIGLA (Sistema de Informações Gerenciais para Laboratório de resíduos e contaminantes em Alimentos) conforme IS/LEI/P/017. No SIGLA não há a possibilidade de lançar resultados de incerteza, estas serão apenas calculadas e arquivadas. Os parâmetros de desempenho do método constantes no REL/LEI/PL/001 estão resumidos no Quadro 2 e os valores de incertezas no Quadro 3. Quadro 2 - Parâmetros de desempenho para metódos de análise de Cd e Pb em fígado e rim bovino, suíno e ave Analito (LMR) Cd (0,500 mg/kg) Matriz Fígado bovino, suíno e ave 0,5 LMR Nível investigado 1,0 LMR 1,5 LMR HORRAT r * 0,48 0,48 0,44 HORRAT R * 0,24 0,74 0,76 Recuperação (n = 30, %) 101 ± ± ± 15 Limite de Detecção (mg kg -1 ) Limite de Quantificação (mg kg -1 ) CCα (mg kg -1 ) CCβ (mg kg -1 ) 0,006 0,027 0,53 0,57 Cd Rim bovino, HORRAT r 0,34 0,18 0,32 0,007 0,027 1,16 1,32 Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 9/12
10 (1,000 mg/kg) Pb (0,500 mg/kg) suíno e ave Fígado e rim bovino, suíno e ave HORRAT R 0,32 0,19 0,22 Recuperação (n = 30, %) 89 ± 6 89 ± 3 83 ± 4 HORRAT r 1,01 0,75 0,71 HORRAT R 0,81 0,56 0,57 0,043 0,155 0,55 0,60 Recuperação 85 ± ± ± 10 (n = 30, %) *HORRAT r : indicador de repetitividade; HORRAT R : indicador de reprodutibilidade intralaboratorial. Ambos os valores de HORRAT foram calculados com número de amostras n=18. De acordo com a legislação valores de HORRAT são aceitos até um valor de 2. Quadro 3. Valores de incerteza calculados para a calibração e para a reprodutibilidade intra-laboratorial para cada conjunto analito / matriz. Matriz Analito LMR (mg/kg) Incerteza (mg/kg) Calibração Reprodutibilidade Intralaboratorial No LMR Fígado bovino, suíno e ave Cd 0,500 0,004 0,062 0,062 Rim bovino, suíno e ave Cd 1,000 0,004 0,031 0,032 Fígado e rim bovino, suíno e ave Pb 0,500 0,006 0,051 0, Responsabilidades Cabe ao responsável pelo Laboratório de Elementos Inorgânicos LANAGRO/MG assegurar: - A elaboração, emissão, distribuição de cópias e, quando necessário, a revisão deste MET. - O devido treinamento para execução do referido MET. - A execução deste MET é de responsabilidade do analista, qualquer alteração ocorrida durante a análise, deve ser registrada a fim de garantir a rastreabilidade. - A responsabilidade por autorizar desvios no método cabe ao responsável técnico ou seu substituto. - A responsabilidade pela assinatura dos certificados oficiais de análise deve ser verificada na matriz de competências. 9.0 Referências Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 10/12
11 UNITED STATES Department of Agriculture. Food Safety and Inspection Service. Determination of trace elements in animal tissue by atomic absorption spectrophotometry: Chemistry Laboratory GuidebooK Revised Basic UNITED STATES Department of Agriculture. Food Safety and Inspection Service. Methods of analysis for veterinary drug residues: validation guidelines p. (Draft). REL/LEI/PL/001 - Relatório da revalidação do método de análise de cádmio e chumbo em tecido animal por. Laboratório de Elementos Inorgânicos, Lanagro-MG Nota técnica nº 016/2011 LEI/LANAGRO/MG Revisão bibliográfica Estabilidade de soluções reagentes e padrões Documentos referenciados IP/LEI/PL/001-Preparo de amostras para análise do PNCRC IS/LEI/PL/008-Preenchimento da PLN/LEI/PL/001- Cálculo de concentrações As, Pb e Cd IS/LEI/PL/015-Procedimentos para pesagem de amostras de tecido animal e mel IS/LEI/PL/017-Instrução operacional de registro e inclusão de resultados no SIGLA POP/LEI/PL/002-Controle de amostras e emissão de resultados POP/LEI/PL/004-Controle de padrões e soluções padrão POP/LEI/PL/005-Controle de amostras brancas e amostras naturalmente contaminadas POP/LEI/PL/006-Controle de reagentes e soluções reagentes POP/LEI/PL/009-Garantia da qualidade de resultados de análise POP/LEI/PL/010-Controle de micropipetas POP/LEI/PL/011-Requisitos para validação de métodos de ensaio de elementos inorgânicos 11.0 Anexos referenciados FOR/LEI/PL/011-Dados brutos de análises FOR/LEI/PL/014-Registros de Amostras e Resultados de Análises do PNCR - Grupo 400 PLN/LEI/PL/001-Cálculo de concentrações de As, Pb e Cd em ppb 12.0 Informações de registro Cálculo de concentrações de As, Pb e Cd em ppb (PLN/LEI/PL/001) Dados Brutos de Análises (FOR/LEI/PL/011) Registro de Amostras e Resultados de Análises do PNCR - Grupo 400 (FOR/LEI/PL/014) 13.0 Arquivos anexados Não aplicável 14.0 Controle de alterações Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 11/12
12 Item Alteração Reformulado com remoção da descrição de como realizar a fortificação para estimar a recuperação - Inclusão de item que descreve a preparação das amostras para a estimativa de recuperação - Inclusão do Quadro Era o item Era o item Era o item Era o item Quadro 1 alterado para Quadro 2 - Quadro 2 alterado para Quadro 3 Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 12/12
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