Free Testosterone ELISA

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1 Instruções de Utilização Free Testosterone ELISA Ensaio imunoenzimático para o diagnóstico in-vitro para a determinação quantitativa do tesosterona livre na soro humano. DB C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. APLICAÇÕES Ensaio imunoenzimático para o diagnóstico in-vitro para a determinação quantitativa do tesosterona livre na soro humano. 2. SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO A testosterona, um esteróide C-19, é a hormona natural mais eficaz na família dos androgénios. Nos homens, é sobretudo produzida nas células de Leydig, nos testículos; apenas uma quantidade pequena é produzida no córtex supra-renal. De uma maneira geral, os homens adultos têm concentrações plasmáticas de testosterona 10 a 20 vezes mais elevadas do que as mulheres. Na circulação, a maior parte da testosterona está ligada a proteínas plasmáticas, tal como a globulina de ligação das hormonas sexuais (SHBG) e a albumina. A testosterona é responsável pelo desenvolvimento das características sexuais secundárias masculinas e os seus níveis são úteis para determinar os estados hipogonadais. Nas mulheres, encontram-se geralmente níveis elevados de testosterona na presença de hirsutismo e virilização, ovários poliquísticos, tumores nos ovários, tumores suprarrenais e hiperplasia da suprarrenal. Nos homens, os níveis elevados de testosterona estão associados a doenças da unidade hipotalâmica pituitária, tumores nos testículos, hiperplasia congénita da suprarrenal e cancro da próstata. Níveis baixos de testosterona podem ser encontrados em doentes com as seguintes doenças: hipopituitarismo, síndrome de Klinefelter, feminização testicular, Orquidectomia e Criptorquidia, defeitos enzimáticos e algumas doenças autoimunes. A testosterona circula no sangue ligada a três proteínas: Globulina ligada às hormonas sexuais (60-80%), albumina e globulina ligada a cortisol. Apenas cerca de 1-2% da testosterona total em circulação permanece não ligada ou livre. Muito embora continue sob investigação, a maioria dos investigadores aceita a determinação da testosterona livre como a medida da fração biologicamente ativa. Recomenda-se que as determinações da testosterona livre ultrapassem as influências causadas pelas variações nas proteínas de transporte na concentração total de testosterona. 3. PRINCÍPIO DO TESTE Imunoensaio enzimático (ELISA) em fase sólida baseado no princípio de competição. Uma quantidade indeterminada de antigénio presente na amostra e uma quantidade fixa de antigénio marcado com enzima competem pelos locais de ligação dos anticorpos que revestem os poços. Depois da incubação, os poços são lavados para parar a reacção de competição. Após a reacção do substrato, a intensidade da cor desenvolvida é inversamente proporcional à quantidade de antigénio na amostra. Os resultados das amostras podem ser determinados directamente usando a curva padrão. 4. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional. 2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo. 3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para reclamação. 4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes expirados. 5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis e óculos protectores sempre que necessário. 6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL: 7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos. 8. O pessoal de limpeza deve ser orientado pelos profissionais relativamente ao manuseamento de produtos e perigos potenciais. 9. Alguns reagentes contêm azida de sódio (NaN 3 ) como conservante. Em caso de contacto com os olhos ou pele, enxagúe imediatamente com água. A NaN 3 pode reagir com o chumbo e o cobre da canalização para formar azidas metálicas explosivas. Quando descartar os reagentes, enxagúe com grande volume de água para evitar a formação dos compostos. Version / 6

3 10. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram considerados não reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, não é possível excluir em absoluto a presença destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com potencialmente perigosos quer na sua utilização quer na sua eliminação. 5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 ºC. Mantenha-o longe do calor ou da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos nas secções correspondentes. A microplaca é estável até expirar a data de validade do kit, na embalagem aberta mas firmemente fechada, quando armazenada a 2-8 C. 6. RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS Soro Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. É possível utilizar NaN3, Proclin 300 ou timerosal como conservante. Amostras que apresentem turvação deverão ser centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria. Armazenamento: 2-8 C -20 C (Alíquotas) Estabilidade: 48 h > 1 mês 7. MATERIAIS FORNECIDOS Quantidade Símbolo Componente 1 x 12x8 MTP 1 x 15 ml ENZCONJ 1 x 6 x 1.0 ml CAL A-F 1 x 2 x 1.0 ml CONTROL x 19 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP Manter afastado do calor ou luz solar directa. Evitar congelar-descongelar repetidamente. Para envio, as amostras devem ser congeladas. Antes de pipetar, a amostra congelada deve atingir a temperatura ambiente lentamente e ser misturada suavemente. Não descongele as amostras em banho-maria a 37 C. Microplaca Tiras separáveis. Revestido com anticorpo anti-testosterona de ratinho (monoclonal). Conjugado Enzimático Pronto a usar. Contêm: Testosterona conjugado com HRP, estabilizantes. Padrão A-F 0; 0.4; 1.1;7.5; 25; 160 pg/ml Pronto a usar. Contêm: Testosterona, Soro humano, estabilizantes. Controlo 1+2 Pronto a usar. Contêm: Testosterona, Soro humano, estabilizantes. Solução de Substrato TMB Pronto a usar. Contêm: TMB, Tampão, estabilizantes. Solução de Paragem TMB Pronto a usar. 1 M H 2SO 4. 1 x 100 ml WASHBUF CONC Tampão de Lavagem Concentrado (10x) 8. MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS 1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 25; 50; 100; 150 e 250 µl 2. Vortex 3. Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente 4. Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático 5. Incubador, 37 C 6. Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 450 nm (comprimento de onda de referência nm) 7. Água bidestilada ou bi-destilada 8. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro Version / 6

