Bactérias. Meios de Cultura e Curva de crescimento in vitro. Meios de cultura

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1 Bactérias Meios de Cultura e Curva de crescimento in vitro Microbiologia profª Janara Meios de cultura NUTRIÇÃO Obtenção de ENERGIA (ATP) e construção de componentes celulares. Nutrientes necessários à sobrevivência delas: Carbono (C) (carboidratos ou açúcares), Oxigênio (O), Hidrogênio (H), Nitrogênio (N), Enxofre (S), Fósforo (P), Cálcio (Ca), Ferro (Fe), Cobre (Cu), Sódio (Na), etc. Fontes : Carbono: carboidratos (açúcares, glicose, frutose, polissacarídeos, monossacarídeos) Hidrogênio: água Nitrogênio: peptona Por que é importante conhecer a nutrição das bactérias? Para que possamos cultivá-las em laboratório MEIOS DE CULTURA específicos para cada grupo de bactéria. REPRODUÇÃO = Aumentar a quantidade de microrganismos, que por vezes, ocorrem em número reduzido na amostra, para facilitar posteriormente a identificação 1

2 Bactérias Meios de cultura O estudo microscópico das características morfológicas (tamanho, forma e tipo de colônia) e da coloração insuficiente para a obtenção de uma identificação satisfatória do agente patogénico. Assim, para conhecer as propriedades, fisiológicas e bioquímicas é necessário cultivar as células microbianas no laboratório. A cultura de microrganismos consiste no crescimento de populações microbianas em meios de cultura laboratoriais meios de cultura apropriados que simulem ou até melhorem as condições naturais do ambiente em que se desenvolvem. Um meio de cultura é um substrato nutritivo capaz de permitir a nutrição e o crescimento dos microrganismos (bactérias, fungos, algas, parasitas) fora do seu ambiente biológico natural, ou seja, é uma preparação de nutrientes utilizada para o crescimento de microrganismos em laboratório. Bactérias Fatores de Crescimento O metabolismo das bactérias e seu crescimento (reprodução) é influenciado por fatores físicos e químicos do meio ambiente, como: Umidade Quantidade de nutrientes, e quais nutrientes Temperatura: ph, Oxigênio Pressão Luz 2

3 Bactérias Meios de cultura Os 1ºs meios de cultura utilizados eram líquidos e naturais caldo de pimenta, urina, sangue e leite. O meio mais utilizado para bactérias heterotróficas é o caldo nutriente (CN) ou o ágar nutriente (AN). No preparo do meio de cultura deve-se conhecer as exigências nutricionais do organismo. Bactérias Meios de cultura São componentes essenciais do meio de cultura: Fonte de energia: compostos químicos como enxofre e e amônio, ou luz para os fotossintetizantes) Fonte de carbono: compostos orgânicos (substâncias que contém C,H,O,N, P), e CO 2 para os fotossintetizantes. Fonte de nitrogênio: proteínas, aminoácidos, nitrato, amônio, N 2. Fonte de crescimento: vitaminas Fonte de minerais: P, K, S, Ca, Fe, Mg, Mn, Zn, Cu, etc Água 3

4 Bactérias Fatores de Crescimento O metabolismo das bactérias e seu crescimento (reprodução) é influenciado por fatores físicos e químicos do meio ambiente, como: Quantidade de nutrientes, e quais nutrientes Temperatura = cada microrganismo requer um intervalo de temperatura limitado de acordo com a sensibilidade das suas enzimas ao calor. Temp. Ótima de crescimento. ph = cada organismo exige um ph adequado p/ seu crescimento. A maioria prefere ph neutro em torno de 7. Pressão osmótica = organismos marinhos, necessitam de uma [ ] maior de sal no meio. Luz = para os fotossintetizantes. Bactérias Fatores de Crescimento Oxigênio = > Aeróbios restritos (ex. Mycobacterium), necessitam da presença de oxigénio para crescer (atmosfera com 21 % de oxigénio); Microaerófilos (ex. Helicobacter pylori) necessitam de oxigénio como os aeróbios, mas só conseguem crescer com concentrações de oxigénio menores do que as que existem na atmosfera (< 21%); crescem melhor com concentrações de oxigénio entre 1 e 15%. Aeróbios ou anaeróbios facultativos (ex. Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae): São aqueles que crescem em presença ou em ausência de oxigénio. No entanto, crescem melhor em presença do que em ausência de oxigénio, não sendo dependentes do oxigénio atmosférico Anaeróbios estritos (ex. Clostridium botulinum), são aqueles que podem ser intoxicados pelo oxigénio, que não crescem na atmosfera e não usam o oxigénio. A presença de oxigénio atmosférico leva à formação de metabolitos tóxicos como o peróxido de hidrogénio, por conseguinte pequenas quantidades de oxigénio atmosférico são letais para estes microrganismos. No laboratório, utilizam-se jarras de anaerobiose em que o oxigénio é removido retirando-se o ar ou por reação química. 4

5 Bactérias Classificação dos meios de cultura Quanto à origem: Naturais => prontos na natureza (leite, sangue, caldo de frutas, de cana, etc)); Artificiais => feitos em laboratório (ex. Ágar nutriente) Quanto à composição: Complexos => sem composição química definida (contém extrato de carne, leveduras, sangue, ovos, etc) Sintéticos =>.com composição química definida. Bactérias Classificação dos meios de cultura Quanto ao estado físico: Sólidos => prontos na natureza já em estado sólido ou foram adicionados de solidificante como o ágar, gelatina ou sílica-gel. O ágar-ágar é o solidificante mais usado em microbiologia polissacarídeo extraído de uma alga marinha (Gelidium) muito usado devido a suas caracterísitcas: Inerte para os microrganismos Transparente ph neutro Ponto de fusão 100º C Ponto de solificação a 40-45ºC Preparo em placa de petri ou tubo de ensaio. Semi-sólidos => consistência intermediária (ágar a 0,5%), usado para microaerófilos. Líquidos => na forma de caldo, crescimento de bactérias pode ser avaliado pela turvação (cor) do meio. Preparo em tubo de ensaio. Ex. Caldo nutriente 5

6 Bactérias Classificação dos meios de cultura Quanto à finalidade: Meios gerais ou básicos => permitem o crescimento de um grande número de espécies bacterianas dentro de um grupo. Ex ágar nutriente para bactérias. Meios enriquecidos => adicionados de mmisturas complexas e naturais (leite, sangue, tecido animal/vegetal) que permite o crescimento de organismos mais exigentes. Ex. Ágar sangue para cultivo e isolamento de Neisseria, Streptococcus e Staphylococcus. Meios seletivos / diferenciais => a possuem composição ou condições que seleciona o tipo de organismo que vai crescer ali. Usados para isolamento e identificação. Ex. Meio Tarrozi para anaeróbios, meio SS para Salmonella, Mac Conkey para bactérias entéricas. Meios de enriquecimento => favorece o crescimento de um grupo em detrimento do outro. Adição de enxofre em amostras de solo, p. ex., favorece o crescimento de Thiobacillus (oxidação de metais). Meios de estocagem => mantém a viabilidade dos microrganismos por mais tempo. Tem diferentes tipos de nutrientes e açúcares de acordo com a velocidade de multiplicação desejada. Bactérias Curva de Crescimento Quando uma determinada bactéria é semeada em um meio de cultura propício, em condições controladas de laboratório (in vitro), ela sempre apresentará o seguinte padrão de crescimento: 6

7 Bactérias Curva de Crescimento Em condições experimentais, quando se inocula uma população bacteriana em um frasco contendo meio de cultura, o crescimento dessa população passa por quatro fases características, dependendo do ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador. Essas quatro fases estão representadas na figura: Bactérias Curva de Crescimento 1 - Fase lag: adaptação metabólica ao novo ambiente; 2 - Fase exponencial ou logarítmica: o número de células da população dobra a cada geração. 3 - Fase estacionária: crescimento diminui significativamente devido às condições limitantes do meio. Taxa de reprodução é muito próxima da taxa de morte. 4 - Fase de declínio: declínio exponencial do número de células; taxa de morte torna-se maior que a taxa de divisão

8 Bactérias Curva de Crescimento Fase lag: adaptação metabólica ao novo ambiente; o metabolismo celular está direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas condições ambientais encontradas pelas células. O número de indivíduos não aumenta nesta fase, podendo até mesmo decrescer. A fase lag durará o quanto for maiores as diferenças de composição do ambiente anterior. Fase exponencial ou logarítmica: o número de células da população dobra a cada geração. Esta taxa de crescimento não pode ser mantida indefinidamente em laboratório. Após um determinado período de crescimento exponencial, as condições ambientais tornam-se desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais, acúmulo de metabólitos tóxicos e limitação de espaço. A taxa de crescimento da população diminui e segue-se a fase estacionária. Fase estacionária: crescimento diminui significativamente devido às condições limitantes do meio. Taxa de reprodução é muito próxima da taxa de morte, o que mantém constante o número de células viáveis na população. A duração desta fase depende das condições ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis. Fase de declínio: fase de declínio exponencial do número de células viáveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. O número de células viáveis entra em declínio progressivo até a completa extinção da população. 8

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