EVELISE MARIA GARCIA PARHAM FARD AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DA ÁGUA MINERAL E DO PROCESSO DE ENVASE EM DUAS FONTES COMERCIAIS

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1 EVELISE MARIA GARCIA PARHAM FARD AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DA ÁGUA MINERAL E DO PROCESSO DE ENVASE EM DUAS FONTES COMERCIAIS Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Alimentos, do Setor de Tecnologia de Alimentos, da Universidade Federal do Paraná, como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre. Orientador: Prof. Giovani Mocelin, Ph.D CURITIBA 2007

2 EVELISE MARIA GARCIA PARHAM FARD AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DA ÁGUA MINERAL E DO PROCESSO DE ENVASE EM DUAS FONTES COMERCIAIS Dissertação aprovada como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Alimentos, da Universidade Federal do Paraná, pela Comissão formada pelos professores: Orientador: Prof. Dr. Giovani Mocelin Setor de Tecnologia, UFPR Prof a. Dr a. Ida Chapaval Pimentel Setor de Ciências Biológicas, UFPR Prof a. Dr a. Márcia Regina Beux Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, PUC-PR Curitiba, 13 de Agosto de 2007

3 ii Ao meu amor Benyamin, que sempre me incentivou e apoiou. Dedico.

4 iii AGRADECIMENTOS À Universidade Federal do Paraná e ao Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Alimentos pela oportunidade. Ao Professor Dr. Giovani Mocelin pela orientação, dedicação e ensinamentos. Ao Beny por estar sempre ao meu lado e acreditar em mim. Amo você. À minha mãe e minha irmã pelas palavras de incentivo. Amo vocês. Às fontes comerciais por toda receptividade desde o início do projeto e informações cedidas. Este apoio foi fundamental. Ao Serviço Autônomo Municipal de Água e Esgoto SAMAE de Jaraguá do Sul pelo incentivo à realização do curso de Mestrado e disponibilidade de recursos para o desenvolvimento deste trabalho. À empresa Laborclin pela doação do meio de cultura m-cp. À empresa 3M do Brasil pela doação de swabs e placas Petrifilm. Aos professores e colegas do Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Alimentos pelo aprendizado e troca de experiências. Aos técnicos dos Laboratórios do SAMAE, Magda, Olga, Rose e Vinicius, e aos operadores da ETA por toda colaboração e auxílio durante os experimentos. A todos aqueles que direta ou indiretamente colaboraram para a realização deste trabalho. Muito obrigada!

5 iv SUMÁRIO ABREVIATURAS...vi LISTA DE TABELAS...vii LISTA DE QUADROS...viii LISTA DE FIGURAS...ix LISTA DE ANEOS...x RESUMO...xi ABSTRACT...xii 1 INTRODUÇÃO JUSTIFICATIVA OBJETIVOS OBJETIVO PRINCIPAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS REVISÃO DA LITERATURA MICRORGANISMOS INDICADORES DE QUALIDADE NA ÁGUA MINERAL Bactérias heterotróficas Coliformes totais Coliformes termotolerantes e Escherichia coli Enterococcus Clostridios sulfito redutores a 46ºC BIOFILME MATERIAL E MÉTODOS MATERIAL METODOLOGIA Diagrama de fluxo Avaliação do risco das fontes comerciais IDENTIFICAÇÃO DE PERIGOS E PONTOS DE CONTROLE Análises físico-químicas e microbiológicas Monitoramento microbiológico de superfície Avaliação das características físicas da superfície interna das embalagens retornáveis de vinte litros

6 v Análise Estatística RESULTADOS E DISCUSSÃO DIAGRAMA DE FLUO AVALIAR O RISCO DAS FONTES COMERCIAIS ATRAVÉS DE LISTA DE VERIFICAÇÃO IDENTIFICAÇÃO DE PERIGOS E PONTOS DE CONTROLE ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS MONITORAMENTO MICROBIOLÓGICO DE SUPERFÍCIES AVALIAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DA SUPERFÍCIE INTERNA DAS EMBALAGENS RETORNÁVEIS DE VINTE LITROS CONCLUSÕES...45 REFERÊNCIAS...47

7 vi ABREVIATURAS ABINAM: Associação Brasileira da Indústria de Águas Minerais ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária APPCC: Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle BPF: Boas Práticas de Fabricação DNPM: Departamento Nacional de Produção Mineral PC: Ponto de Controle PCC: Ponto Crítico de Controle PET: Polietileno tereftalato POP: Procedimento Operacional Padronizado PP: Polipropileno UFC: Unidade Formadora de Colônia uh: Unidade de escala Hazen ut: Unidade de turbidez

8 vii LISTA DE TABELAS TABELA 1 DESCRIÇÃO DO PRODUTO ÁGUA MINERAL, PRESENTE NO RÓTULO DA EMBALAGEM NAS FONTES COMERCIAIS A E B TABELA 2 RESULTADO DO TESTE DE TUKEY PARA A COMPARAÇÃO DAS MÉDIAS DAS VARIÁVEIS TURBIDEZ E COR TABELA 3 NÚMERO DE AMOSTRAS DE ÁGUA MINERAL DAS FONTES COMERCIAIS A E B NOS TEMPOS T 0, T 1 E T 2 EM DESACORDO COM A RESOLUÇÃO RDC Nº 275, DE 22 DE SETEMBRO DE 2005 (BRASIL, 2005a) TABELA 4 RESULTADO DA COMPARAÇÃO DE MÉDIAS DA VARIÁVEL BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS (EM FUNÇÃO LOGARÍTMICA) QUANDO SUBMETIDAS A DIFERENTES TEMPOS DE ESTOCAGEM... TABELA 5 RESULTADO DAS ANÁLISES DA VARIÁVEL PSEUDOMONAS AERUGINOSA NOS TEMPOS DE ESTOCAGEM T 0, T 1 E T 2 DE ACORDO COM A TABELA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP), ÍNDICE DE 95% DE CONFIANÇA... TABELA 6 RESULTADO DAS ANÁLISES DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS E COLIFORMES TOTAIS DE ACORDO COM A ORIGEM DO PONTO DE COLETA NAS FONTES COMERCIAIS A E B TABELA 7 RESULTADO DAS ANÁLISES DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA NA ORIGEM DO PONTO DE COLETA DAS FONTES COMERCIAIS A E B, DE ACORDO COM A TABELA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP), ÍNDICE DE 95% DE CONFIANÇA... TABELA 8 RESULTADO DAS COMPARAÇÕES DE MÉDIAS DO NÚMERO DE RANHURAS ENCONTRADAS QUANTO A REGIÃO DA EMBALAGEM RETORNÁVEL

9 viii LISTA DE QUADROS QUADRO 1 QUADRO 2 DEFINIÇÃO DE GRUPOS PARA CLASSIFICAÇÃO DE ESTABELECIMENTO INDUSTRIALIZADOR DE ÁGUA MINERAL RESULTADO DA LISTA DE VERIFICAÇÃO APLICADA ÀS FONTES COMERCIAIS A E B QUADRO 3 MONITORAMENTO DO PONTO DE CONTROLE ENCONTRADO NO PROCESSO PRODUTIVO DE ÁGUA MINERAL NAS FONTES COMERCIAIS A E B... 30

10 ix LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 ÁRVORE DECISÓRIA PARA ANÁLISE DE MATÉRIA- PRIMA FIGURA 2 ÁRVORE DECISÓRIA PARA PONTOS CRÍTICOS DE CONTROLE DO PROCESSO PRODUTIVO FIGURA 3 FLUOGRAMA DAS ETAPAS DA PESQUISA FIGURA 4 BICO INJETOR DE HIGIENIZAÇÃO DA FONTE A FIGURA 5 BICO INJETOR DE ENVASE DA FONTE A FIGURA 6 FLUOGRAMA DE PRODUÇÃO DE ÁGUA MINERAL DAS FONTES COMERCIAIS A E B... 25

11 x LISTA DE ANEOS ANEO 1 TABELA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL UTILIZADA PARA ANÁLISE DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA, ÍNDICE DE 95% DE LIMITE CONFIANÇA PARA TODAS COMBINAÇÕES DE RESULTADOS POSITIVOS E NEGATIVOS QUANDO SÃO UTILIZADOS 10 TUBOS CONTENDO 10 ML DE MEIO (ADAPTADO DE AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, 2005) ANEO 2 LISTA DE VERIFICAÇÃO DE BOAS PRÁTICAS DE FABRICAÇÃO PARA INDUSTRIALIZAÇÃO E COMERCIALIZAÇÃO DE ÁGUA MINERAL NATURAL E ÁGUA NATURAL: FONTE A ANEO 3 LISTA DE VERIFICAÇÃO DE BOAS PRÁTICAS DE FABRICAÇÃO PARA INDUSTRIALIZAÇÃO E COMERCIALIZAÇÃO DE ÁGUA MINERAL NATURAL E ÁGUA NATURAL: FONTE B ANEO 4 ANEO 5 ANEO 6 PLANILHA PARA ANÁLISE DE PERIGOS EM INDÚSTRIA DE ÁGUA MINERAL ANÁLISE DE VARIÂNCIA PARA ph, TURBIDEZ, COR E TEMPERATURA ENTRE OS FATORES FONTE COMERCIAL (A E B) E TEMPO DE ESTOCAGEM DA ÁGUA MINERAL (T 0, T 1 E T 2 ) RESULTADO NUMÉRICO DAS ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS (BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS, COLIFORMES TOTAIS, ESCHERICHIA COLI, ENTEROCOCCUS SP. E CLOSTRÍDIOS SULFITO REDUTORES A 46 C) DAS FONTES COMERCIAIS A E B, NOS TEMPOS T 0, T 1 E T ANEO 7 ANÁLISE DE VARIÂNCIA PARA BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS (FUNÇÃO LOGARÍTMICA) E COLIFORMES TOTAIS PARA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE AMOSTRAS DE ÁGUA MINERAL ANEO 8 ANEO 9 RESULTADO DO TESTE DE TUKEY PARA A COMPARAÇÃO DAS MÉDIAS DA VARIÁVEL COLIFORMES TOTAIS ANÁLISE DE VARIÂNCIA DOS DADOS ANALISADOS DE QUANTIDADE DE HIGIENIZAÇÕES (ZERO, DEZ, VINTE E TRINTA) E REGIÃO DA EMBALAGEM (SUPERIOR, CENTRAL E INFERIOR)... 96

12 xi RESUMO A água é um recurso natural intensamente explorado pelo homem e nas últimas décadas a sua disponibilidade para o consumo humano tem se tornado limitada. Muitos consumidores preferem beber água mineral devido a preocupação com a qualidade dos mananciais e por terem a percepção de que a água mineral possui melhor qualidade que a água tratada. O objetivo principal deste estudo foi avaliar a qualidade da água mineral e de seu processo de envase em duas fontes comerciais. Os objetivos específicos foram: avaliar as fontes comerciais através de lista de verificação, identificar os pontos de controle na linha de industrialização, analisar as características físico-químicas e microbiológicas da água mineral na fonte, após 45 e 90 dias do envase, monitorar as características microbiológicas da superfície de embalagens retornáveis de vinte litros e de equipamentos de higienização e de envase de água mineral e avaliar as alterações físicas na face interna das embalagens retornáveis de vinte litros provocadas pelo processo de higienização. As Listas de Verificação de Boas Práticas de Fabricação para Industrialização e Comercialização de Água Mineral Natural e Água Natural foram aplicadas às fontes comerciais estudadas e os resultados levaram à classificação de alto risco para ambas. O processo produtivo das fontes comerciais foi avaliado e se encontrou um ponto de controle correspondente a etapa de higienização das embalagens retornáveis de vinte litros. Os resultados das análises físico-químicas ph, turbidez, cor, temperatura e cloro total na captação de água mineral nas fontes A e B apresentam médias dentro dos parâmetros exigidos pela legislação. As fontes A e B apresentaram contaminação por bactérias heterotróficas na captação e após 45 e 90 dias do envase de água mineral esta contaminação aumentou 10 3 vezes. Na fonte A não ocorreram amostras contaminadas por coliformes totais na captação e após o envase e na fonte B ocorreram cinco amostras contaminadas na captação, três amostras contaminadas após 45 dias de estocagem e duas amostras após 90 dias de estocagem. O declínio da quantidade de coliformes totais viáveis está relacionado com o aumento de contaminação por Pseudomonas aeruginosa. Nas fontes comerciais A e B houve contaminação por Pseudomonas aeruginosa na captação e nos tempos de estocagem de 45 e 90 dias com uma tendência de aumento da sua freqüência no decorrer dos tempos estudados. No monitoramento microbiológico ambiental, nas fontes A e B, houve maior contaminação por bactérias heterotróficas no bico de envase, comprometendo a qualidade da água envasada. Coliformes totais apresentou maior contagem no bico de higienização e no bico de envase das fontes A e B, respectivamente. A contaminação por Pseudomonas aeruginosa predominou no bico de envase das fontes A e B, constatando que a água mineral já se apresentava contaminada antes de entrar no processo de envase e possivelmente Pseudomonas aeruginosa coloniza a tubulação que conduz a água mineral da captação até a linha de envase. As higienizações aplicadas às embalagens de vinte litros não interferiram no número de ranhuras presentes na face interna destas embalagens, porém a região inferior da embalagem apresentou maior número de ranhuras que as regiões superior e central. Palavras-chave: água mineral, microbiologia, Pseudomonas aeruginosa.

13 xii ABSTRACT Water is a natural resource that has been intensively exploited by man and in the last decades its availability for human use has become limited. Several technologies are applied to exploit the superficial water for human consumption, but the consumers prefer mineral water than natural water because they have the perception that it has better quality. The main goal of this research was to evaluate the mineral water microbiological and chemical status during the processing in two different sources. The specific goals were to evaluate the commercial water sources through an official questionnaire, to identify the control points during processing, to evaluate the microbiological and physicalchemistry characteristics of the water directly in the source and under storage conditions, to check for microbiological conditions in the equipments surface and during processing the reusable bottles, and finally to evaluate the effect of the cleaning process in the reusable bottle physical conditions. The results of the official questionnaire applied to two different sources indicated that both are considered of high risk. The whole productive process was evaluated and it was detected as control point the cleaning procedure applied to reusable bottles. The physical-chemistry analysis results revealed that both sources are statistically similar in the temperature and chlorine content and different in ph and turbidity, but they are in agreement with Brazilian legislation. Both sources were contaminated with heterotrophic bacteria since the beginning of the process and the bacteria number increased 10 3 times until the end of shelf life. In the source identified as A it was not detected in the microbiological analysis the presence of total coliform, and in the source identified as B total coliform was present from the beginning at the source to the end of shelf life of reusable bottles. The number of total coliform decreased and the number of Pseudomonas aeruginosa increased during the evaluation period. The microbiological environmental conditions of the equipments were studied and the heterotrophic bacteria was detected in the filling nozzle of both sources. Total coliform was detected in both cleaning and filling nozzle in the sources A and B. Pseudomonas aeruginosa was detected in the filling nozzle in both sources what indicates that the contamination by this bacterium was present in the whole environment. The cleaning process applied to the reusable bottles did not change significantly the physical conditions but, the number of internal grooves detected at the bottom surface of the bottles was higher than in the other surfaces. Key-words: mineral water, microbiology, Pseudomonas aeruginosa.

14 1 1 INTRODUÇÃO A água é um recurso natural intensamente explorado pelo homem e nas últimas décadas a sua disponibilidade para o consumo humano encontra-se limitada por diversos fatores, entre estes estão a escassez natural e a contaminação biológica e físico-química provenientes de atividades antrópicas e industriais, agricultura, ocupação desordenada do solo e despejo de efluentes e esgoto sanitário não tratados. Para que a água superficial seja viável para consumo, diversas tecnologias são aplicadas, porém muitos consumidores preferem beber água mineral à água tratada devido a preocupação com a qualidade dos mananciais e por terem a percepção de que a água mineral possui melhor qualidade e é mais segura sob o ponto de vista físico-químico e microbiológico que a água tratada. Em dez anos, a produção de água mineral no Brasil aumentou 4,1 bilhões de litros chegando a produção estimada em 2005 de 5,6 bilhões de litros (ABINAM, 2007). Segundo o Departamento Nacional de Produção Mineral (DNPM), os estados brasileiros que possuem o maior consumo de água mineral correspondem a São Paulo (27,35%), Santa Catarina (12,61%) e Rio de Janeiro (8,45%), chegando ao índice de 31,5 litros per capita, número considerado relativamente baixo quando comparado aos principais países da Europa (BRASIL, 2005b). A água mineral em geral é considerada pura e isenta de contaminação microbiológica por seus consumidores, porém, ela não é submetida a qualquer processo de tratamento para melhorar sua qualidade. No Brasil é proibida a utilização de processos que alterem as características originais da fonte de água mineral, portanto não são permitidos tratamentos que diminuam a carga microbiana do produto. Deste modo, práticas rigorosas de higiene devem ser seguidas para que não ocorra contaminação microbiológica na fonte de água mineral ou durante o processo de industrialização. O controle de qualidade da água mineral é realizado periodicamente, pois é um produto que contém microbiota de espécies oriundas de lençóis de água subterrânea e possui condições favoráveis para o desenvolvimento de

15 2 microrganismos. A água mineral industrializada nas fontes comerciais deve seguir o Manual de Boas Práticas e as exigências da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, e para assegurar a qualidade da água mineral são realizadas análises físico-químicas e microbiológicas antes e após o processo de envase. Em adição às análises microbiológicas, a aplicação de testes de monitoramento microbiológico de superfície também contribui para avaliar a higienização dos equipamentos utilizados no processo produtivo. 1.1 JUSTIFICATIVA A água mineral envasada é uma bebida muito consumida pela população brasileira, a qual atribui a este produto características relacionadas à inocuidade e segurança alimentar. No entanto, a água mineral apresenta determinada concentração de microrganismos, uma vez que não é permitida sua esterilização. Para regular as características microbiológicas da água mineral natural e água natural foi estabelecido o regulamento técnico descrito na Resolução da Diretoria Colegiada nº 275, de 22 de setembro de 2005 (BRASIL, 2005a). Há uma preocupação crescente dos consumidores e órgãos reguladores sobre a qualidade da água mineral, no entanto ainda são poucos os estudos e dados disponíveis no Brasil que enfocam a microbiologia de águas minerais. O processo de produção da água mineral e as embalagens nas quais esta é armazenada são possíveis focos de contaminação microbiológica, caso a higienização não seja efetuada corretamente. Sendo assim, é importante realizar estudo de todo processo de produção, desde a captação até o produto final para verificar a qualidade da água mineral.

16 3 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO PRINCIPAL Avaliar a qualidade da água mineral e de seu processo de envase em duas fontes comerciais. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Descrever o fluxograma de duas fontes comerciais de captação de água mineral; Avaliar o risco das fontes comerciais através de lista de verificação; Identificar os pontos de controle da linha de industrialização; Analisar as características físico-químicas da água mineral na fonte, após quarenta e cinco e noventa dias do envase, mediante análises de ph, turbidez, cor, temperatura e cloro total; Analisar as características microbiológicas da água mineral, na fonte, após quarenta e cinco e noventa dias do envase, mediante análises de bactérias heterotróficas, coliformes totais, Escherichia coli, Enterococcus, Pseudomonas aeruginosa e clostrídios sulfito redutores a 46ºC; Monitorar as características microbiológicas da superfície de embalagens retornáveis de vinte litros e de equipamentos de higienização e de envase de água mineral, mediante análises de bactérias heterotróficas, coliformes totais, Escherichia coli, Enterococcus, Pseudomonas aeruginosa e clostrídios sulfito redutores a 46ºC; e Avaliar as alterações físicas na face interna das embalagens retornáveis de vinte litros provocadas pelo processo de higienização.

17 4 3 REVISÃO DA LITERATURA A água é um elemento essencial e indispensável à vida de todos. A maior parcela da Terra é coberta por água, porém apenas 2,5% correspondem à quantidade de água doce encontrada no mundo. Deste valor, aproximadamente 0,03% correspondem à água doce disponível em rios e lagos e 29,9% correspondem à água subterrânea. Em razão do crescimento da população e da contaminação das águas, o suprimento de água potável nas áreas urbanizadas torna-se cada vez mais difícil e com maior custo (FILIZOLA et al., 2002). A água utilizada para consumo pode ser obtida de diferentes fontes. Uma destas fontes é a água subterrânea, a qual encontra-se abaixo da superfície, preenchendo os poros ou vazios intergranulares das rochas sedimentares, ou as fraturas, falhas e fissuras das rochas compactas. A água subterrânea apresenta algumas propriedades que tornam o seu uso mais vantajoso em relação às águas superficiais, pois é filtrada e purificada naturalmente através da percolação, resultando em um produto de excelente qualidade, dispensando tratamentos prévios e sendo submetida a menor influência das variações climáticas (BORGHETTI et al., 2004). Silva e Araújo (2003) apresentam alguns exemplos de fontes de contaminação das águas subterrâneas, como: o destino final do esgoto doméstico e industrial, disposição inadequada de resíduos sólidos urbanos e industriais e modernização da agricultura. Tais fontes de contaminação podem levar à presença na água, de bactérias patogênicas, vírus, parasitas, substâncias orgânicas e inorgânicas prejudiciais à saúde humana. A água subterrânea pode ser obtida de aqüíferos, os quais são rochas permeáveis que apresentam a propriedade de armazenar e permitir que a água passe entre seus poros ou fraturas (BORGHETTI et al., 2004). A água subterrânea pode ser captada no aqüífero confinado ou artesiano, que se encontra entre duas camadas relativamente impermeáveis, o que dificulta a sua contaminação, ou pode ser captada no aqüífero não confinado ou livre, que fica próximo à superfície, portanto, mais suscetível à contaminação. Em função do baixo custo e facilidade de perfuração, a captação de água de aqüífero livre, embora mais vulnerável à

18 5 contaminação, é mais freqüentemente utilizada no Brasil (FOSTER, 1993 apud SILVA; ARAÚJO, 2003). As águas minerais naturais são de origem subterrânea, obtidas diretamente de fontes naturais ou artificialmente captadas, caracterizadas pelo conteúdo definido e constante de sais minerais e pela presença de oligoelementos e outros constituintes (BRASIL, 2000). A produção brasileira de água mineral é regulamentada pelo Departamento Nacional de Produção Mineral (DNPM) e pelo Ministério da Saúde, através da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Para a água ser considerada mineral, deve percorrer o subsolo e ser enriquecida com minerais através do contato com rochas (PETRACCIA, 2005), no entanto, a composição química da água varia de acordo com as rochas e terrenos pelos quais a mesma passou enquanto infiltrava-se no solo (MORGANO et al., 2002). A água mineral é classificada de acordo com o elemento químico predominante (MORGANO et al., 2002), inocuidade na fonte, presença de elementos traço e propriedades medicinais (PETRACCIA, 2005). As pessoas acreditam que a água mineral é pura e limpa, contudo, ocasionalmente a água mineral é relacionada com patologias, a exemplo de diarréias, como ocorrido em 1974 quando houve uma epidemia de cólera em Portugal e a água mineral foi identificada como um dos veículos de transmissão de Vibrio cholerae. Suspeitou-se que o aqüífero de calcário, então local de origem da água, estava contaminado pelas águas do rio e do esgoto do vilarejo próximo (LI et al., 2001). Para que a água mineral seja considerada segura, esta deve apresentar ausência de perigo à saúde do consumidor e da população, portanto a captação e o processo de envase da água mineral precisam obedecer às condições higiênicosanitárias e às Boas Práticas (BRASIL, 2000). Existem duas razões principais para o monitoramento da qualidade da água, uma delas é determinar se o fornecimento de água está operando corretamente, implicando que a água é segura para os consumidores, e a outra é provar que esta continua segura após seu fornecimento, o que inclui o monitoramento para verificação (NATIONAL HEALTH AND MEDICAL RESEARCH COUNCIL, 2003). As fontes mais comuns de contaminação são: equipamentos, embalagens retornáveis, encanamento, exposição ao ar e contato humano durante o processo de envase (RAMALHO, 2001).

19 6 Assim sendo, a ausência de organismos infecciosos está entre as qualidades desejáveis dos alimentos, inclusive da água, portanto, espera-se atingir uma produção de alimentos com nível mínimo de contaminação por microrganismos. Contudo, alcançar níveis de tolerância zero de microrganismos, mesmo com a aplicação de Boas Práticas talvez não seja possível (JAY, 2005). Para a obtenção de adequada segurança alimentar é muito importante a aplicação de medidas preventivas de conduta, como as Boas Práticas e a aplicação do programa de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle, assim como outros programas de qualidade (DUREK, 2005). As Boas Práticas constituem um sistema de controle de qualidade que visa garantir segurança alimentar no processamento dos alimentos. Desta maneira, as Boas Práticas são normas empregadas em produtos, processos, serviços e edificações, visando a promoção e certificação da qualidade e da segurança do alimento (TOMICH et al., 2005). Este sistema apresenta-se como base para a implantação de outros sistemas de qualidade na indústria de alimentos. As indústrias envasadoras de água mineral precisam adotar medidas a fim de garantir a qualidade sanitária e a conformidade do produto com os regulamentos técnicos. Assim, a ANVISA publicou a Resolução da Diretoria Colegiada nº173 de 13 de setembro de 2006, que dispõe sobre o Regulamento Técnico de Boas Práticas para Industrialização e Comercialização de Água Mineral Natural e Água Natural (BRASIL, 2006). As operações de captação, envase, transporte e manuseio não podem comprometer a qualidade da água mineral e por este motivo todas as etapas devem ser avaliadas periodicamente. Além do Manual de Boas Práticas, os Procedimentos Operacionais Padronizados (POP s) são indicados para auxiliar no controle de qualidade das etapas de produção da indústria. O POP é um procedimento escrito de forma objetiva, estabelecendo instruções seqüenciais para a realização de operações rotineiras e específicas na produção, armazenamento e transporte de alimentos (BRASIL, 2002). Outra ferramenta utilizada para garantir a produção de um alimento seguro é o programa de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC). Este programa é uma maneira sistematizada de estabelecer pontos de monitoramento, em uma linha específica de produção, a fim de garantir a segurança do produto final (FRANCO e LANDGRAF, 2005). O APPCC é aplicado durante a

20 7 produção, processamento, preparação ou uso do alimento e da água (KIRBY et al., 2003). A elaboração de um APPCC na planta industrial segue as seguintes etapas: preparar o fluxograma do processo, identificar perigos e determinar sua severidade e riscos, determinar os pontos críticos de controle, estabelecer critérios para garantir o controle, monitorar os pontos críticos de controle, tomar ações corretivas sempre que o monitoramento indicar que os critérios não foram atingidos e verificar se o sistema está funcionando como planejado (FRANCO e LANDGRAF, 2005). Após a empresa adequar seus processos e instalações às exigências da ANVISA e do DNPM, a industrialização de água mineral inicia-se. A água mineral deve seguir parâmetros sensoriais, físicos e químicos definidos em legislação para que possa ser comercializada, dentre os quais, o aspecto da água deve ser límpido, o odor e sabor característicos, a cor com máximo de 5,0uH e a turbidez com máximo de 3,0uT (BRASIL, 2000). Além das características sensoriais e físico-químicas da água mineral, há a preocupação com sua qualidade microbiológica, pois muitos consumidores acreditam que a água mineral é isenta de microrganismos (RAMALHO et al., 2001). No entanto a água mineral não é estéril e apresenta determinado índice de microrganismos, mesmo que este índice seja diminuído pelo processo de filtração que ocorre quando a água passa pelas rochas e terra (SANT ANA, 2003), e todo crescimento dos microrganismos pode ser influenciado por diversos fatores presentes no ambiente, como temperatura, ph, umidade, tensão de oxigênio e nutrientes (MASSAGUER, 2005). Com relação à microbiota, a água mineral apresenta espécies autóctones, originárias do aqüífero, e espécies alóctones, oriundas do processo de industrialização da água (JAYASEKARA et al., 1999). A qualidade da água mineral é expressa de acordo com o número de bactérias presentes em certo volume de água (CABRAL e PINTO, 2002) e as bactérias consideradas indicadoras de contaminação em águas minerais são coliformes totais, coliformes termotolerantes, Enterococcus, Pseudomonas aeruginosa e clostrídios sulfito redutores a 46ºC (SANT ANA et al., 2003).

21 8 3.1 MICRORGANISMOS INDICADORES DE QUALIDADE NA ÁGUA MINERAL Apesar de não ser possível afirmar a existência de bactérias estritamente aquáticas, é muito disseminada a idéia de que grande parte das bactérias encontradas na água é proveniente do solo e carreada para as águas através da chuva, de acidentes de ordem natural ou por influência antrópica (SOUZA e SILVA- SOUZA, 2001) e da mesma maneira microrganismos do solo podem contaminar o ar e os mananciais através do vento (FRANCO e LANDGRAF, 2005). A água mineral proveniente diretamente do aqüífero possui população microbiana natural ou autóctone em torno de 20 UFC/ml. Esta população aumenta para aproximadamente UFC/ml após duas a três semanas do envase, devido a mudanças nas condições ambientais (JAYASEKARA et al., 1999). Este rápido crescimento dos microrganismos pode estar relacionado à oxigenação durante o processo de envase da água mineral, ao aumento de área de contato devido o confinamento dentro da embalagem, ao aumento de temperatura durante a estocagem e/ou aos nutrientes presentes na embalagem (VENIERI et al., 2005). A embalagem de polietileno tereftalato (PET) é uma fonte de matéria orgânica que pode contribuir para o crescimento de microrganismos, pois durante o período de armazenamento libera diversos compostos orgânicos (CRIADO, 2005). Fazem parte do grupo de microrganismos autóctones, as bactérias dos gêneros Pseudomonas, Acinetobacter, Alcaligenes, Flavobacterium, Micrococcus, Bacillus (SANT ANA et al., 2003), Achromobacter e Moraxella (NSANZE e BABARINDE, 1999; TAMAGNIN e GONZALEZ, 1997). Estas bactérias autóctones podem apresentar efeito inibidor sobre a sobrevivência de alguns microrganismos indicadores e patogênicos (RAMALHO et al., 2001). A maioria destas bactérias não apresenta risco à saúde da população em geral, contudo, algumas são patógenos oportunistas com capacidade de provocar efeitos adversos à saúde em indivíduos imunocomprometidos (STELMA JR et al., 2004). Nas águas minerais engarrafadas, a maioria dos microrganismos presentes são bastonetes Gram-negativos, freqüentemente identificados como Pseudomonas spp, originários da fonte (microrganismos autóctones) ou de contaminação no processo produtivo (microrganismos alóctones) (ARMAS e SUTHERLAND, 1999). As águas minerais estão sujeitas a apresentar microrganismos patogênicos, tornando-se veículos de contaminação para diversas doenças transmitidas por bactérias, fungos,

22 9 vírus e protozoários (FRANCO e CANTUSIO NETO, 2002). Contudo, no local de captação, fonte ou poço, assim como durante sua comercialização, a água mineral não pode apresentar riscos à saúde do consumidor, devendo apresentar ausência de bactérias indicadoras de contaminação Bactérias heterotróficas A contagem de bactérias heterotróficas é um procedimento utilizado para acompanhar variações nas condições higiênicas e do processo produtivo (SILVA et al., 2005). Muitos destes microrganismos desenvolvem-se lentamente e necessitam de meio de cultura pobre em nutrientes. Existem evidências que estas bactérias não apresentam risco a população saudável, no entanto alguns destes microrganismos são patógenos oportunistas (STELMA JR et al., 2004) Coliformes totais Segundo APHA (2005), coliformes totais são bacilos Gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, que desenvolvem colônia vermelha com brilho metálico a 35ºC em 24 horas quando submetidos a um meio contendo lactose. Este grupo inclui bactérias dos gêneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella. Estas bactérias têm como hábitat primário o trato intestinal humano e de outros animais e, com exceção de Escherichia, também podem ser encontrados em outros ambientes como solo e vegetais (FRANCO e LANDGRAF, 2005). Por esta razão, a representação de coliformes totais como indicador de contaminação fecal é menos representativa do que àquela de coliformes termotolerantes e Escherichia coli. Apesar de coliformes totais e termotolerantes não serem detectados na maioria das águas minerais, algumas podem apresentar tal contaminação (TSAI e YU, 1997). Segundo o NATIONAL HEALTH AND MEDICAL RESEARCH COUNCIL (2003), coliformes totais não são considerados um real risco à qualidade da água, pois estão dispersos do solo, água e plantas e nem sempre estão presentes em surtos relacionados com doenças de veiculação hídrica Coliformes termotolerantes e Escherichia coli As bactérias do grupo coliformes termotolerantes são muito utilizadas para indicar contaminação fecal recente, pois se apresentam em grande densidade nas

23 10 fezes, sendo facilmente isoladas e identificadas na água por métodos relativamente simples e rápidos. Estas bactérias também apresentam sobrevivência semelhante a das bactérias enteropatogênicas (CETESB, 2004). A definição do grupo de coliformes termotolerantes é a mesma de coliformes totais, porém restringe-se aos microrganismos capazes de fermentar a lactose, com produção de gás, em 24 horas e temperatura entre 44,5 C (SILVA et al., 2005). Alguns exemplos deste grupo são os gêneros Escherichia, Klebsiella e Enterobacter (HAGLER e HAGLER, 1987). A espécie Escherichia coli é considerada de origem unicamente fecal e é definida como bactéria do grupo coliforme que fermenta lactose e manitol, com produção de ácido e gás a 44,5 ± 0,2ºC em 24 horas, produz indol a partir do triptofano, é oxidase negativa, não hidroliza a uréia e apresenta atividade das enzimas ß-galactosidase e ß-glucoronidase, sendo considerada o mais específico indicador de contaminação fecal recente e de eventual presença de organismos patogênicos (BRASIL, 2004) Enterococcus O gênero Enterococcus caracteriza-se por apresentar alta tolerância às condições adversas de crescimento, tais como capacidade de crescer na presença de 6,5% de cloreto de sódio, a ph 9,6 e nas temperaturas de 10 C e 45 C (FRANCO e LANDGRAF, 2005). A utilização de Enterococcus como indicador fecal possui algumas restrições, pois podem ser encontrados no trato gastrintestinal e também em ambientes diferentes deste. Este gênero não se multiplica em água contaminada por esgoto (LLEÒ, 2005) e apresenta sobrevida maior que outros enteropatógenos quando presente no solo, vegetais ou alimentos (FRANCO e LANDGRAF, 2005) Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria patogênica de larga distribuição, a qual é utilizada como indicador de contaminação fecal e não fecal (HAGLER e HAGLER, 1987). Pseudomonas é um gênero de bactérias Gram-negativas, as quais possuem bastonetes movéis com flagelo polar e são aeróbias obrigatórias, capazes de crescer em meio simples (MASSAGUER, 2005). A espécie P. aeruginosa é oligotrófica, ou seja, é capaz de crescer em ambientes com baixa concentração de nutrientes (JAYASEKARA et al., 1998; LEGNANI et al., 1999).

24 11 No Brasil, este grupo de bactérias tem aparecido com relativa freqüência em análises de água clorada, não clorada e mineral (GALVÃO, 2004). P. aeruginosa pode estar presente na água mineral como microrganismo autóctone, no entanto acredita-se que é mais provável que esta contamine a água através do processo produtivo na planta da indústria (JAYASEKARA et al., 1998). Durante o período de estocagem da água mineral engarrafada, o desenvolvimento da biota autóctone pode provocar alta concentração de P. aeruginosa proporcionando risco ao consumidor, principalmente àqueles imunocomprometidos e idosos (LEGNANI et al., 1999). A presença significativa deste microrganismo na água mineral deve-se a seu importante potencial oportunista patogênico (WARBURTON, 1993). Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista conhecido por causar infecções sistêmicas urinárias, respiratórias, gastrointestinais, no sistema nervoso central e de pele, além de endocardites, otite externa, entre outras infecções sistêmicas (SILVA, 2005). Ainda, ARMAS e SUTHERLAND (1999) estudaram que muitas espécies de Pseudomonas recuperadas da água podem ser resistentes a antibióticos Clostridios sulfito redutores a 46ºC Os clostrídios sulfito redutores têm sido utilizados como indicadores de poluição fecal em água por sua incidência no meio aquático estar constantemente associada a fezes humanas (SILVA et al., 2000 apud GALVÃO, 2004). As bactérias do grupo clostrídio sulfito redutor são aquelas que apresentam desenvolvimento de colônias sulfito redutoras a 46 0 C por 24 horas, anaeróbias e bastonetes Grampositivos (BRASIL, 2001). O Clostridium é um gênero anaeróbio, catalase-negativo, largamente encontrado no solo, plantas em decomposição e trato intestinal de animais. Para desenvolver-se necessita de mais de 30% de água, condições anaeróbias, menos de 10% de sal e menos de 40% de açúcar (GAVA, 2002). A espécie Clostridium perfringens é predominante sacarolítica, ou seja, fermenta açúcares e álcool. Este microrganismo pode causar gangrena e toxinfecção alimentar (MASSAGUER, 2005). O esporo de Clostridium apresenta grande longevidade na água em função de sua resistência a condições desfavoráveis do meio ambiente e por este motivo é útil na indicação de contaminação fecal remota, pois outros microrganismos indicadores de contaminação fecal não mais estariam presentes (SILVA et al., 2000).

25 BIOFILME Na natureza, dificilmente os microrganismos vivem em colônias isoladas de uma única espécie, mas vivem em comunidades denominadas biofilmes (TORTORA et al., 2005). Falhas nos procedimentos de higienização permitem que resíduos aderidos aos equipamentos e superfícies transformem-se em potencial fonte de contaminação, desta maneira, algumas bactérias aderem às superfícies dos equipamentos presentes na indústria de alimentos. Para reduzir ou eliminar os microrganismos, são utilizadas técnicas que incluem métodos físicos, como lavar as mãos, utilizar jatos de alta pressão, e métodos químicos, como utilizar compostos contendo hipoclorito, iodóforos ou amônio quaternário. Ambas as técnicas possuem a capacidade de remover ou inativar microrganismos que estejam presentes na superfície de equipamentos que entram em contato com o alimento (ZOTTOLA e HOOD, 1995). Sob determinadas condições, os microrganismos aderem, interagem com as superfícies e iniciam o crescimento celular. Essa multiplicação dá origem a colônias e quando a massa celular é suficiente para agregar nutrientes, resíduos e outros microrganismos, está formado o que se denomina biofilme (MACEDO, 2004). Os biofilmes são compostos por uma população ou uma comunidade de múltiplas espécies microbianas embebidas em uma matriz extracelular, a qual funciona como interface aderida a uma superfície biótica ou abiótica. Em um biofilme, as populações e comunidades participantes são interdependentes, funcionando de maneira complexa e coordenada. Os biofilmes são formados sob superfícies, onde há grande concentração de nutrientes. No biofilme, os microrganismos são mais resistentes a agentes químicos e físicos, como àqueles utilizados no procedimento de higienização, sendo uma importante fonte de contaminação na indústria de alimentos. Para que a colônia de células microbianas seja considerada biofilme, esta deve conter um número mínimo de 10 6 e 10 7 células aderidas por cm 2 (MACEDO, 2004). Assim, ranhuras presentes na face interna de embalagens retornáveis de vinte litros de água mineral e equipamentos destinados a higienização e envase podem ser locais propícios para o desenvolvimento de biofilmes e conseqüente contaminação da água mineral.

26 13 O controle ambiental de superfície é fundamental para permitir a descoberta da magnitude e tipo de contaminação do produto final. Com os dados do controle microbiológico de superfície podem ser elaborados critérios de limpeza dos equipamentos (MASSAGUER, 2005) visto que os desinfetantes não penetram adequadamente na matriz de polissacarídeos e glicoproteínas do biofilme (WIRTANEN et al., 2001).

27 14 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 MATERIAL Para a realização da pesquisa foram escolhidas duas fontes comerciais de água mineral localizadas no litoral do Estado de Santa Catarina, denominadas A e B. A descrição do produto água mineral de cada uma das fontes comerciais estudadas está apresentada na Tabela 1. TABELA 1: DESCRIÇÃO DO PRODUTO ÁGUA MINERAL, PRESENTE NO RÓTULO DA EMBALAGEM NAS FONTES COMERCIAIS A E B. Fonte comercial A Fonte comercial B Nome comum Água mineral Água mineral ph: 6,10 ph: 6,26 Características Temperatura da água mineral na fonte: 20ºC Temperatura da água na fonte: 20,4 ºC importantes do produto final Condutividade elétrica a 25ºC: 1,65 x 10-4 mhos/cm Resíduo de evaporação calculado : 130,67mg/l Condutividade elétrica a 25ºC: 1,34 x 10-4 mhos/cm Resíduo de evaporação calculado : 82,00mg/l Cálcio: 7,01 Cálcio: 9,92 Magnésio: 7,41 Magnésio: 7,06 Sódio: 15,11 Potássio: 1,20 Potássio: 3,80 Sódio: 5,60 Composição química Bicarbonatos: 54,44 Cloretos: 7,65 (mg/l) Cloretos: 24,67 Fluoretos: 0,10 Sulfatos: 3,92 Sulfatos: 2,11 Fluoretos: 0,16 Fosfatos: 0,09 Bicarbonatos: 62,68 Lítio: 0,004 Formas de consumo do Uso direto pelo consumidor Uso direto pelo consumidor produto Preparo de alimentos Preparo de alimentos Características da embalagem Embalagens retornáveis de plástico PP, volume: 20 litros. Embalagens retornáveis de plástico PP com volume igual a 20 litros. Prazo de validade 03 meses, a temperatura ambiente. 03 meses, a temperatura ambiente. Em estabelecimentos comerciais Em estabelecimentos comerciais fora Local de venda do fora da empresa que envasa a da empresa que envasa a água produto água mineral. mineral. Instruções no rótulo para conservação e consumo Fonte: Autora (2007). Acondicionar em local fresco Acondicionar em local fresco Não expor à luz Não expor à luz - Após aberto consumir em 20 dias.

28 15 Para analisar a qualidade físico-química e microbiológica da água mineral foram utilizadas amostras de água mineral coletadas na fonte antes do processo de envase (T 0 ), e de embalagens retornáveis com capacidade para vinte litros após 45 dias da data do envase (T 1 ) e 90 dias da data do envase (T 2 ). Estas embalagens são de mesmo lote e adquiridas diretamente na indústria envasadora de água mineral. As embalagens de vinte litros recolhidas das indústrias apresentavam-se lacradas e sem danos externos. O teste de monitoramento microbiológico de superfície, com utilização de swab, foi aplicado nos bicos das máquinas higienizadoras e envasadoras de água mineral, assim como na superfície interna de embalagens retornáveis de vinte litros antes e após o processo de higienização. A análise das alterações físicas provocadas pelo processo de higienização na face interna das embalagens retornáveis de vinte litros foi realizada em amostras de plástico retiradas destas embalagens. 4.2 METODOLOGIA Diagrama de fluxo As informações para elaboração do fluxograma produtivo foram obtidas através de questionários e entrevistas com responsáveis técnicos e funcionários das fontes comerciais estudadas Avaliação do risco das fontes comerciais A Lista de Verificação Boas Práticas de Fabricação para Industrialização e Comercialização de Água Mineral Natural e Água Natural (BRASIL,2006), a qual se encontra nos Anexos 2 e 3, foi utilizada na pesquisa como instrumento para avaliar o risco das fontes comerciais. Esta lista de verificação é constituída de duas partes, sendo que a primeira parte corresponde a identificação da indústria e a segunda parte, a descrição dos itens a serem verificados, totalizando 285 itens. As fontes de água mineral estudadas foram classificadas de acordo com a Lista de Verificação, a qual propõe separar os estabelecimentos verificados em três grupos, de acordo com a presença de conformidades. O Quadro 1 relaciona as atribuições de cada grupo.