4 9. NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO 1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize apenas pipetas e instrumentos calibrados. 2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar (18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar. Agite os reagentes sem formar espuma. 3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não reutilize poços/tubos ou reagentes. 4. Recomenda-se a determinação em duplicado das amostras de maneira a identificar potenciais erros de pipetagem. 5. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa. 6. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a pipetagem das soluções nos poços. 7. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços. 8. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante. 10. INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE Os conteúdos do kit para 96 determinações podem ser divididos em 3 séries separadas. Os volumes indicados em baixo são para uma experiência com todas tiras (96 determinações) Preparação de componentes liofilizados ou concentrados Diluir / Componente com Diluente Relação Observações Armazenamento Estabilidade dissolver Misturar 100 ml WASHBUF 900 ml agua bidest. 1: C 8 semanas energicamente Diluição de Amostras Pretratamento de amostras: nenhum As amostras cuja leitura seja superior a 160 pg/ml não devem ser diluídas. A diluição vai alterar o equilíbrio entre a testosterona livre e as proteínas séricas. Version / 6

5 11. PROCEDIMENTO DO ENSAIO 1. Pipetar 25 µl de cada Padrão, Controlo e amostra para os respectivos poços da microplaca. 2. Pipetar 100 µl de Conjugado Enzimático para cada poço. 3. Misture completamente durante 10 segundos. 4. Incubar 1 h à 37 C. 5. Lavar a placa 3 x com 250 µl de Tampão de Lavagem diluído. Remover o excesso de solução batendo com a placa invertida numa toalha de papel. 6. Pipetar 150 µl de Solução de Substrato TMB para cada poço. 7. Incubar min à 37 C. 8. Parar a reacção de substrato adicionando 50 µl de Solução Stop TMB a cada poço. Misturar rapidamente os conteúdos, agitando cuidadosamente a placa. A cor muda de azul para amarelo. 9. Medir a densidade óptica com um fotómetro a 450 nm (comprimento de onda de referência: nm) nos 15 min seguintes à pipetagem da Solução Stop. 12. CONTROLO DE QUALIDADE Os resultados do teste só são válidos se o teste tiver sido realizado de acordo com as instruções. Além disso, o utilizador deve cumprir estritamente as regras de BPL (Boas Práticas Laboratoriais) ou normas/leis equiparáveis. O utilizador e o laboratório devem ter um sistema validado para obter o diagnóstico, de acordo com as boas práticas laboratoriais (GLP). Todos os padrões devem estar dentro dos intervalos de aceitação definidos nas etiquetas e no Certificado de CQ. Se não cumprirem os critérios a série não é válida e deve ser repetida. Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados. Em caso de desvios os seguintes aspectos técnicos devem ser tidos em conta: datas de validade dos reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, dispositivos, condições de incubação e métodos de lavagem. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo dos xx, logarítmico), quer em papel gráfico semi-logarítmico quer usando um método computorizado. Uma boa curva é fornecida optando por interpolação cubic spline, ajustamento 4PL (4 parameter logistics) ou modelo logit-log. Para o cálculo da curva de calibração, deve usar cada sinal dos padrões (se um dos duplicados apresentar um valor claramente diferente do esperado pode ser omitido e o valor mais razoável pode ser usado). A concentração das amostras pode ser lida directamente a partir da curva de calibração. (OD) Free Testosterone ELISA Curva de Calibração Típica (Exemplo. Não usar para cálculos!) Padrão Testosterona (pg/dl) OD Média OD/OD max (%) A B C D E F pg/ml Version / 6

