Fenómenos de Transporte. Sedimentação

Fenómenos de Transporte Sedimentação

Sedimentação: para quê? Sedimentação movimento de uma partícula por acção de um campo centrífugo Técnica usada para separar purificar analisar espécies celulares (proteínas, ácidos nucleicos, cromossomas, mitocôndrias) polímeros Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 2

Sedimentação: num campo gravitacional Num fluido a força que promove a queda da partícula Peso: m = massa da partícula sedimentada Força de impulsão : partícula mg m = densidade do fluido m = volume efectivo da Peso Impulsão F d mg m g m1 g Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 3

Sedimentação: num campo gravitacional F f v t Força de atrito velocidade terminal que de atinge quando dv/dt=0 A força de atrito contrapõe-se ao movimento No equilíbrio as forças igualam-se: f v t v t m1 g m1 g f Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 4

Sedimentação: numa ultracentrífuga São aplicados os mesmos princípios e fórmulas só que a aceleração da gravidade (g) é substituída pela velocidade angular (w 2 r) v t m1 w f 2 r Vamos ver Porquê Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 5

Sedimentação numa ultracentrífuga Estado inicial Alta velocidade de rotação Baixa velocidade de rotação Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 6

Sedimentação: numa ultracentrífuga Aplicando uma força centrífuga e causando um movimento de rotação à partícula, com uma frequência angular, ela é fortemente acelerada e atinge rapidamente a velocidade terminal A velocidade terminal atinge-se quando as forças envolvidas ficarem balanceadas F total = F d + F b + F c = 0 Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 7

Sedimentação: numa ultracentrífuga F total = F d + F b + F c = 0 F c - força centrífuga = 2 r m (onde m reperesenta a massa da partícula e - 2 r representa a aceleração centrípeta) F d - força de fricção (viscosidade) = -f v (onde f é o coeficiente de fricção e v a velocidade terminal) F b - força de impulsão = - 2 r m 0 (onde m 0 é a massa do solvente deslocado pela partícula) Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 8

Sedimentação: numa ultracentrífuga Relembre: F total = F d + F b + F c = 0 Então fv 2 r m 0 2 rm 0 Rearranjando 2 r m m fv 0 0 m 0 = volume específico parcial da partícula densidade = Volume específico parcial = densidade da solução Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 9

Sedimentação: numa ultracentrífuga Substitua na equação anterior o m 0 : 2 r m m fv 0 0 Colocar os parâmetros moleculares de um lado e os parâmetros experimentais do outro Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 10

Sedimentação: Coeficiente de sedimentação s vt 2 r _ M 1 N f AV sol M massa molecular S Coeficient e de sedimentação m N AV Definição de coeficiente de sedimentação velocidade terminal ( vt ) s aceleração ( 2 r) IMPORTANTE O coeficiente de sedimentação depende da massa molecular (M) e do coeficiente de fricção (f) Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 11

Coeficiente de sedimentação: significado O coeficiente de sedimentação é a distância (cm) percorrida pela molécula, durante 1 segundo, sob efeito de uma força de 10-2 N kg -1, no solvente água, a 293 K. S depende: a) Propriedades moleculares da molécula. m - massa molecular - volume específico parcial f forma da molécula b) Propriedades da solução. - densidade - viscosidade (porque f depende de ) Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 12

Coeficiente de sedimentação experimental Unidades s v cm / s 2 aceleração cm / s O coeficiente de sedimentação experimental sofre influência da temperatura e da viscosidade Como s depende das propriedades da solução, os valores medidos, devem ser convertidos para as condições padrão, (temperatura é 20 C e o solvente é a água) (para poderem ser comparáveis para diferentes moléculas) S 20,w (Svedberg) 1s= 10-13 segundos Nota: S 20,w é uma propriedade única da partícula e pode ser utilizado para avaliar mudanças conformacionais s Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 13

Relação entre difusão e sedimentação Segundo Stokes A equação de Einstein Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 14

Velocidade de sedimentação: permite calcular EM RESUMO. Coeficiente de sedimentação Coeficiente de difusão (se os componentes sedimentados são bem preparados) Massa efectiva dos componentes do soluto Formato das partículas (assimetria) Homogeneidade e estados de agregação Constantes de associação e estequiometria Em condições experimentais diversas!!!! Sem interferências externas!!!! Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 15

Relação entre s e M A velocidade de sedimentação de uma partícula depende da sua M Quanto maior for M maior o valor de s O coeficiente de atrito f, reduz o valor de s Quanto menos globular for uma proteína menor a sua velocidade de sedimentação Quanto maior a densidade de uma partícula maior a sua velocidade de sedimentação Quanto maior for o valor da componente (1-) maior a velocidade de sedimentação M srt _ D1 Nota: Os itens 2 e 3 são importantes para o estudo estrutural de proteínas quando comparadas com proteínas com a mesma massa Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 16

Determinação do Coeficiente de Sedimentação: métodos O valor de S deve ser extrapolado a uma diluição infinita por forma a obter parâmetros molecularmente significativos Método da velocidade de sedimentação Sedimentação de fronteira Sedimentação de uma macromolécula numa solução homogénea Sedimentação em gradiente (zonal, ou em faixas ou em bandas) Sedimentação de uma macromolécula em gradiente de concentração Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 17

Método da velocidade de sedimentação Fornece informação hidrodinâmica sobre as moléculas em solução Parâmetros experimentalmente determinados: Coeficiente de sedimentação, s, a constante de difusão, D, e em alguns casos, a massa molecular, M. Se a massa molecular é conhecida, o coeficiente de sedimentação pode ser usado para obter uma estimativa da forma molecular da molécula em solução Usado para grandes moléculas que difundem lentamente. A força de sedimentação deverá ser muito superior à força de difusão Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 18

Sedimentação de fronteira Começar com uma solução homogénea de macromolécula Como a solução é centrifugada na ultracentrífuga, as macromoléculas movimentam-se por acção desse campo, gerandose uma zona limite de solvente Seguindo essa faixa limite ao longo do tempo, podemos calcular o coeficiente de sedimentação s vt 2 r _ M 1 N f AV sol Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 19

Sedimentação de fronteira Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 20

Sedimentação de fronteira s 2,303 2 slope Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 21

Ultracentrifugação analítica: Aparelhagem usada Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 22

Velocidade de sedimentação limite: limitações ao método Dispersão das zonas limite (se a difusão se torna significativa) soluto -Difusão e sedimentação são duas formas de transporte do -A sedimentação gera gradiente, a difusão opõe-se a esse efeito Dificuldade de separar componentes em misturas complexas Necessita de equipamento caro Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 23

Difusão radial : um fenómeno que contribui para a limitação A difusão radial ocorre em consequência da forma que têm as células de sedimentação. Todas as moléculas (não importa em que posição estejam) difundirão na mesma extensão causando uma redução na densidade óptica observada. Para um dado tempo, esta difusão é a mesma em cada ponto da célula A Difusão radial pode ser observada através da redução do plateau nos sucessivos scans da absorvência Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 24

Efeito da difusão na sedimentação Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 25

Espalhamento de zonas : Difusão versus heterogeneidade Dificuldade de separar componentes em misturas complexas 1- Sistema com um componente ( as bandas espalham-se devido à difusão e dá um aspecto sigmoidal) 2- Sistema multicomponente ( os degraus que definem os perfis de cada componente podem perder definição quando aumenta a difusão) 3- Sistema multicomponente ou monocomponente? ( sem análises posteriores é impossível afirmar se o limite de espalhamento é devido à heterogeneidade de S ou se é devido à difusão) Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 26

Como obviar essas limitações? Utilize o mesmo método mas em gradiente de concentração Centrifugação por Zonas Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 27

Centrifugação em zonas ou pelo método da velocidade de sedimentação Preparação de um gradiente contínuo de densidade usando sacarose centrifugando uma solução de sacarose Aplicar a amostra sobre o gradiente. Recolher as fracções dos componentes separados Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 28

Velocidade de sedimentação em gradiente de concentração: vantagens e desvantagens Limitações: - não é exacta a medida da massa molecular Vantagens: - resolução completa dos componentes de uma mistura - relativamente barata Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 29

Sucrose Density Centrifugation of Cellular Membranes from G. violaceus S é determinado pelo deslocamento da banda, no tubo de centrífuga, com o tempo (A) Schematic of the sucrose density gradients used for separation; the dark shading at the bottom represents the area of sample application in 50% sucrose (w/w). (B) The gradient after 16 h of centrifugation at 160,000g displays an orange (1.07 g/ml) and a green (1.16 g/ml) membrane fraction. (C) A distinct band is formed from the green fraction in (B) when recentrifuged on the sucrose density gradient. (D) A third membrane fraction with an apparent density of 1.19 g/ml (corresponding to the outer membrane) is obtained when the boundary between the 48 and 50% layer is applied to a second sucrose gradient centrifugation. Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 30

Exercício Sedimentação

Exercício prático Calcular o coeficiente de sedimentação (s) e o coeficiente de fricção (f) para a E. Coli DNA ligase em soluções diluidas de tampão aquoso (20 mm de fosfato, 10 mm NH 4 Cl, ph 6,5 e temperatura de 20,6 C. Considere os seguintes dados: Peso Molecular = 74,000g/mol V molécula = 0,737 cm 3 /g tampão = 1,010 g/cm 3 a 20,6 C = 56,050 rpm T(min) x 1/2 log x 1/2 0 5,9110 0,7717 20 6,0217 0,7797 40 6,1141 0,7863 60 6,2068 0,7929 80 6,3040 0,7996 100 6,4047 0,8065 120 6,5133 0,8138 140 6,6141 0,8205 Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 32

Exercício Prático = 56,050 rpm x (2 radianos/revolução) (1 minuto/60 segundos) =5,87 x10 3 rad/segundo s 1 2,303d log x 2 dt 1/ 2 s 4 1 2,303x3,4210 min x 3 1 5,8710 rad / sx60s min 2 S= 2,31 x 10-11 segundos= 23,1 S Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 33

Exercício Prático Calcule agora o coeficiente de fricção f vt 2 x m1 s Primeiro calcule o valor de m m e. 74,000g / mol 1,2310 23 6,02310 moléculas / mol f f 19 1,2310 g1 0,7371,010 5,5710 5,8710 24 3 g / seg rad / seg 19 g Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 34

Fenómenos de Transporte MÉTODO DO EQUILÍBRIO DE SEDIMENTAÇÃO OU SEDIMENTAÇÃO ISOPÍCNICA

Sedimentação: Equilíbrio de sedimentação Baixas velocidades de rotação Balanço entre as forças de sedimentação e as forças de difusão (A amostra é simultaneamente sujeita a sedimentação e a difusão produzindo-se um gradiente que não variará até que o equilíbrio seja atingido) Não há transporte efectivo Não há influência da forma das partículas Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 36

Fenómenos de transporte: Equilíbrio Sedimentação Distribuição das moléculas num campo gravitacional ou centrífugo após atingir o equilíbrio O balanço entre a força de sedimentação numa dada direcção e o efeito aleatório da difusão origina um gradiente de concentração; a concentração no fundo do tubo é maior. O gradiente de concentração depende do peso molecular das moléculas Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 37

Sedimentação: equilíbrio de sedimentação Informação termodinâmica Sedimentação gradiente de concentração difusão Equilíbrio de gradiente de concentração: sedimentação é exactamente balanceada pela difusão (moléculas exponencialmente distribuídas ao longo da célula) Equilíbrio: J = 0 J = J sed + J difusão J J sed dif v c t D dc dx v c D v t t dc dx 0 2 m1 x f Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 38

Sedimentação: equilíbrio de sedimentação v t m 2 1 x f 2 D x RT M 1 2 D x M 1 c RT 1 c dc dx 1 dc c c c 1 2 1 dc c 2 RT 2 RT x M 1 x dc D dx M 1 xdx x 1 2 2 M 1 xdx RT ln c c 2 2 M 1 1 2RT x 2 2 x 2 1 Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 39

Sedimentação: equilíbrio de sedimentação Calcular M através do declive Ln c Declive = 2 2RT M 1 x 2 Nota: Este método não necessita da determinação de D Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 40

Equilíbrio de sedimentação: permite calcular Massa / peso molecular Homogeneidade em relação ao peso molecular Estados de agregação Estequiometria e constantes de equilíbrio para processos de associação Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 41

Equilíbrio de sedimentação: equilíbrio de gradiente de concentração Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 42

Equilíbrio de sedimentação: equilíbrio de gradiente de concentração Solução das macromoléculas preparada em solução de CsCl Centrifugação até ao equilíbrio produz um forte gradiente de CsCl e consequentemente um gradiente de densidade através do tubo Se a concentração de CsCl é correctamente escolhida as macromoléculas migram em banda através do gradiente do solvente até que (1- molécula )=0 Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 43

Centrifugação: equilíbrio de sedimentação com gradiente de concentração Solução das macromoléculas preparada em solução de CsCl Centrifugação até ao equilíbrio produz um forte gradiente de CsCl e consequentemente um gradiente de densidade através do tubo Se a concentração de CsCl é correctamente escolhida as macromoléculas migram em banda através do gradiente do solvente até que (1- molécula )=0 Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 44

Em RESUMO. M 1 v RT s D M 2RT d ln c 2 2 1 v dr Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 45

Relação entre o coeficiente de sedimentação e o peso molecular de proteínas Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 46

Forma, massa e densidade de proteínas /coeficiente de sedimentação Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 47

CONCLUSÃO Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 48

Fenómenos de Transporte ELECTROFORESE Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 49

Eletroforese: generalidades Transporte de partículas num campo eléctrico Técnica usada para separar e às vezes purificar macromoléculas que diferem na carga, conformação ou tamanho Aplicações: Separação de compostos com carga (aminoácidos, péptidos, proteínas, ácidos nucleícos). Carga dependente do ph do meio. Moléculas negativas e positivas movemse em direcções opostas ao campo eléctrico. Determinação da composição das proteínas por comparação com padrões electroforéticos Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 50

Separando fragmentos de DNA: Eletroforese em Gel Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 51

Eletroforese de Proteinas Séricas Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 52

Eletroforese: princípios gerais Movimento molecular sob acção de um campo eléctrico Num solvente não condutor: Força de eléctrica (Coulomb): F = qe q= Z e Força de fricção: F f = - f v Z = nº de cargas (sem dimensões) e = carga eléctrica (1,6022 x10-19 C) E= campo eléctrico (volt m -1 ) f = coeficiente de fricção (Kg s -1 ) v= velocidae de migração No equilíbrio: V = F e + F t = 0 Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 53

Como proceder? Aplica-se uma diferença de potencial e a partícula move-se na direcção do polo de carga oposta No início há resistência devido à viscosidade do meio mas a certa altura atinge-se um equilíbrio quando as forças electrostáticas atractivas se igualam à resistência ao fluxo. Então a mobilidade electroforética passa a ser constante Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 54

Recorde Mobilidade Electroforética (u) é a velocidade linear (v) por unidade de gradiente de potencial eléctrico (X) ou v X v E Z f mv 1 s 1 Traduz-se pela razão entre a velocidade da macromolécula (v) e o potencial eléctrico (E) que promove o movimento, ou Traduz-se pela razão entre a carga líquida da partícula (Z) e o seu coeficiente de fricção (f) Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 55

Mobilidade electroforética e carga da partícula Para uma molécula esférica Então: f 6r u Z 6r A mobilidade electroforética serve para medir a carga da partícula num meio não condutor Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 56

Eletroforese: mobilidade eletroforética Contudo... * molécula carregada rodeada por atmosférica iónica (dificulta a interpretação dos resultados de mobilidade) * molécula carregada altera o coeficiente de fricção Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 57

Mobilidade electroforética e peso molecular Pode-se usar a mobilidade electroforética para determinar o peso molecular? Os ácidos nucleicos podem ser separados de acordo com o peso molecular porque possuem uma carga de fosfato por cada base (nucleótido) Para as proteínas o número de cargas depende da composição dos aminoácidos e do ph do tampão As cadeias polipetídicas de determinado comprimento podem adquirir diferentes formas com diferentes coeficientes de fricção (f ) (é proporcional ao seu comprimento) Para usar a electroforese para determinar o peso molecular é necessário: Desnaturar as proteínas Introduzir uma carga em cada peptídeo Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 58

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Electroforese em gel: determinação do peso molecular das proteinas A carga e as propriedades hidrodinâmicas da proteína são função do seu peso molecular log M a bx M = peso molecular da proteína; X = distância de migração no gel (proporcional à mobilidade) a e b = constantes para um dado gel e um dado campo eléctrico Calibrar com proteínas de peso molecular conhecido Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 63

Em Resumo Física Aplicada 2013/14 MICF FFUP 64 Nota: desvios a esta relação ocorrem quando as proteínas se ligam a uma