29 16 QUADRO 1: DEFINIÇÃO DE GRUPOS PARA CLASSIFICAÇÃO DE ESTABELECIMENTO INDUSTRIALIZADOR DE ÁGUA MINERAL. Grupo Grupo 1 Atribuição quanto ao risco Baixo Critério de classificação 100% de atendimento dos itens referentes à Higienização da canalização, Higienização do reservatório, Recepção das embalagens e Higienização das embalagens. Grupo 2 Médio 76 a 100% de atendimento dos demais itens. 100% de atendimento dos itens referentes à Higienização da canalização, Higienização do reservatório, Recepção das embalagens e Higienização das embalagens. 51 a 75% de atendimento dos demais itens. Não atendimento a um ou mais itens referentes à Grupo 3 Alto Higienização da canalização, Higienização do reservatório, Recepção das embalagens e Higienização das embalagens. 0 a 50% de atendimento dos demais itens. Fonte: AUTORA (2007) IDENTIFICAÇÃO DE PERIGOS E PONTOS DE CONTROLE A seleção de critérios e a determinação de pontos de controle são utilizadas para analisar a qualidade e a segurança alimentar da água mineral. Os critérios são representados por especificações ou características físicas, químicas ou biológicas que precisam ser atingidas no processo (MASSAGUER, 2005). Os critérios para água mineral estão descritos na Resolução RDC nº 275 (BRASIL, 2005a) e pressupõem que deve existir ausência de coliformes totais, coliformes termotolerantes ou Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus e clostrídios sulfito redutores a 46 C neste produto. As matérias primas utilizadas nas fontes comerciais são água mineral e embalagens retornáveis de vinte litros. Para avaliar se a matéria-prima utilizada no processo de produção é um ponto crítico de controle, foram realizados os questionamentos apresentados na Figura 1.

30 17 FIGURA 1: ÁRVORE DECISÓRIA PARA ANÁLISE DE MATÉRIA-PRIMA. Sim Será que é provável que esta matériaprima apresente o perigo que estamos estudando em níveis inaceitáveis? Não Sim O processo conjuntamente com o uso que se espera que o consumidor faça do produto eliminará o perigo ou reduzirá a níveis aceitáveis? Não é um PCC Não Não é um PCC A matéria-prima deve ser considerada um Ponto Crítico de Controle. Fonte: Adaptado de MASSAGUER (2005). A partir do fluxograma do processo produtivo foi realizada a identificação das operações nas quais existe a possibilidade de ocorrer contaminação e posterior identificação dos pontos críticos de controle através de árvore decisória descrita por MASSAGUER (2005). A Figura 2 apresenta a árvore decisória para analisar o processo produtivo da fonte comercial e assim, definir os pontos críticos de controle.

31 18 FIGURA 2: ÁRVORE DECISÓRIA PARA PONTOS CRÍTICOS DE CONTROLE DO PROCESSO PRODUTIVO. P1 Sim É provável que nesta etapa surja um novo perigo ou que um perigo já existente alcance níveis inaceitáveis? Não As etapas posteriores do processo e o uso que se espera do consumidor vão garantir a eliminação do perigo ou a sua redução a níveis aceitáveis? A etapa do processo destina-se a eliminar ou reduzir o risco a níveis aceitáveis. Sim Não Sim Não Não é Esta etapa é um um PCC. PCC para este Fonte: Adaptado de MASSAGUER (2005). Não é um PCC Análises físico-químicas e microbiológicas As análises das amostras ocorreram em três períodos diferentes e a Figura 3 apresenta o fluxograma das etapas da pesquisa. Tempo zero (T 0 ): água mineral coletada na fonte, através de uma torneira localizada na casa de captação. Este tempo corresponde a água mineral proveniente do lençol de águas subterrâneas, antes de chegar à planta da indústria envasadora, imediatamente antes dela ser envasada. Tempo um (T 1 ): água mineral coletada de embalagens de vinte litros quarenta e cinco dias após a data de envase. O T 1 foi definido em 45 dias, que corresponde a metade do tempo de prateleira designado para este tipo de embalagem.

32 19 Tempo dois (T 2 ): água mineral coletada de embalagens de vinte litros noventa dias após a data de envase, período que corresponde a data final de validade do vasilhame de vinte litros de água mineral. Foram realizadas seis coletas em cada um dos tempos e em cada fonte comercial. As embalagens de vinte litros de água mineral foram estocadas em sala escura e a temperatura ambiente até o momento das análises físico-químicas e microbiológicas. Foram realizadas análises físico-químicas para os parâmetros ph, turbidez, cor, temperatura e cloro total, e, nas análises microbiológicas foram investigados os microrganismos bactérias heterotróficas, coliformes totais, Escherichia coli, Enterococcus, Pseudomonas aeruginosa e clostrídios sulfito redutores a 46ºC. FIGURA 3: FLUOGRAMA DAS ETAPAS DA PESQUISA. Fonte Comercial A Fonte Comercial B Análises físico-químicas e microbiológicas realizadas no T 0 Coleta de água mineral diretamente da fonte de captação Obtenção de embalagem de vinte litros contendo água mineral, na fonte Análises físico-químicas e microbiológicas realizadas no T 1 Análises físico-químicas e microbiológicas Fonte: realizadas Autora. no T 2 Obtenção de embalagem de vinte litros contendo água mineral, na fonte Fonte: Autora (2007) Determinação de ph Para a determinação do ph foi utilizado o método eletrométrico presente na publicação AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION (2005), utilizando o phmetro MA 130 Mettler Toledo

33 Determinação de turbidez A turbidez foi determinada pelo método nefelométrico descrito na publicação AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION (2005), utilizando-se o turbidímetro 2100P HACH Determinação de cor A cor foi determinada pelo método colorimétrico descrito na publicação AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION (2005), com auxílio de espectrofotômetro HACH em comprimento de onda 256nm Determinação de temperatura A temperatura foi lida em termômetro graduado de 0-100ºC Determinação de cloro total portátil HACH. O cloro total foi analisado através do método DPD em aparelho colorímetro Determinação de bactérias heterotróficas Para a determinação de bactérias heterotróficas foi utilizado o método pour plate descrito na publicação AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION (2005) Determinação de coliformes totais As análises de coliformes totais foram realizadas de acordo com a técnica da membrana filtrante descrita na publicação AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION (2005) Determinação de Escherichia coli As análises de E. coli foram realizadas de acordo com a técnica da membrana filtrante descrita na publicação AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION (2005). Para esta análise foi utilizado o meio mtec modified Agar (específico para Escherichia coli).