6 14. VALORES ESPERADOS Os resultados por si só não devem ser a única razão para qualquer acção terapêutica e deverão ser correlacionados com outras observações clínicas e testes de diagnóstico. Indivíduos aparentemente saudáveis apresentam os seguintes valores: Free Testosterone n Mediana 95% percentil Homens [pg/ml] Mulheres [pg/ml] Recomenda-se que cada laboratório estabeleça o seu próprio intervalo de normalidade. 15. LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO A recolha e armazenamento de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes. Para reactividade cruzadas, ver DESEMPENHO. Os seguintes componentes sanguíneos não têm um efeito significativo (+/- 20% do esperado nos resultados do teste até às concentrações descritas em baixo: Hemoglobina 5 mg/ml NaN % Bilirrubina 5 mg/ml ProClin % Triglicéridos 91 mg/ml Timerosal 0.01 % 16. DESEMPENHO Especificidade Analítica (Reactividade Cruzada) Sensibilidade Analítica (Limite de Detecção) Precisão Intra-Ensaio Inter-Ensaio Substância Testosterona (4-Androsten-17β-ol-3-one) 11β-Hydroxy-Testosterona (4-Androsten-11β,17β-diol-3-one) 11α-Hydroxy-Testosterona (4-Androsten-11α,17β-diol-3-one) Dihidrotestosterona (5α-Androstan-17ß-ol-3-one) Androstenediona (4-Androstene-3,17-dione) Metil-Testosterona (4-Androsten-17α-methyl-17ß-ol-3-one) Soro Reactividade Cruzada (%) pg/ml Média do Sinal (Padrão Zero) - 2SD Reactividade cruzada de outras substâncias testadas 0.1 % Soro pg/ml Média SD CV(%) n Comparação do método IBL-Assay = x r = n = 255 Version / 6

7 EFEITO DA GLOBULINA LIGADA ÀS HORMONAS SEXUAIS (SHBG) A finalidade deste estudo era investigar uma possível interferência causada pela ligação da SHBG à testosterona livre conjugada à peroxidase. Um pool de soro humano tratado com carvão vegetal foi contaminado precisamente com SHBG em concentrações que variavam de 6 a 200 µg/ml e foi testado com o Kit ELISA de Testosterona Livre Direta. SHBG adicionada (µg/ml) OD 450 nm B/B0 (%) Os resultados mostraram valores ligados entre % de B/B 0 (B 0 =soro não contaminado) mesmo a níveis de SHBG superiores ao normal (0,5-5 µg/ml). Em conclusão, os resultados mostraram que não havia influência significativa da SHBG no kit ELISA direto de testosterona livre direta. EFEITO DA ALBUMINA SÉRICA HUMANA (HSA) A finalidade deste estudo era investigar uma possível interferência da albumina sérica humana (HSA) no procedimento de teste. Foi adicionada HSA a três amostras de doentes em concentrações de 1,25, 2,5 e 5,0 g/dl. Todas as amostras foram testadas com o Kit ELISA de Testosterona Livre Direta e deram origem aos resultados seguintes: Amostra HSA adicionada (g/dl) Os resultados não demonstram influência significativa de HSA adicionada às três amostras de soro dos doentes. 17. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO 1. Andersen, O. M. (2003): Essential Role of the Apolipoprotein E Receptor 2 in Sperm Development. In Journal of Biological Chemistry 278 (26), pp , checked on 10/03/ Fritz, K. S.; McKean, A. J.; Nelson, J. C.; Wilcox, R. B. (2008): Analog based free testosterone test results linked to total testosterone concentrations, not free testosterone concentrations. In Clin Chem 54 (3), pp Nieschlag, E. (2005): Entwicklungsstand der hormonellen männlichen Kontrazeption. In Deutsches Ärzteblatt Selby, C. (1990): Sex hormone binding globulin: origin, function and clinical significance. In Ann. Clin. Biochem 27 (Pt 6), pp Swerdloff, R. S.; Wang, C. (2008): Free testosterone measurement by the analog displacement direct assay: old concerns and new evidence. In Clin Chem 54 (3), pp Vermeulen, A.; Stoïca, T.; Verdonck, L. (1971): The apparent free testosterone concentration, an index of androgenicity. In J. Clin. Endocrinol. Metab 33 (5), pp Wheeler, M. J. (1995): The determination of bio available testosterone. In Ann. Clin. Biochem 32 (Pt 4), pp Winters, S. J.; Kelley, D. E.; Goodpaster, B. (1998): The analog free testosterone assay: are the results in men clinically useful? In Clin. Chem 44 (10), pp Version / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /